2024糧油檢驗油脂定性試驗

2-的測定PAGEPAGE1動植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸組分的測定范圍本文件描述了動植物油脂的甘三酯分子2-位脂肪酸（β或內位）組分的測定方法。本方法適用于熔點低于50℃在酯交換反應開始后10分鐘內在50℃的反應混合物中變成液體的油脂。本方法不適于含有下列組分的油脂：——含有少于四個碳原子的脂肪酸；——含有多于二十二個碳原子的脂肪酸；——含有羥基脂肪酸（如：蓖麻油酸）。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5009.168-2016食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定GB5009.229食品安全國家標準食品中酸價的測定GB/T5524動植物油脂扦樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T15687動植物油脂試樣的制備術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。原理試樣中游離脂肪酸中和后，經柱層析凈化，用酶將甘三酯水解成2-單甘酯，經薄層層析（TLC）分離，用氣相色譜測定脂肪酸組分含量。試劑所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682要求的二級水。用于試樣凈化的試劑2-丙醇或乙醇：95%（體積分數(shù)）。30℃-60℃。2-丙醇：50%（體積分數(shù)）或乙醇：50%（體積分數(shù)）。氫氧化鈉溶液：0.5mol/L。酚酞溶液：1g100mL95%（體積分數(shù)）乙醇中。260℃2hⅠ級，保存在干燥器中。氮氣。用于甘三酯水解的試劑3?72700mg/L。固定化南極假絲酵母脂肪酶（CAL-B）Moesziomycesantarctica（Candidaantarctica，Pseudozymaantarctica）。儲存在干燥的冰箱里。注1：商品化的CAL-B包括：Novozym435（丹麥諾維信），IM-NE100(無錫蔚藍生物），LipaseCL‘Amano’IM（日本天野），CHIRAZYMEL-2C4（瑞士羅氏診斷）或其他同等的CAL-B脂肪酶。注2：PLU（PropylLaurateUnit）是月桂酸丙酯單位，對應于規(guī)定的標準條件下1分鐘內產生1μmol月桂酸丙酯所需的酶活性的量。注3：脂肪酶制劑的活性濃度由制造商說明。2-單甘酯的試劑乙醇：95%（體積分數(shù)）。30℃-60℃。丙酮。硅膠：含有粘合劑，用于薄層層析。展開劑：正己烷或石油醚+乙醚+98%甲酸=70+30+1。顯示劑：2’,7’-二氯熒光黃乙醇溶液（2’,7’-Dichlorofluorescein）：2g/L。100mL1滴1mol/L氫氧化鈉溶液使呈微堿性。2-單甘酯的試劑參見GB5009.168-2016的第3章。儀器用于試樣凈化的儀器30℃-40℃之間能恒溫控制。13mm400mm250mL氮吹儀：提供氮氣流。分液漏斗：500mL。圓底燒瓶：100mL。用于甘三酯水解的儀器玻璃離心管：10mL，帶有磨口玻璃塞。30-50℃±0.5℃150-180/振蕩。30-50℃±0.5℃。150–180/分速度攪拌。150-180/分速度攪拌。16-40μm。秒表。2-單甘酯的儀器200mm×200mm涂布器：用于制備薄層層析板。玻璃板：200mm×200mm。微量注射器：3μL/滴-4μL/滴。噴霧器：用于薄層層析板噴射顯示劑。微型刮鏟：用于刮下薄層層析板上單甘酯譜帶。6.3.7 103℃±2℃。254nm。圓底燒瓶：25mL，1m錐形瓶：250mL，帶有磨口玻璃塞。錐形瓶：50mL。干燥器：內有有效的干燥劑。2-單甘酯的儀器參見GB5009.168-2016的第4章。扦樣按照GB/T5524執(zhí)行。試樣制備按GB/T15687制備試樣。操作步驟試樣酸價的測定按GB5009.229測定試樣酸價。如果酸價不高于1.5mg/g，可按9.3直接通過氧化鋁層析柱凈化試樣；如果酸價高于1.5mg/g，先按9.2在有溶劑存在的情況下用氫氧化鈉中和，然后按9.3氧化鋁層析柱凈化試樣。氫氧化鈉中和將約10g的油樣溶解于100mL（6.1.5）50mL2-丙醇或乙醇（5.1.1），幾滴酚酞溶液（5.1.5），加入中和油樣游離脂肪酸所需的氫氧化鈉溶液（5.1.4）并超量0.5%50mL（粘液和不溶于水的物質）25mL-30mL的2-清洗中和油脂的正己烷或石油醚，直至酚酞的粉紅色消失為止。將溶液轉移到旋轉蒸發(fā)器（6.1.3）的底瓶中，在減壓條件下去除大部分正己烷或石油醚。減壓并通入氮氣流（5.1.7）、在30℃-40℃溫度下干燥油脂，直到溶劑完全除去為止。氧化鋁層析柱凈化試樣15g已活化的氧化鋁（5.1.6）與50mL正己烷或石油醚（5.1.2）制備成懸浮液，邊振動邊倒入層析1mm-2mm25mL油醚（5.1.2）溶解的5g油脂溶液，小心地倒入層析柱里，用100mL圓底燒瓶（6.1.6）收集從層析柱流出的洗滌液。水解甘三酯0.1g1.0g（5.2.1）（6.2.1）40-50℃的水浴鍋中，直到變?yōu)橐后w。440PLUCAL-B(5.2.2)，蓋上塞子，30℃150-180/3±3分鐘。也可以在恒溫水浴鍋中（6.2.3），采用磁性攪拌棒（6.2.4）或磁性攪拌盤（6.2.5）攪拌，攪150/30℃3±3注：在起草本標準時，440PLU固定化CAL-B相當于44mgNovozym435，44mgIM-NE100或72mgCHIRAZYMEL-2C4，或38mg脂肪酶CL'Amano'IM。中除去。反應混合物可在-20℃保存至分析。4400（PLU）的固定CAL-B脂肪酶(5.2.2)，同時確保在后續(xù)分離2-單甘酯和制備脂肪酸甲酯有足夠的樣品用于分析。2-單甘酯薄層板的制備用乙醇、正己烷或石油醚（5.3.2）和丙酮（5.3.3）小心清洗玻璃板為避免酰基轉移，硅膠板可用硼酸飽和處理。反應混合物應盡快進行薄板層析分離。外，事先把制備的薄層板放在展開槽中，用溶劑展開到薄層板的頂端加以清洗。2-單甘酯的分離用微量注射器（6.3.4）將試樣提取液（9.4.5）滴在距薄層板（9.5.1）底邊15mm的位置，使細滴組成連續(xù)帶。將薄層板放入展開槽（6.3.1），展開槽事先加有展開劑（5.3.5），并已達到飽和狀態(tài)。蓋上蓋子進行層析（層析溫度約2010mm處為止。在約20℃溫度的空氣中干燥薄層板，用噴霧器（6.3.5）將顯示劑（5.3.6）噴涂在薄層板上。在紫外光燈（6.3.8）下標出單甘酯的譜帶（Rf值約0.035），用微型刮鏟（6.3.6）刮下，要避免刮到起點線上的物質。在室溫下是液體的凈化試樣（9.3），收集的硅膠移入燒瓶（6.3.9），按9.6步驟進行操作。在室溫下是固體的凈化試樣（9.3），收集到的硅膠移入50mL錐形瓶（6.3.11），加15mL乙醚（5.2.1），充分搖動。把所有硅膠移入燒結玻璃過濾器（6.2.6），每次用15mL乙醚（5.2.1）沖洗過濾器（6.2.6），共三次。收集過濾液用旋轉蒸發(fā)器（6.1.2）除去乙醚至濾液體積為4mL-5mL，將其轉（5.1.7）甘酯的量應占該試樣量的10g/100g-30g/100g，否則要重新水解甘三酯（9.3）。2-單甘酯收集硅膠所獲得的單甘酯（或從硅膠中提取的單甘酯），按GB5009.168-2016的5.2.1.4制備脂肪酸甲酯。再按GB5009.168測定脂肪酸甲酯。結果表示計算出各種2-單甘酯占總2-單甘酯的比值，以質量分數(shù)表示。結果保留一位小數(shù)。精