細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

葉綠體的分離與熒光觀察

NO.1

實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^植物細(xì)胞葉綠體的分離,了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光,并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。

實(shí)驗(yàn)原理將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。

低速離心

中速離心

高速離心

超高速離心細(xì)胞勻漿細(xì)胞核仁細(xì)胞骨架大細(xì)胞器小細(xì)胞器核糖體大分子葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液中進(jìn)行,以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。因?yàn)槿~綠體有自發(fā)熒光，因此用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)用品材料新鮮菠菜。試劑0.35mol/L氯化鈉溶液，

0.01%吖啶橙(acridineorange)。器材(1)主要設(shè)備:普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡。(2)小型器材:燒杯,量筒,滴管,刻度離心管,紗布，無熒光載片和蓋片。

實(shí)驗(yàn)方法一、葉綠體的分離與觀察1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。2.低速勻漿3~5min。3.將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。4.每組取濾液4ml，1000r/min下離心2min，棄去沉淀。5.將上清液在3000r/min下離心5min，棄去上清液，沉淀即含葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。6.將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。7.取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。(1)在普通光鏡下觀察。(2)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光。(3)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光：取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料,加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。

實(shí)驗(yàn)方法二、菠菜葉手撕片觀察輕輕撕取新鮮嫩菠菜葉的表皮，展平置于載玻片上，滴加1~2滴0.35mol/LNaCl溶液，加蓋片后置顯微鏡下觀察。(1)在普通光鏡下觀察。(2)在熒光顯微鏡下觀察其直接熒光。(3)觀察其間接熒光：向所制手撕片上滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液,加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察其間接熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、葉綠體的分離和觀察二、菠菜葉手撕片觀察

作業(yè)1.在熒光顯微鏡下，觀察葉綠體的自發(fā)熒光時(shí)，更換濾鏡系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化？2.游離葉綠體和整體細(xì)胞內(nèi)的葉綠體，在熒光顯微鏡下，其顏色和強(qiáng)度有無差異？為什么？實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；2.學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理

2.

詹納斯綠B1.活體染色體內(nèi)活染體外活染3.中性紅實(shí)驗(yàn)用品1.材料：人口腔上皮細(xì)胞，黃豆幼根根尖。2.試劑：Ringer溶液1/3000中性紅溶液1/5000詹納斯綠B溶液3.器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。實(shí)驗(yàn)方法1.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察(1)取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液。(2)實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。(3)在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)方法2.黃豆根尖細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察(1)實(shí)驗(yàn)前，把黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根伸長到1cm以上。(2)用雙面刀片把初生的小麥或黃豆幼苗根尖(約1~2cm長)小心切一縱切面，放入載玻片中內(nèi)的1/3000中性紅染液滴中，染色5~10min。(3)吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。(4)進(jìn)行鏡檢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的光鏡觀察。

2.黃豆根尖細(xì)胞液泡系的光鏡觀察。概念：孚爾根反應(yīng)是顯示DNA的最典型的組織化學(xué)反應(yīng)，是Feulgen和Rossenbeck在1942年首次發(fā)明出來的，簡(jiǎn)稱Feulgen法。廣泛用作特異顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的分布。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉并掌握孚爾根反應(yīng)的原理及其實(shí)驗(yàn)操作方法2.對(duì)細(xì)胞的組織化學(xué)研究方法有一初步的認(rèn)識(shí)二、實(shí)驗(yàn)原理1.

DNA在稀HCl作用下水解，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，核糖一端的醛基被暴露。2.希夫試劑(Schiff試劑,脫色堿性品紅)中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子，醌基為發(fā)色團(tuán)，呈現(xiàn)出紫紅色。

(實(shí)質(zhì)：醛基與將無色品紅還原為紫紅色化合物）

三、實(shí)驗(yàn)材料、器具和藥品

1.用carnoy固定液固定的魚肝臟切片；

carnoy液：（純酒精：冰醋酸：氯仿＝6:1:3)2.顯微鏡、恒溫水浴鍋、溫度計(jì)、鑷子、香柏油，擦鏡紙，蓋玻片；3.Schiff試劑、1mol/L鹽酸、1%亮綠、酒精、二甲苯、亞硫酸水（洗滌劑）:在200ml蒸餾水中，加入10ml1NHCl和10ml

10%偏亞硫酸氫鈉水溶液（或1.0g固體）。此液在臨用前配制。

四、實(shí)驗(yàn)步驟1、取材和固定：取材要小，一般以2-3mm的厚度為宜，固定劑通常用Carnoy溶液，固定后放4℃冰箱中4-6小時(shí)。2、脫水：依次經(jīng)過95%酒精兩次(每次20-30min);100%酒精兩次(分別用30min、40min)。3、制片二甲苯透明，石蠟包埋，切片6-7μm，明膠貼片，烘干。在貼片時(shí)應(yīng)加入1-2滴10%甲醛予以固定，否則很易脫片。4、脫蠟（本次實(shí)驗(yàn)開始）將制片經(jīng)二甲苯Ⅰ（20min）和二甲苯Ⅱ（10min）將石蠟脫凈，再經(jīng)過100%，95%，85%，70%，50%，30%的酒精各8~10min,最后放入蒸餾水中5~10min。5、水解先將制片放入一盛有1mol/LHCL的染色缸中清洗，然后將載玻片放入已溫浴至60℃的1mol/LHCL溶液中水解8分鐘，水解后很快將標(biāo)本取出，放入室溫1mol/LHCL溶液中。

注意：水解是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。重要的是溫度，應(yīng)保持在60±0.5℃之間。如果溫度過高或時(shí)間過長，造成水解過度，糖與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中，不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。6、水洗用蒸餾水沖洗3次，使水解停止。7、染色將標(biāo)本放入Schiff試劑中染色0.5~1.5小時(shí)，不可在載玻片片上直接染色。通常動(dòng)物組織要染1~2小時(shí)，植物組織要染2~3小時(shí)。8、洗滌在染色缸中用亞硫酸水洗3~5次，每次洗2~3min以洗去多余的非特異性色素及擴(kuò)散的染料。9、水洗流水沖洗5min，再用蒸餾水洗片刻。10、復(fù)染用1%亮綠復(fù)染數(shù)秒鐘

注意：時(shí)間切忌過長，以免染色過深，影響對(duì)DNA的觀察。

11、水洗、脫水與封片用蒸餾水洗兩次，每次5min，再經(jīng)過30%，50%，70%，85%，95%，100%（Ⅰ），100%（Ⅱ）的酒精各3~5分鐘；二甲苯透明Ⅰ和Ⅱ，各8~10min。中性加拿大樹膠封片。12鏡檢五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞核中的DNA呈鮮亮的紫紅色反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)被亮綠復(fù)染成綠色，核仁通常為負(fù)反應(yīng)。

-反映出DNA存在的部位

-從顏色反應(yīng)的深淺，可以判斷DNA的相對(duì)含量。注意：－設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)：對(duì)照切片不經(jīng)水解或…。分辨力(resolution)：指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用相鄰兩點(diǎn)間的距離(D)來表示。一、電子顯微鏡出現(xiàn)的必然性光源的波長鏡口率(N.A.)1.分辨力可見光波長為400~700nm(平均550nm)取決于鏡口角和物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率

波長：鏡口率(N.A.)的大?。虹R口角物鏡與標(biāo)本之間介質(zhì)的折射率空氣的折射率為1水為1.33香柏油為1.515

-溴萘為1.66

紫外光顯微鏡：0.1

m光鏡分辨力的最小數(shù)值：≤0.2

m一般光鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)為1,000~1,500

光學(xué)分辨率的極限！有效放大：指本來用肉眼看不清楚的物體經(jīng)顯微鏡放大成像后可以分辨清楚的放大指本來用肉眼能看清楚的物體經(jīng)放大鏡、幻燈機(jī)或投影儀等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。無效放大：各種光與電子束的波長比較名稱 波長(nm)可見光 760~390紫外光 390~13X-射線 13~0.05

-射線 1~0.005電子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比：

1

V電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的異同點(diǎn)

1,000,0001,000放大倍數(shù)0.1nm0.2~0.1

m分辨力電聚焦機(jī)械聚焦聚焦方式電磁透鏡光學(xué)透鏡透鏡真空空氣介質(zhì)短：0.003~0.008長：200~750波長(nm)電子束光束照射光電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡2.電鏡與光鏡的對(duì)比電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)的對(duì)比圖解

二、電鏡的分類根據(jù)電子束和樣品之間作用方式的不同，可將電鏡分為4大類:1)物體透射電子2)物體發(fā)射電子3)物體反射電子4)物體吸收電子透射電鏡掃描電鏡觀察和分析樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察和分析樣品的表面立體形貌三、透射式電子顯微鏡真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)電子照明系統(tǒng)成象系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)1、透射電鏡的結(jié)構(gòu)電子照明系統(tǒng)成象系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)透鏡系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)透射電鏡的結(jié)構(gòu)一般電鏡超高壓電鏡真空系統(tǒng)抽真空的意義：防止燈絲的氧化損傷；確保電子束在運(yùn)行過程中的運(yùn)動(dòng)軌跡不受空氣分子干擾；去除空氣分子對(duì)樣品的污染。

1.3

10-12Pa離子泵真空渦流泵機(jī)械泵：油擴(kuò)散泵：冷阱：真空管道、閥門、儲(chǔ)氣罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

1.3

10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系統(tǒng)的組成部件：真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)的組成部件及其作用：供電及保護(hù)系統(tǒng)高電壓低電流的高壓電源：產(chǎn)生高速電子低電壓高電流的透鏡電源：控制高速電子束的運(yùn)動(dòng)軌跡一般電鏡均擁有兩個(gè)電源：一旦電鏡的某一部分發(fā)生故障,電鏡的保護(hù)系統(tǒng)會(huì)讓其自動(dòng)緊急關(guān)機(jī)和斷電,以免損傷電鏡！穩(wěn)壓和穩(wěn)流裝置：保證電壓和電流的高度穩(wěn)定

保護(hù)與控制系統(tǒng)：電子照明系統(tǒng)的組成部件及其作用：電子照明系統(tǒng)電子槍：產(chǎn)生高壓電子束兩級(jí)聚光鏡：會(huì)聚高壓電子束，以得到極細(xì)而均勻的電子束流第一聚光鏡：將電子束的直徑縮小20~60倍第二聚光鏡：將電子束的直徑擴(kuò)大1~2倍第二聚光鏡放大第一聚光鏡縮小高壓(V)高壓電子束燈絲柵板陽極電子槍成象系統(tǒng)的組成部件及其作用：成象系統(tǒng)樣品室成像與放大裝置冷阱樣品放置室液氮罐金屬導(dǎo)桿放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物鏡中間鏡I中間鏡II投影鏡吸附樣品室中的少量空氣分子以提高真空度降低溫度可防止電子的熱漂移銅網(wǎng)樣品觀察記錄系統(tǒng)的組成部件及其作用：觀察記錄系統(tǒng)注意：電鏡照相與普通照相不同，圖像的反襯度最低時(shí)才是正聚焦；且底片還必須要經(jīng)過預(yù)干燥處理觀察室放大鏡照相裝置透過樣品的電子打到熒光屏上可顯示出反映樣品真實(shí)結(jié)構(gòu)的圖像保護(hù)眼睛熒光屏鉛玻璃窗用于放大投到熒光屏上的圖像電子形成的熒光圖像衰減速度很快，一旦觀察到理想的結(jié)構(gòu)圖像就需要盡快照相2、透射電鏡的成像原理獲得高分辨率的圖像：數(shù)百萬倍使用電子槍發(fā)射出了波長極短的電子波利用電磁透鏡可對(duì)電子束進(jìn)行聚焦、放大和成像高速電子束 透射樣品電能轉(zhuǎn)變成光能圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)高壓電子槍高速電子束電磁透鏡樣品電子束發(fā)生投射熒光屏濃淡不同的圖像成像原理：透射電鏡照片演示微管蛋白的免疫熒光照片一個(gè)植物細(xì)胞的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)透射電鏡照片演示糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的透射電鏡照片透射電鏡照片演示多核糖體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示玉米分散高爾基體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示線粒體的透射電鏡照片葉綠體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示細(xì)胞核的透射電鏡照片有絲分裂器的透射電鏡照片凋亡細(xì)胞正在殺腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞透射電鏡照片演示

-輔肌動(dòng)蛋白熱休克蛋白Hsp60籠形蛋白透射電鏡照片演示金的原子布陣的透射電鏡照片透射電鏡照片演示T4噬菌體負(fù)染色的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同與樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)相反透射電鏡照片演示螺原體驅(qū)動(dòng)蛋白核纖層蛋白纖毛動(dòng)力蛋白胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在透射電鏡中，被觀察粒子的大小一定要大于電子束的波長才能被分辨出來；否則，電子束就會(huì)發(fā)生繞射，無法看到粒子！掃描電鏡透射電鏡

光鏡肉眼玻璃透鏡(目鏡)投影鏡玻璃透鏡(物鏡)樣品玻璃透鏡(聚光鏡)光源(鹵燈或汞燈)高壓電子槍樣品電磁透鏡束偏轉(zhuǎn)器圖像投到視屏上熒光屏光鏡、透射電鏡及掃描電鏡的成像光路圖解四、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與成像原理1.掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理及顯示系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)等掃描電鏡電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)顯示系統(tǒng)(顯象管)(1~10KV)電子槍燈絲電磁透鏡探測(cè)器電磁透鏡掃描線圈的束偏轉(zhuǎn)器樣品托樣品顯象管電子光學(xué)系統(tǒng)掃描電鏡的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖2.掃描電鏡的成像原理電子槍接受、轉(zhuǎn)變成光子放大、轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)電子束電磁透鏡樣品表面掃描線圈次級(jí)電子信號(hào)探測(cè)器光電倍增管顯象管/熒光屏樣品表面上相應(yīng)點(diǎn)所發(fā)出的次級(jí)電子數(shù)熒光點(diǎn)的亮度電子槍燈絲電磁透鏡探測(cè)器電磁透鏡掃描線圈的束偏轉(zhuǎn)器樣品托樣品顯象管次級(jí)電子掃描電鏡成像原理的簡(jiǎn)單圖示(1)

掃描電鏡所用樣品的制備方法簡(jiǎn)便(固定、干燥和噴金)，不需經(jīng)過超薄切片；(2)

掃描電鏡采用的是次級(jí)電子成像；(3)

掃描電鏡所觀察到圖像景深長，圖像富有立體感；(4)

圖像的放大倍率在很大范圍內(nèi)連續(xù)可變(101~105×)；(5)

樣品的輻射損傷及污染程度小等。掃描電鏡在結(jié)構(gòu)和工作原理上的特點(diǎn)：(1)

分辨率還不夠高(1~10nm)；(2)

只能顯示樣品的表面形貌，無法顯示內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)?？捎^察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；可觀察到富有立體感的圖像；提高了分辨率。掃描電鏡的局限性：冰凍蝕刻技術(shù)(freezeetching)：利用“復(fù)膜(replica)”在透射電鏡下觀察：掃描電鏡照片演示人耳聽毛細(xì)胞的掃描電鏡照片掃描電鏡照片演示人RBC的掃描電鏡照片有被小泡的掃描電鏡照片轉(zhuǎn)化細(xì)胞掃描電鏡照片演示細(xì)胞褶皺的掃描電鏡照片分裂溝的掃描電鏡照片掃描電鏡照片演示冰凍蝕刻電鏡照片演示細(xì)胞質(zhì)膜的冰凍蝕刻電鏡照片冰凍蝕刻電鏡照片演示實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰庖呒?xì)胞化學(xué)染色的基本原理和步驟；對(duì)成籠蛋白有被小泡在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)和分布有直觀認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)原理真核細(xì)胞中的有被小泡是參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾蓡T，按照衣被成分的不同，有被小泡可以分為成籠蛋白有被小泡、COPⅠ被小泡和COPⅡ被小泡等不同類型。免疫細(xì)胞化學(xué)是將免疫學(xué)基本原理與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合所建立起來的新技術(shù)，根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)在分析有機(jī)體、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平上特定分子的定位及相互聯(lián)系時(shí)是一個(gè)有力的工具，在細(xì)胞生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。它利用了抗原與抗體之間特異性結(jié)合的性質(zhì)，即某種抗體僅能與刺激其產(chǎn)生的抗原物質(zhì)結(jié)合，故當(dāng)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)時(shí)，可用已知抗體去追蹤和鑒定未知的抗原。一般而言，發(fā)生在固定組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)是不可見的，但如將熒光素、酶等標(biāo)記在抗體分子上，就能憑借熒光或酶與底物的顏色反應(yīng)在某一部位的有無，來判斷是否發(fā)生了特異的抗原抗體反應(yīng)及研究抗原物質(zhì)的定位。標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合方式主要有兩種：①直接法；②間接法：間接法較直接法的敏感性大為增高，故應(yīng)用更為廣泛。間接法中較常用的有熒光標(biāo)記法、過氧化物酶標(biāo)記法等。本實(shí)驗(yàn)所用的即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，然后用DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺)作為辣根過氧化物酶的作用底物來顯色抗原存在部位，可見棕黃色產(chǎn)物。

抗原第1抗體酶第2抗體底物有色產(chǎn)物技術(shù)原理：1.細(xì)胞培養(yǎng)在HeLa細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，將消毒的蓋玻片條放入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞密度達(dá)70-80%時(shí)，可取出蓋玻片進(jìn)行染色。

將長有細(xì)胞的蓋玻片放入盛有PBS的小培養(yǎng)皿中漂洗，以洗去培養(yǎng)液。2.固定棄去PBS液，加入含3.7%甲醛的PBS溶液3ml，固定10分鐘。用PBS洗2次，每次10分鐘。實(shí)驗(yàn)方法3.透化吸去多余PBS，用0.5%的TritonX－100透化處理10分鐘。用PBS洗2次，每次10分鐘。加入含1％BSA的PBS溶液3ml，室溫溫育10分鐘（BSA用來封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)）。4.加入一抗將蓋片有細(xì)胞的一面向上，水平地放入培養(yǎng)皿中，加稀釋好的第一抗體液（3mlPBS中加入30μl），蓋好培養(yǎng)皿，平穩(wěn)地放入37℃溫箱中溫育30分鐘。取出蓋片，放入盛有含0.1%吐溫20的PBS的培養(yǎng)皿中室溫洗2次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的抗體。5.加入二抗將蓋片放入培養(yǎng)皿，加稀釋好的第二抗體（3mlPBS中加入15μl），在37℃溫箱中溫育30分鐘。取出蓋片，放入盛有含0.1%吐溫20的PBS的培養(yǎng)皿A中室溫洗2次，每次10分鐘。6.染色染色10分鐘：3mlPBS+3滴A液+3滴B液+3滴C液。滴一滴50％甘油－PBS混合液于載玻片上，將蓋片有細(xì)胞的一面向下進(jìn)行封片，防止產(chǎn)生氣泡。7.觀察將制好的片子放在顯微鏡下觀察。分辨力(resolution)：指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用相鄰兩點(diǎn)間的距離(D)來表示。一、電子顯微鏡出現(xiàn)的必然性光源的波長鏡口率(N.A.)1.分辨力可見光波長為400~700nm(平均550nm)取決于鏡口角和物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率

波長：鏡口率(N.A.)的大?。虹R口角物鏡與標(biāo)本之間介質(zhì)的折射率空氣的折射率為1水為1.33香柏油為1.515

-溴萘為1.66

紫外光顯微鏡：0.1

m光鏡分辨力的最小數(shù)值：≤0.2

m一般光鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)為1,000~1,500

光學(xué)分辨率的極限！有效放大：指本來用肉眼看不清楚的物體經(jīng)顯微鏡放大成像后可以分辨清楚的放大指本來用肉眼能看清楚的物體經(jīng)放大鏡、幻燈機(jī)或投影儀等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。無效放大：各種光與電子束的波長比較名稱 波長(nm)可見光 760~390紫外光 390~13X-射線 13~0.05

-射線 1~0.005電子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比：

1

V電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的異同點(diǎn)

1,000,0001,000放大倍數(shù)0.1nm0.2~0.1

m分辨力電聚焦機(jī)械聚焦聚焦方式電磁透鏡光學(xué)透鏡透鏡真空空氣介質(zhì)短：0.003~0.008長：200~750波長(nm)電子束光束照射光電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡2.電鏡與光鏡的對(duì)比電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)的對(duì)比圖解

二、電鏡的分類根據(jù)電子束和樣品之間作用方式的不同，可將電鏡分為4大類:1)物體透射電子2)物體發(fā)射電子3)物體反射電子4)物體吸收電子透射電鏡掃描電鏡觀察和分析樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察和分析樣品的表面立體形貌三、透射式電子顯微鏡真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)電子照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)1、透射電鏡的結(jié)構(gòu)電子照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)透鏡系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)透射電鏡的結(jié)構(gòu)一般電鏡超高壓電鏡真空系統(tǒng)抽真空的意義：防止燈絲的氧化損傷；確保電子束在運(yùn)行過程中的運(yùn)動(dòng)軌跡不受空氣分子干擾；去除空氣分子對(duì)樣品的污染。

1.3

10-12Pa離子泵真空渦流泵機(jī)械泵：油擴(kuò)散泵：冷阱：真空管道、閥門、儲(chǔ)氣罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

1.3

10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系統(tǒng)的組成部件：真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)的組成部件及其作用：供電及保護(hù)系統(tǒng)高電壓低電流的高壓電源：產(chǎn)生高速電子低電壓高電流的透鏡電源：控制高速電子束的運(yùn)動(dòng)軌跡一般電鏡均擁有兩個(gè)電源：一旦電鏡的某一部分發(fā)生故障,電鏡的保護(hù)系統(tǒng)會(huì)讓其自動(dòng)緊急關(guān)機(jī)和斷電,以免損傷電鏡！穩(wěn)壓和穩(wěn)流裝置：保證電壓和電流的高度穩(wěn)定

保護(hù)與控制系統(tǒng)：電子照明系統(tǒng)的組成部件及其作用：電子照明系統(tǒng)電子槍：產(chǎn)生高壓電子束兩級(jí)聚光鏡：會(huì)聚高壓電子束，以得到極細(xì)而均勻的電子束流第一聚光鏡：將電子束的直徑縮小20~60倍第二聚光鏡：將電子束的直徑擴(kuò)大1~2倍第二聚光鏡放大第一聚光鏡縮小高壓(V)高壓電子束燈絲柵板陽極電子槍成像系統(tǒng)的組成部件及其作用：成象系統(tǒng)樣品室成像與放大裝置冷阱樣品放置室液氮罐金屬導(dǎo)桿放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物鏡中間鏡I中間鏡II投影鏡吸附樣品室中的少量空氣分子以提高真空度降低溫度可防止電子的熱漂移銅網(wǎng)樣品觀察記錄系統(tǒng)的組成部件及其作用：觀察記錄系統(tǒng)注意：電鏡照相與普通照相不同，圖像的反襯度最低時(shí)才是正聚焦；且底片還必須要經(jīng)過預(yù)干燥處理觀察室放大鏡照相裝置透過樣品的電子打到熒光屏上可顯示出反映樣品真實(shí)結(jié)構(gòu)的圖像保護(hù)眼睛熒光屏鉛玻璃窗用于放大投到熒光屏上的圖像電子形成的熒光圖像衰減速度很快，一旦觀察到理想的結(jié)構(gòu)圖像就需要盡快照相2、透射電鏡的成像原理獲得高分辨率的圖像：數(shù)百萬倍使用電子槍發(fā)射出了波長極短的電子波利用電磁透鏡可對(duì)電子束進(jìn)行聚焦、放大和成像高速電子束 透射樣品電能轉(zhuǎn)變成光能圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)高壓電子槍高速電子束電磁透鏡樣品電子束發(fā)生投射熒光屏濃淡不同的圖像成像原理：一個(gè)植物細(xì)胞的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)透射電鏡照片演示糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的透射電鏡照片透射電鏡照片演示多核糖體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示線粒體的透射電鏡照片葉綠體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示細(xì)胞核的透射電鏡照片有絲分裂器的透射電鏡照片凋亡細(xì)胞正在殺腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞透射電鏡照片演示

-輔肌動(dòng)蛋白熱休克蛋白Hsp60籠形蛋白透射電鏡照片演示T4噬菌體負(fù)染色的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同與樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)相反透射電鏡照片演示螺原體驅(qū)動(dòng)蛋白核纖層蛋白纖毛動(dòng)力蛋白胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在透射電鏡中，被觀察粒子的大小一定要大于電子束的波長才能被分辨出來；否則，電子束就會(huì)發(fā)生繞射，無法看到粒子！掃描電鏡透射電鏡

光鏡肉眼玻璃透鏡(目鏡)投影鏡玻璃透鏡(物鏡)樣品玻璃透鏡(聚光鏡)光源(鹵燈或汞燈)高壓電子槍樣品電磁透鏡束偏轉(zhuǎn)器圖像投到視屏上熒光屏光鏡、透射電鏡及掃描電鏡的成像光路圖解四、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與成像原理1.掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理及顯示系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)等掃描電鏡電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)顯示系統(tǒng)(顯象管)(1~10KV)電子槍燈絲電磁透鏡探測(cè)器電磁透鏡掃描線圈的束偏轉(zhuǎn)器樣品托樣品顯象管電子光學(xué)系統(tǒng)掃描電鏡的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖2.掃描電鏡的成像原理電子槍接受、轉(zhuǎn)變成光子放大、轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)電子束電磁透鏡樣品表面掃描線圈次級(jí)電子信號(hào)探測(cè)器光電倍增管顯象管/熒光屏樣品表面上相應(yīng)點(diǎn)所發(fā)出的次級(jí)電子數(shù)熒光點(diǎn)的亮度(1)

掃描電鏡所用樣品的制備方法簡(jiǎn)便(固定、干燥和噴金)，不需經(jīng)過超薄切片；(2)

掃描電鏡采用的是次級(jí)電子成像；(3)

掃描電鏡所觀察到圖像景深長，圖像富有立體感；(4)

圖像的放大倍率在很大范圍內(nèi)連續(xù)可變(101~105×)；(5)

樣品的輻射損傷及污染程度小等。掃描電鏡在結(jié)構(gòu)和工作原理上的特點(diǎn)：掃描電鏡照片演示人耳聽毛細(xì)胞的掃描電鏡照片掃描電鏡照片演示人RBC的掃描電鏡照片有被小泡的掃描電鏡照片轉(zhuǎn)化細(xì)胞掃描電鏡照片演示細(xì)胞褶皺分裂溝掃描電鏡照片演示精子細(xì)胞和卵細(xì)胞捕殺酵母細(xì)胞的吞噬白細(xì)胞(1)

分辨率還不夠高(1~10nm)；(2)

只能顯示樣品的表面形貌，無法顯示內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)?？捎^察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；可觀察到富有立體感的圖像；提高了分辨率。掃描電鏡的局限性：冰凍蝕刻技術(shù)(freezeetching)：利用“復(fù)膜(replica)”在透射電鏡下觀察：冰凍蝕刻電鏡照片演示細(xì)胞質(zhì)膜的冰凍蝕刻電鏡照片冰凍蝕刻電鏡照片演示分辨力(resolution)：指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力,通常是用相鄰兩點(diǎn)間的距離(D)來表示。一、電子顯微鏡出現(xiàn)的必然性光源的波長鏡口率(N.A.)1.分辨力可見光波長為400~700nm(平均550nm)取決于鏡口角和物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率

波長：鏡口率(N.A.)的大小：鏡口角物鏡與標(biāo)本之間介質(zhì)的折射率空氣的折射率為1水為1.33香柏油為1.515

-溴萘為1.66

紫外光顯微鏡：0.1

m光鏡分辨力的最小數(shù)值：≤0.2

m一般光鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)為1,000~1,500

光學(xué)分辨率的極限！有效放大：指本來用肉眼看不清楚的物體經(jīng)顯微鏡放大成像后可以分辨清楚的放大指本來用肉眼能看清楚的物體經(jīng)放大鏡、幻燈機(jī)或投影儀等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。無效放大：各種光與電子束的波長比較名稱 波長(nm)可見光 760~390紫外光 390~13X-射線 13~0.05

-射線 1~0.005電子束

100V 0.12310,000V 0.0122100,000V 0.00387電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比：

1

V電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的異同點(diǎn)

1,000,0001,000放大倍數(shù)0.1nm0.2~0.1

m分辨力電聚焦機(jī)械聚焦聚焦方式電磁透鏡光學(xué)透鏡透鏡真空空氣介質(zhì)短：0.003~0.008長：200~750波長(nm)電子束光束照射光電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡2.電鏡與光鏡的對(duì)比電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)的對(duì)比圖解

二、電鏡的分類根據(jù)電子束和樣品之間作用方式的不同，可將電鏡分為4大類:1)物體透射電子2)物體發(fā)射電子3)物體反射電子4)物體吸收電子透射電鏡掃描電鏡觀察和分析樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察和分析樣品的表面立體形貌三、透射式電子顯微鏡真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)電子照明系統(tǒng)成象系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)1、透射電鏡的結(jié)構(gòu)電子照明系統(tǒng)成象系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)透鏡系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)透射電鏡的結(jié)構(gòu)一般電鏡超高壓電鏡真空系統(tǒng)抽真空的意義：防止燈絲的氧化損傷；確保電子束在運(yùn)行過程中的運(yùn)動(dòng)軌跡不受空氣分子干擾；去除空氣分子對(duì)樣品的污染。

1.3

10-12Pa離子泵真空渦流泵機(jī)械泵：油擴(kuò)散泵：冷阱：真空管道、閥門、儲(chǔ)氣罐等1Pa

1.3

10-5~10-6Pa;1.3

10-6Pa

1.3

10-7~10-9Pa1.3

10-9Pa

1.3

10-10Pa真空系統(tǒng)的組成部件：真空系統(tǒng)供電及保護(hù)系統(tǒng)的組成部件及其作用：供電及保護(hù)系統(tǒng)高電壓低電流的高壓電源：產(chǎn)生高速電子低電壓高電流的透鏡電源：控制高速電子束的運(yùn)動(dòng)軌跡一般電鏡均擁有兩個(gè)電源：一旦電鏡的某一部分發(fā)生故障,電鏡的保護(hù)系統(tǒng)會(huì)讓其自動(dòng)緊急關(guān)機(jī)和斷電,以免損傷電鏡！穩(wěn)壓和穩(wěn)流裝置：保證電壓和電流的高度穩(wěn)定

保護(hù)與控制系統(tǒng)：電子照明系統(tǒng)的組成部件及其作用：電子照明系統(tǒng)電子槍：產(chǎn)生高壓電子束兩級(jí)聚光鏡：會(huì)聚高壓電子束，以得到極細(xì)而均勻的電子束流第一聚光鏡：將電子束的直徑縮小20~60倍第二聚光鏡：將電子束的直徑擴(kuò)大1~2倍第二聚光鏡放大第一聚光鏡縮小高壓(V)高壓電子束燈絲柵板陽極電子槍成象系統(tǒng)的組成部件及其作用：成象系統(tǒng)樣品室成像與放大裝置冷阱樣品放置室液氮罐金屬導(dǎo)桿放大50倍放大3倍放大15倍放大200倍500,000倍物鏡中間鏡I中間鏡II投影鏡吸附樣品室中的少量空氣分子以提高真空度降低溫度可防止電子的熱漂移銅網(wǎng)樣品觀察記錄系統(tǒng)的組成部件及其作用：觀察記錄系統(tǒng)注意：電鏡照相與普通照相不同，圖像的反襯度最低時(shí)才是正聚焦；且底片還必須要經(jīng)過預(yù)干燥處理觀察室放大鏡照相裝置透過樣品的電子打到熒光屏上可顯示出反映樣品真實(shí)結(jié)構(gòu)的圖像保護(hù)眼睛熒光屏鉛玻璃窗用于放大投到熒光屏上的圖像電子形成的熒光圖像衰減速度很快，一旦觀察到理想的結(jié)構(gòu)圖像就需要盡快照相2、透射電鏡的成像原理獲得高分辨率的圖像：數(shù)百萬倍使用電子槍發(fā)射出了波長極短的電子波利用電磁透鏡可對(duì)電子束進(jìn)行聚焦、放大和成像高速電子束 透射樣品電能轉(zhuǎn)變成光能圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)高壓電子槍高速電子束電磁透鏡樣品電子束發(fā)生投射熒光屏濃淡不同的圖像成像原理：透射電鏡照片演示微管蛋白的免疫熒光照片一個(gè)植物細(xì)胞的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同真實(shí)反映了樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)透射電鏡照片演示糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的透射電鏡照片透射電鏡照片演示多核糖體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示玉米分散高爾基體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示線粒體的透射電鏡照片葉綠體的透射電鏡照片透射電鏡照片演示細(xì)胞核的透射電鏡照片有絲分裂器的透射電鏡照片凋亡細(xì)胞正在殺腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞透射電鏡照片演示

-輔肌動(dòng)蛋白熱休克蛋白Hsp60籠形蛋白透射電鏡照片演示金的原子布陣的透射電鏡照片透射電鏡照片演示T4噬菌體負(fù)染色的透射電鏡照片圖像各處濃淡的不同與樣品中不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)相反透射電鏡照片演示螺原體驅(qū)動(dòng)蛋白核纖層蛋白纖毛動(dòng)力蛋白胞質(zhì)動(dòng)力蛋白在透射電鏡中，被觀察粒子的大小一定要大于電子束的波長才能被分辨出來；否則，電子束就會(huì)發(fā)生繞射，無法看到粒子！掃描電鏡透射電鏡

光鏡肉眼玻璃透鏡(目鏡)投影鏡玻璃透鏡(物鏡)樣品玻璃透鏡(聚光鏡)光源(鹵燈或汞燈)高壓電子槍樣品電磁透鏡束偏轉(zhuǎn)器圖像投到視屏上熒光屏光鏡、透射電鏡及掃描電鏡的成像光路圖解四、掃描電鏡的結(jié)構(gòu)與成像原理1.掃描電鏡的基本結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理及顯示系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)等掃描電鏡電子槍電磁透鏡掃描線圈樣品室信號(hào)的收集處理系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電保護(hù)系統(tǒng)顯示系統(tǒng)(顯象管)(1~10KV)電子槍燈絲電磁透鏡探測(cè)器電磁透鏡掃描線圈的束偏轉(zhuǎn)器樣品托樣品顯象管電子光學(xué)系統(tǒng)掃描電鏡的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖2.掃描電鏡的成像原理電子槍接受、轉(zhuǎn)變成光子放大、轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)電子束電磁透鏡樣品表面掃描線圈次級(jí)電子信號(hào)探測(cè)器光電倍增管顯象管/熒光屏樣品表面上相應(yīng)點(diǎn)所發(fā)出的次級(jí)電子數(shù)熒光點(diǎn)的亮度電子槍燈絲電磁透鏡探測(cè)器電磁透鏡掃描線圈的束偏轉(zhuǎn)器樣品托樣品顯象管次級(jí)電子掃描電鏡成像原理的簡(jiǎn)單圖示(1)

掃描電鏡所用樣品的制備方法簡(jiǎn)便(固定、干燥和噴金)，不需經(jīng)過超薄切片；(2)

掃描電鏡采用的是次級(jí)電子成像；(3)

掃描電鏡所觀察到圖像景深長，圖像富有立體感；(4)

圖像的放大倍率在很大范圍內(nèi)連續(xù)可變(101~105×)；(5)

樣品的輻射損傷及污染程度小等。掃描電鏡在結(jié)構(gòu)和工作原理上的特點(diǎn)：(1)

分辨率還不夠高(1~10nm)；(2)

只能顯示樣品的表面形貌，無法顯示內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)?？捎^察到樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；可觀察到富有立體感的圖像；提高了分辨率。掃描電鏡的局限性：冰凍蝕刻技術(shù)(freezeetching)：利用“復(fù)膜(replica)”在透射電鏡下觀察：掃描電鏡照片演示人耳聽毛細(xì)胞的掃描電鏡照片掃描電鏡照片演示人RBC的掃描電鏡照片有被小泡的掃描電鏡照片轉(zhuǎn)化細(xì)胞掃描電鏡照片演示細(xì)胞褶皺的掃描電鏡照片分裂溝的掃描電鏡照片掃描電鏡照片演示冰凍蝕刻技術(shù)冰凍斷裂技術(shù)也是研究細(xì)胞內(nèi)部各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的有用手段。(freeze-etchingtechniques)亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)，是研究生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種有用的技術(shù)，關(guān)于膜結(jié)構(gòu)的許多資料即是利用這種方法取得的。①將標(biāo)本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低溫冰凍。

②然后用冰刀驟然將標(biāo)本沖斷開，升溫后冰在真空條件下迅即升華，暴露出了斷裂面結(jié)構(gòu)——蝕刻(etching)。蝕刻斷裂(2)冰凍蝕刻技術(shù)的操作步驟:

③蝕刻后，再向斷裂上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下，此膜即為復(fù)膜(replica)。復(fù)膜④復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，可置于透射電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)膜的冰凍蝕刻電鏡照片冰凍蝕刻電鏡照片演示實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩参锛?xì)胞骨架處理及染色方法。實(shí)驗(yàn)原理：用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮藍(lán)R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)試劑：1、M-緩沖液；2、pH6.8磷酸緩沖液；3、1%TritonX-100，用M-緩沖液配制；4、0.2%考馬斯亮蘭R250；5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液配制；實(shí)驗(yàn)步驟：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞約1cm2大小若干片，置于培養(yǎng)皿中，加入pH6.8磷酸緩沖液,沒過表皮即可，放置約1-2min；吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1%TritonX-100處理30min；吸去1%TritonX-100，用M-緩沖液洗3次，每次3min；3%戊二醛固定30min；pH6.8磷酸緩沖液洗3次，每次3min；0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色10min；用蒸餾水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪于載玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理與方法；2．觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。二實(shí)驗(yàn)原理采用差速離心分離細(xì)胞器：在等滲介質(zhì)中，組織勻漿液在不同的離心力和離心時(shí)間下，細(xì)胞器按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部。菠菜組織勻漿液在0.35mol.L-1氯化鈉溶液以3000r.min-1下離心5分鐘，沉淀即為葉綠體和部分細(xì)胞核；葉綠體具有熒光現(xiàn)象，可利用熒光顯微鏡觀察。菠菜葉富含葉綠體，可采用徒手切片觀察其形態(tài)和分布；三、實(shí)驗(yàn)用品1．器材離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、普通及熒光顯微鏡、天平、離心管、紗布、燒杯、量筒、滴管、載玻片、蓋玻片2．材料新鮮菠菜葉3．試劑0.35mol/L氯化鈉溶液四、實(shí)驗(yàn)方法（一）葉綠體的分離與觀察取新嫩菠菜葉，洗凈檫干、去梗，稱30g，分批放入勻漿器。加入0.35mol/L氯化鈉溶液，共150ml，5000r.min-1勻漿，制成勻漿；將勻漿用６層紗布過濾于燒杯中；取濾液４ml在1000r/min離心２min，取上清；上清液3000r/min離心５min．去上清，沉淀即為葉綠體；加0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮沉淀；取葉綠體懸液１滴于載玻片上，加蓋片：普通光鏡下觀察；熒光顯微鏡下演示（二）菠菜葉徒手切片觀察新嫩菠菜葉斜切面１片，0.35mol/L氯化鈉溶液１滴；加蓋片輕壓：光鏡下觀察葉綠體在表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞中的分布；熒光顯微鏡下演示。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1．簡(jiǎn)述：葉綠體的分離原理和方法；2．繪圖：菠菜葉肉細(xì)胞的形態(tài)，顯示葉綠體。實(shí)驗(yàn)二線粒體和液泡系的超活染色觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．觀察動(dòng)植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量和分布；2．了解一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)

二、實(shí)驗(yàn)原理詹納斯綠Ｂ可專一性地對(duì)對(duì)線粒體進(jìn)行活染,這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài)),呈藍(lán)綠色。

中性紅對(duì)液泡系的染色具有專一性，將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色。

三、實(shí)驗(yàn)用品1．器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、、剪刀、鑷子、解剖刀、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙2．試劑：Ringer液：氯化鈉8.5g（變溫動(dòng)物用6.5g）氯化鈣0.12g碳酸氫鈉0.20g氯化鉀0.14g磷酸氫二鈉0.01g葡萄糖2.0g加蒸餾水至1000ml1/5000詹納斯綠Ｂ1/3000中性紅3．材料：人口腔上皮細(xì)胞、黃豆幼根根尖四、實(shí)驗(yàn)方法（一）口腔上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察載玻片置于37℃

恒溫水浴鍋上，滴1/5000詹納斯綠Ｂ1-2滴；牙簽寬頭取口腔上皮細(xì)胞，放入載玻片的染液滴上，于３７℃恒溫染色10-15min，顯微鏡下觀察．

（二）綠豆幼根根尖液泡系的中性紅染色觀察實(shí)驗(yàn)前使黃豆種子發(fā)芽，芽長1cm以上；初生豆苗根尖（１－２cm）縱切面切片，1/3000中性紅溶液１滴染色5-10min，載玻片于37℃恒溫水浴，蓋上蓋玻片壓扁根尖，顯微鏡下觀察．五、作業(yè)1．繪出人口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布并簡(jiǎn)要分析。2．繪出黃豆幼根根尖組織液泡系的形態(tài)與分布并簡(jiǎn)要分析。實(shí)驗(yàn)三孚爾根反應(yīng)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜げ⒄莆真跔柛磻?yīng)的原理及其實(shí)驗(yàn)操作方法對(duì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)研究方法有初步的認(rèn)識(shí)二實(shí)驗(yàn)原理DNA是由許多單核苷酸聚合成的多核苷酸，每個(gè)單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNA經(jīng)1N鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應(yīng)形成紫紅色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預(yù)先用熱的三氯醋酸或DNA酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。三實(shí)驗(yàn)儀器及材料實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡、恒溫水浴箱、溫度計(jì)、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙。實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥鱗莖或根尖

四實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)照片：方法一先將材料放在5%三氯醋酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后其它方法同上。?方法二材料不經(jīng)1NHCl水解，直接放在Schiff試劑中染色，然后按步驟④－⑦制片觀察。五作業(yè)1.簡(jiǎn)述Feulgen反應(yīng)的原理和實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。2.繪圖示洋蔥根尖細(xì)胞或鱗莖表皮細(xì)胞DNA的分布部位。3.描述你的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四染色體核型分析核型（karyotype）:指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的整套染色體按照一定的順序排列起來所構(gòu)成的圖像。通常是將顯微攝影得到的染色體照片剪貼而成。正常細(xì)胞的核型能代表個(gè)體的核型。組型（idiogram）是以模式圖的方式表示，它是通過對(duì)許多細(xì)胞染色體的測(cè)量取其平均值繪制而成的，是理想的，模式化的染色體組成。代表了一物種染色體組型的特征。核型的研究對(duì)人類醫(yī)學(xué)遺傳研究及臨床應(yīng)用，對(duì)探討動(dòng)植物起源、物種間親緣關(guān)系，鑒定遠(yuǎn)緣雜種等方面都有重大意義。

一實(shí)驗(yàn)原理染色體的特征以有絲分裂中期最為顯著，所以一般都分析中期分裂相。根據(jù)染色體著絲粒位置的不同，可將染色體分為中部著絲粒染色體（m），亞中部著絲粒染色體（sm），亞端部著絲粒染色體（st），端部著絲粒染色體（t）。重要的參數(shù)有三個(gè)：

相對(duì)長度（relativelength）:指單個(gè)染色體長度與包括Ｘ（或Ｙ）染色體在內(nèi)的單倍染色體總長之比，以百分率表示。臂指數(shù)（amindex）：指長臂同短臂的比率著絲粒指數(shù)（centromereindex）:指短臂占該染色體長度的比率，它決定著絲粒的相對(duì)位置。人類體細(xì)胞的正常核型是含有46條染色體，相互構(gòu)成23對(duì)。其中22對(duì)是男女所共有的常染色體，一對(duì)為男女所不同的性染色體，男XY，女XX。根據(jù)丹佛（1960）、倫敦（1963）和芝加哥（1966）會(huì)議提出的標(biāo)準(zhǔn)，即按照染色體的長度依次減小和著絲粒位置以及其它特征，把人類體細(xì)胞染色體分為七個(gè)組群。二實(shí)驗(yàn)儀器及試材（一）儀器、用具：攝影顯微鏡、膠卷、沖印放大器材、剪刀、鑷子、毫米尺、膠水（二）材料人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本三實(shí)驗(yàn)步驟1．在顯微鏡下找出染色體分散良好、長度適中、姊妹染色單體清楚的中期分裂相進(jìn)行顯微拍攝。2．將顯微拍攝放大好的照片上的一個(gè)細(xì)胞的全部染色體，分別一條一條剪下。3．根據(jù)染色體的長短和形態(tài)特征進(jìn)行同源染色體的目測(cè)配對(duì)。4．測(cè)量出每條染色體短臂和長臂長度，計(jì)算出各條染色體的相對(duì)長度、著絲粒指數(shù)、臂指數(shù)，并記錄原始數(shù)據(jù)。5．根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)校正目測(cè)配對(duì)排列的結(jié)果，進(jìn)行調(diào)整排列。6.把染色體按一定順序一對(duì)一對(duì)地排列，排列時(shí)注意短臂向上，長臂向下，性染色體單獨(dú)排列，最后把染色體貼成一完整的染色體組型圖。7．翻拍。四作業(yè)根據(jù)染色體照片，進(jìn)行染色體組型分析

實(shí)驗(yàn)五PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.通過PEG介導(dǎo)的雞血細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),

對(duì)體細(xì)胞融合有一個(gè)清楚的概念

2.并初步掌握利用PEG介導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

二實(shí)驗(yàn)原理一般認(rèn)為，PEG改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起,

使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通,

從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。

其融合效果受以下幾種因素的影響：1.

PEG的分子量與濃度:

細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高,

對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。2.

PEG的pH值:

PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3.

PEG的處理時(shí)間:

處理時(shí)間越長，融合效果越好,

但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時(shí)間限制在1分鐘之內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng),

故處理時(shí)間可適當(dāng)放寬至數(shù)分鐘。4.

融合時(shí)的溫度:

由于生物膜膜的流動(dòng)性與溫度成正比，故細(xì)胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果,

在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度。對(duì)于哺乳動(dòng)物的細(xì),

一般采用的溫度為38~40℃。

本實(shí)驗(yàn)所用材料為雞的血細(xì)胞，這是因?yàn)?

1.

雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；2.

實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得。細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行鑒別。細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)核，定為未融合細(xì)胞；有二至多個(gè)核，定為融合細(xì)胞。三實(shí)驗(yàn)用品1器材

主要設(shè)備:

普通離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡

小型器材:

100ml量筒2個(gè),

滴管10支,

10ml刻度離心管20支,

載、蓋片各20片

材料

：新鮮雞血

2試劑

（1）

Alsever液制備

：葡萄糖

2.05g

、枸椽酸鈉

0.8g

、氯化鈉0.42g

、重蒸水

100ml

（2）

0.85%生理鹽水液

（3）

GKN液

：氯化鈉

8g

、氯化鉀

0.4g、葡萄糖

2g

、

Na2HPO4?2H2O

1.77g、NaH2PO4?H2O

0.69g

、酚紅

0.01g

、1000ml重蒸水中。

（4）

50%

PEG液

(現(xiàn)用現(xiàn)配)

稱取適量PEG(Mr.4000)放入刻度離心管內(nèi)，在酒精燈上將其加熱熔化，待冷卻至50℃，加入等體積的已預(yù)熱至50℃的GKN液并充分混勻。

四實(shí)驗(yàn)步驟將Alsever液與活雞翼下雞血混成1:4懸液

（抗凝效果最佳）

↓

4。冰箱保存

↓

取上述懸液加入生理鹽水混勻

↓

1200r/min離心5分鐘

↓棄上清（上述離心速率重復(fù)離心兩次(5min,

10min)

（以達(dá)到去除細(xì)胞表面粘附物質(zhì)的目的）

加入適量GKN液，配成細(xì)胞懸液

↓

取懸液以血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)

↓

再用GKN液將紅細(xì)胞的濃度稀釋

↓

加入

50%的PEG液混勻

↓

吸取1~2滴鏡檢并計(jì)算出融合率

五實(shí)

驗(yàn)

結(jié)

果

經(jīng)PEG處理后，在顯微鏡下，可觀察到未融合的單核細(xì)胞、融合后的雙核細(xì)胞和融合后的多核細(xì)胞。

細(xì)胞的融合率指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞的核的總數(shù)與此視野內(nèi)所有細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)之比?？捎萌缦鹿奖硎荆?/p>

融合率=視野內(nèi)融合細(xì)胞的核數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞的總和數(shù)*100%

在實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)融合率時(shí),

要進(jìn)行多個(gè)視野計(jì)數(shù)，然后再加以平均，以使計(jì)算更為準(zhǔn)確。

六作業(yè)1.PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的影響因素有哪些？2.本實(shí)驗(yàn)中所用的PEG融合方法能否用于植物細(xì)胞？為什么？3.本實(shí)驗(yàn)的材料為什么不用兔子或小鼠的血細(xì)胞？如果因?qū)嶒?yàn)需要必需選用小鼠血細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)如何對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別？請(qǐng)你根據(jù)目前所掌握的知識(shí)談?wù)勀闼茉O(shè)想到的鑒別方法。實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物細(xì)胞微絲束的光學(xué)顯微鏡觀察一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)R250染動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)微絲的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲的分布有一個(gè)整體上的認(rèn)識(shí)二實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，可以使各種細(xì)胞骨架蛋白著色，并特異性地顯示微絲，但是由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實(shí)驗(yàn)條件下不夠穩(wěn)定，以及有些纖維太細(xì)，在光鏡下無法分辨，因此，本實(shí)驗(yàn)可以看到的是微絲組成直徑為40nm的張力纖維，張力纖維形態(tài)長而直，常與細(xì)胞長軸平行并貫穿細(xì)胞。染色時(shí)用的M-緩沖液，其中咪唑是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低Ca條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并較為舒張。三實(shí)驗(yàn)用品材料：體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞試劑：

0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）０.２ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢ磷酸緩沖液（ｐＨ＝７.３）Ｍ－緩沖液１％的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／Ｍ－緩沖液０.２％的考馬斯亮藍(lán)Ｒ250３０％的戊二醛－ＰＢ溶液器材：顯微鏡，載玻片，３５ｍｍ小染缸。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．觀察動(dòng)植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量和分布；2．了解一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)

二、實(shí)驗(yàn)原理

活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法不同，通常將活體染色分為體內(nèi)活染和體外活染兩類。二、實(shí)驗(yàn)原理體外活染又稱超活染色。它是由活的動(dòng)、植物細(xì)胞分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)上而顯色。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑。應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用。本實(shí)驗(yàn)采用詹納斯綠B和中性紅兩種堿性染料。二、實(shí)驗(yàn)原理詹納斯綠Ｂ可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行活染，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原成無色的色基（即無色狀態(tài)）。中性紅對(duì)液泡系的染色具有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色。細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色。三、實(shí)驗(yàn)用品

1．器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、剪刀、鑷子、解剖刀、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙2．試劑：a）Ringer液：

氯化鈉8.5g（變溫動(dòng)物用6.5g）

氯化鈣0.12g

碳酸氫鈉0.20g

氯化鉀0.14g

磷酸氫二鈉0.01g

葡萄糖2.0g

加蒸餾水至1000mlb）1/5000詹納斯綠Ｂ溶液c）1/3000中性紅溶液3．材料：人口腔上皮細(xì)胞、黃豆幼根根尖四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）口腔上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察（1）取清潔載玻片置于37℃恒溫水浴鍋上，滴1-2滴1/5000詹納斯綠Ｂ染液；（2）用牙簽寬頭取口腔上皮細(xì)胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴上，在37℃恒溫染色10-15min，顯微鏡下觀察。（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液）口腔上皮細(xì)胞線粒體四、實(shí)驗(yàn)方法

（二）黃豆幼根根尖液泡系的中性紅染色觀察1）實(shí)驗(yàn)前，把黃豆種子培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，芽伸長到1cm以上；2）用刀片把初生豆苗根尖（1-2cm）切一縱切面，滴一滴1/3000中性紅溶液染色5-10min；載玻片于37℃恒溫水浴中。3）吸去染液，蓋上蓋玻片，壓扁根尖，顯微鏡下觀察。黃豆幼根根尖液泡系接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡——短命細(xì)胞.一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)：骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株——沒有抗體分泌物。2.細(xì)胞融合技術(shù)：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/

脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/

骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長期存活不能長期存活HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)

谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)二、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動(dòng)物免疫：目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時(shí)；省抗原”“省時(shí)”“操作繁瑣”常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原+不加佐劑第4次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)二、細(xì)胞融合及HAT篩選病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合電激融合1、細(xì)胞融合方法：細(xì)胞懸液的制備與融合(1)脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長期制備(3)細(xì)胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater三、抗體的檢測(cè)要求：

簡(jiǎn)便、快速、敏感;

在短時(shí)間內(nèi)能檢測(cè)大量樣品常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴(kuò)散法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理：四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法80個(gè)細(xì)胞/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：

高度純一高度專一應(yīng)用：疾病的論斷和治療(生物導(dǎo)彈)生物大分子的鑒定、定位和分離純化細(xì)胞器的鑒定、定位和分離特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位和分離五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無限生長細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解定義：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）

是指染色體基因組中整合有外源基因并能表達(dá)和穩(wěn)定遺傳的一類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的方法與關(guān)鍵技術(shù)實(shí)驗(yàn)錄像中的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史講授提綱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史

1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了SV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。

1980年，Gordon等人首先育成帶有人胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年P(guān)almiter等人將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，獲得比普通小鼠生長速度快2~4倍，體形大一倍的轉(zhuǎn)基因“碩鼠”后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)轟動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)界轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史

目前，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因雞、轉(zhuǎn)基因魚等陸續(xù)育成。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、畜牧學(xué)等研究領(lǐng)域，并取得了許多有價(jià)值的研究成果。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的方法與關(guān)鍵技術(shù)實(shí)驗(yàn)錄像中的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史講授提綱

借助分子生物學(xué)和胚胎工程的技術(shù)，將外源目的基因在體外擴(kuò)增和加工，導(dǎo)入動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到染色體上，當(dāng)胚胎被移植到代孕動(dòng)物的輸卵管或子宮中后，發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的方法與關(guān)鍵技術(shù)實(shí)驗(yàn)錄像中的內(nèi)容轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展史講授提綱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育的方法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法；胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法；精子載體導(dǎo)入法；基因顯微注射法等?；蝻@微注射法基因顯微注射法流程圖（1）目的基因的制備與純化

（2）卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備

（3）超排卵與取卵

（4）基因顯微注射

（5）受精卵移植

（6）目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測(cè)

（7）建系轉(zhuǎn)基因小鼠的培育程序（1）目的基因的制備與純化

制備：①通過限制性內(nèi)切酶預(yù)先分離