慢病毒載體介導(dǎo)nanog基因修飾小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的開(kāi)題報(bào)告

慢病毒載體介導(dǎo)nanog基因修飾小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的開(kāi)題報(bào)告一、研究背景和意義干細(xì)胞的能力使其成為一個(gè)重要的候選治療方案，以治療各種疾病。近年來(lái)，體內(nèi)和外源性Nanog表達(dá)的調(diào)控已經(jīng)證明是維持干細(xì)胞功能的關(guān)鍵因素之一。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）有著在不同成體組織中分化的潛力，基因修飾BMSCs提供了一個(gè)潛在的治療選項(xiàng)，尤其是在干細(xì)胞治療癌癥方面。然而，傳統(tǒng)的外源DNA轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染和基因炮等技術(shù)對(duì)于干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染仍存在諸多問(wèn)題，如低轉(zhuǎn)化率，細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)等。慢病毒（LVs）具有在非增殖態(tài)和增殖態(tài)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的潛力。因此，LVs已被廣泛用于有效地傳遞外源基因并產(chǎn)生長(zhǎng)期的表達(dá)。近年來(lái)，慢病毒載體被用于BMSCs中的基因條形化應(yīng)用也被廣泛研究。因此，我們的研究旨在利用慢病毒載體將Nanog基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠BMSCs，尋求并評(píng)估這種技術(shù)對(duì)BMSCs擴(kuò)增能力和增殖能力的影響，為基于BMSCs轉(zhuǎn)基因治療的疾病治療提供新的策略和思路。二、研究計(jì)劃1.實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備小鼠BMSCs分離和培養(yǎng)；慢病毒載體構(gòu)建和制備；Nannog基因克隆、純化和驗(yàn)證；LysoTrackerRed和4',6-二氨基-2-苯并硫氧?（DAPI）染色劑；PCR，RT-PCR，西方印跡（WesternBlotting）技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和試劑。2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）構(gòu)建重組慢病毒載體在慢病毒表達(dá)載體之上，構(gòu)建Nanog基因表達(dá)載體（pLVX-Nanog）。將pLVX-Nanogwiththelentiviruspackagingplasmids分別轉(zhuǎn)染入Thelper293T細(xì)胞中，觀察日齊和慢病毒病毒包裝效率和病毒滴度。（2）BMSCs和慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)將自行培養(yǎng)后的BMSCs轉(zhuǎn)染pLVX-Nanog載體病毒，并采用熒光顯微鏡觀察BMSCs中的nanog基因表達(dá)情況。（3）評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效果在不同時(shí)間點(diǎn)后，采用PCR，免疫熒光（IF）和WesternBlot技術(shù)檢測(cè)BMSCs在體外的擴(kuò)增和增殖情況。利用LysoTrackerRed染色劑評(píng)估細(xì)胞內(nèi)組織誤差。三、預(yù)期結(jié)果本研究旨在評(píng)估慢病毒載體介導(dǎo)Nanog基因修飾對(duì)于小鼠BMSCs擴(kuò)增和增殖能力的影響，從而為治療基礎(chǔ)性疾病奠定基礎(chǔ)。本研究預(yù)計(jì)將提供以下結(jié)果：1.優(yōu)化生產(chǎn)和培養(yǎng)最優(yōu)質(zhì)的慢病毒載體，使其可以充分表達(dá)Nanog基因，并可在BMSCs中連接。2.將Nanog基因引入BMSCs并確定免疫熒光染色和PCR擴(kuò)增的效率。3.評(píng)估Nanog基因在BMSCs細(xì)胞擴(kuò)增和增殖中的表現(xiàn)，以及此過(guò)程中慢病毒載體的效力。4.研究Nanog基因?qū)MSCs的擴(kuò)增和增殖潛能的影響，為治療基礎(chǔ)性疾病提供新的策略。四、結(jié)論本研究將評(píng)估慢病毒載體介導(dǎo)Nanog基因修飾對(duì)小鼠BMSCs的擴(kuò)增和增殖能力的影響。預(yù)計(jì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證