細胞培養(yǎng)工作流程樣本

細胞培養(yǎng)工作流程Vero細胞復(fù)蘇流程準備1.1工作地點檢查：檢查臺面、地面與否干凈，確認無不有關(guān)物品。1.2設(shè)施檢查：確認空調(diào)、傳遞窗工作狀態(tài)完好。1.3層流罩準備：啟動層流罩，觀測其運營與否正常，用消毒劑將臺面、墻面、地面、保護簾及層流罩內(nèi)設(shè)備進行清潔消毒。并運營30分鐘后開始生產(chǎn)操作。1.4操作工具和試劑檢查：檢查本次操作所用滅菌物品外包裝與否嚴密，與否在效期內(nèi)。檢查本次操作所用溶液/試劑瓶內(nèi)與否有異物，瓶表面與否有裂紋，瓶塞與否松動，溶液名稱、批號、數(shù)量、有效期與否符合規(guī)定。合格后用消毒劑擦拭外表面后拿入層流罩。復(fù)蘇、換液用液體：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3溶液。1.5復(fù)蘇用水準備：（1）融化種子用溶液：按1L/1支種子準備39±1℃含0.1%新潔爾滅溶液。（2）百級內(nèi)消毒種子用水：1L/1支種子準備36.5±1℃含0.1%新潔爾滅溶液。1.6操作人員進入層流罩：穿一層無菌連體服并戴無菌手套，靜止5分鐘后方可操作。1.7溶液使用前解決：輔助人員用止血鉗夾酒精棉球點燃后消毒瓶塞外表面，旋轉(zhuǎn)1周，操作人員將翻塞翻開，再用點燃酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。配液配方復(fù)蘇液MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液100/300/新生牛血清109%～10%154.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液10.9%～1%30.9%～1%慶大霉素0.10.12%～0.13%0.40.12%～0.13%7.5%NaHCO31.51.5%～1.8%4.51.5%～2%輔助人員將配制所需液體按順序打開后放至鹽水瓶架上，操作人員按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一種液后輔助人員應(yīng)及時用無菌翻塞將其蓋緊，在其瓶身用記號筆注明用量、日期等。復(fù)蘇液及生長液配完后輔助人員及時用無菌翻塞將其蓋緊，充分混勻待用。輔助人員打開混勻后復(fù)蘇液，放置鹽水瓶架上。操作人員將培養(yǎng)瓶（T175）蓋打開，傾斜或直立放置酒精燈附近，將復(fù)蘇液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4ml/cm2），擰緊瓶蓋并放在恒溫室待用。種子支領(lǐng)根據(jù)種子庫管理規(guī)定進行支領(lǐng)，根據(jù)生產(chǎn)指令按數(shù)量支領(lǐng)。本操作規(guī)格按復(fù)蘇1支細胞種子到1個T75cm2瓶規(guī)定各項操作。若支領(lǐng)數(shù)量變化培養(yǎng)瓶面積按比例調(diào)節(jié)，后續(xù)操作各項用量按比例調(diào)節(jié)。種子速溶種子庫管理員從細胞庫剛?cè)〕黾毎N子時，在液氮罐頸部停留幾秒，核對所支領(lǐng)種子標簽內(nèi)容與細胞種子申領(lǐng)單上內(nèi)容與否一致。核對無誤后，迅速所有浸入39±1℃含0.1%新潔爾滅溶液（1000ml/支種子），順時針不斷搖動直至融化，將每次速融時間控制在1分鐘內(nèi)。然后用75%酒精消毒容器外表面，放置在傳遞窗內(nèi)風淋2分鐘。同步立即告知細胞區(qū)人員將種子從傳遞窗取走。迅速傳遞并浸入百級內(nèi)36.5±1℃含0.1%新潔爾滅溶液中，百級內(nèi)操作人員取出擦干。移種操作人員左手拿凍存管，右手打開，用1ml吸管將融化后細胞種子吸出，緩慢滴加到1個T75cm2培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋。培養(yǎng)輔助人員在培養(yǎng)瓶上注明細胞名稱、批號、代次、復(fù)蘇日期、瓶編號等信息后及時放置恒溫室靜置培養(yǎng)。24小時內(nèi)（細胞貼壁80%）進行換液。清場將廢液倒入下水道，廢物、待清洗物品由傳遞窗傳到粗洗間，層流罩內(nèi)用75%酒精消毒，再用純水清潔整個房間。復(fù)蘇后觀測第二天觀測培養(yǎng)液顏色（PH）與否正常，在顯微鏡下觀測細胞形態(tài)數(shù)量。9、換液換液前準備與復(fù)蘇前相似。觀測培養(yǎng)液顏色與否正常，有無漏液，看細胞與否生長良好。用消毒劑擦拭表面后放入層流罩，操作人員進入層流罩換好無菌連體服后靜止5分鐘方可操作。輔助人員用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人員將翻塞翻開，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人員右手拿住培養(yǎng)瓶底部，左手擰開瓶蓋，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使上清液沿其頂面流至廢液缸。輔助人員打開裝生長液瓶口，并將其在火焰外焰旋轉(zhuǎn)1圈后，放置鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶蓋擰松放置酒精燈附近，將生長液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4ml/cm2）。擰緊瓶口，平放到恒溫室培養(yǎng)。最后按規(guī)定清場細胞傳代流程準備1.1工作地點檢查：檢查臺面、地面與否干凈，確認無不有關(guān)物品。1.2設(shè)施檢查：確認空調(diào)、蠕動泵工作狀態(tài)完好。1.3層流罩準備：啟動層流罩，觀測其運營與否正常，用消毒劑將臺面、墻面、地面、保護簾及層流罩內(nèi)設(shè)備進行清潔消毒。并運營30分鐘后開始生產(chǎn)操作。1.4操作工具和試劑檢查：檢查本次操作所用滅菌物品外包裝與否嚴密，與否在效期內(nèi)。檢查本次操作所用溶液/試劑瓶內(nèi)與否有異物，瓶表面與否有裂紋，瓶塞與否松動，溶液名稱、批號、數(shù)量、有效期與否符合規(guī)定。合格后用消毒劑擦拭外表面后拿入層流罩。細胞傳代用液體：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、細胞消化液（含0.25%胰蛋白酶溶液）。傳代1操作2.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液400/新生牛血清204.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液40.9%～1%慶大霉素0.50.12%～0.13%7.5%NaHCO381.8%～2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3。輔助人員蓋緊瓶口，在瓶身用記號筆注明用量、日期等，混勻待用。注意事項：無菌吸管不得碰觸除尾部以外任何地方，否則棄用。2.2洗滌輔助人員將PBS打開，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：30ml/T75cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動一次后倒掉PBS。注意事項：倒廢液時注意不能污染瓶口。2.3消化輔助人員將消化液瓶口打開，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開交由操作人員。操作人員用吸管吸3ml細胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞消化液鋪滿整個細胞面，靜置待細胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項：細胞培養(yǎng)瓶開蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細胞時肉眼觀測細胞面呈針眼狀時應(yīng)倒掉細胞消化液，避免細胞脫落。2.4懸液制備輔助人員將生長液打開，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開，用吸管吸10ml至T75cm2瓶中，用吸管沖洗下細胞，吹打分散，制成均勻細胞懸液。注意事項：分散細胞要充分，肉眼觀測細胞無團塊方可。2.5分種操作人員將細胞懸液平均分種至2個T175cm2培養(yǎng)瓶中，，加生長液至75ml。2.6培養(yǎng)輔助人員將細胞批號、代次、傳代比例、瓶編號、日期標記在2個T175cm2細胞培養(yǎng)瓶上，將接種細胞培養(yǎng)瓶放置恒溫室靜置培養(yǎng)。2.7清場按規(guī)定清場2.8觀測每天觀測細胞生長狀態(tài)3、傳代2操作3.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液600/新生牛血清304.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液60.9%～1%慶大霉素0.750.12%～0.13%7.5%NaHCO3121.8%～2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、慶大霉素、7.5%NaHCO3。輔助人員蓋緊瓶口，在瓶身用記號筆注明用量、日期等，混勻待用。注意事項：無菌吸管不得碰觸除尾部以外任何地方，否則棄用。3.2洗滌輔助人員將PBS打開，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：60ml/T175cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動一次后倒掉PBS。注意事項：倒廢液時注意不能污染瓶口。3.3消化輔助人員將消化液瓶口打開，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開交由操作人員。操作人員用吸管吸7ml細胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞消化液鋪滿整個細胞面，靜置待細胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項：細胞培養(yǎng)瓶開蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細胞時肉眼觀測細胞面呈針眼狀時應(yīng)倒掉細胞消化液，避免細胞脫落。3.4懸液制備輔助人員將生長液打開，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開，將生長液直接倒入至T175cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管沖洗下細胞，吹打分散，制成均勻細胞懸液。注意事項：分散細胞要充分，肉眼觀測細胞無團塊方可。3.5分種操作人員將細胞懸液平均分種至8個T175cm2培養(yǎng)瓶中，加生長液至75ml。3.6培養(yǎng)輔助人員將細胞批號、代次、傳代比例、瓶編號、日期標記在細胞培養(yǎng)瓶上，將接種細胞培養(yǎng)瓶放置恒溫室靜置培養(yǎng)。3.7清場按規(guī)定清場3.8觀測每天觀測細胞生長狀態(tài)傳代3操作4.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液/新生牛血清1004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液200.9%～1%慶大霉素2.50.12%～0.13%7.5%NaHCO3401.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開線繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無菌環(huán)境。輔助人員將所需溶液依次打開，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項：無菌吸管使用過程中禁止接觸其她部位（除吸管后端任何位置），如不慎遇到應(yīng)及時廢棄。安裝管道過程中，如管道不慎遇到其她部位應(yīng)及時廢棄。4.2洗滌輔助人員將PBS打開，用酒精燈將瓶口消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將培養(yǎng)瓶打開，將上清液沿培養(yǎng)瓶上表面倒至廢液桶。然后在酒精燈旁將PBS倒入培養(yǎng)瓶，倒入量：60ml/T175cm2瓶。（加量：0.2～0.4ml/cm2）蓋上蓋子，PBS交由輔助人員蓋緊塞子，標記用量、日期。操作人員將培養(yǎng)瓶先后左右晃動一次后倒掉PBS。注意事項：倒廢液時注意不能污染瓶口。4.3消化輔助人員將消化液瓶口打開，將瓶口用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。同步將培養(yǎng)瓶蓋子打開交由操作人員。操作人員用吸管吸7ml細胞消化液到培養(yǎng)瓶底，（消化液加量：0.02~0.04ml/cm2）蓋好瓶蓋。輔助人員將消化液蓋好，標記用量、日期。操作人員翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞消化液鋪滿整個細胞面，靜置待細胞間質(zhì)疏松后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液鹽沿培養(yǎng)瓶上面倒入廢液缸中，蓋緊瓶蓋置36.5±0.5℃恒溫或室溫繼續(xù)作用5～10分鐘。注意事項：細胞培養(yǎng)瓶開蓋后最佳要45°傾斜，操作完畢后立即蓋好蓋子。室溫消化細胞時肉眼觀測細胞面呈針眼狀時應(yīng)倒掉細胞消化液，避免細胞脫落。4.4懸液制備輔助人員將生長液打開，用火焰消毒后放到鹽水瓶架上待用。操作人員將消化好培養(yǎng)瓶打開，將生長液直接倒入至T175cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管沖洗下細胞，吹打分散，制成均勻細胞懸液。然后將8個培養(yǎng)瓶細胞合并到1個T175cm2瓶中。用傳液管道吸入MEM中，混勻待用。注意事項：分散細胞要充分，肉眼觀測細胞無團塊方可。4.5分種輔助人員將10層細胞工廠蓋子打開，操作人員將連接管道出液口處細胞工廠轉(zhuǎn)接頭無菌取出后與細胞工廠左端口對接，并將細胞工廠橫放在操作臺上，同步將細胞工廠右端蓋擰松。輔助人員真空泵打氣端與管道空氣濾器相連，啟動真空泵將生長液打入細胞工廠內(nèi)。結(jié)束后，操作人員用止血鉗將管道夾緊后將細胞工廠右端蓋擰緊，平衡后把細胞工廠向上直立，再取下左端連接細胞工廠管道轉(zhuǎn)接頭交輔助人員，用蓋子蓋緊右側(cè)細胞工廠接口，將細胞工廠放平。然后將管道內(nèi)殘夜打入準備好T25cm2培養(yǎng)瓶中作對照。注意事項：注意打氣過程中管道不要崩開。4.6培養(yǎng)輔助人員將細胞批號、代次、傳代比例、瓶編號、日期標記在細胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。4.7清場4.8觀測5、傳代4操作5.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液8000/新生牛血清4004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液800.9%～1%慶大霉素100.12%～0.13%7.5%NaHCO31601.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開線繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無菌環(huán)境。輔助人員將所需溶液依次打開，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項：操作人員取管道時連接MEM液桶內(nèi)管道不能遇到包裝紙外部，將管道放入MEM液桶內(nèi)時，伸入桶內(nèi)管道不能遇到MEM液桶外部，否則此管道停止使用。5.2洗滌輔助人員將PBS打開，用火焰消毒瓶口，放到鹽水瓶架上待用。操作人員將細胞工廠內(nèi)上清倒入廢液桶，然后將細胞工廠平放在桌面上，倒入PBS，加入量：1L/CF10（0.2～0.4ml/cm2），蓋上蓋子，平衡PBS液后放平，先后左右搖晃幾次，倒掉。注意事項：千萬不能污染細胞工廠瓶口5.3消化輔助人員打開消化液瓶口，用火焰消毒后放在鹽水瓶架上待用。操作人員將細胞工廠平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.02~0.04ml/cm2)。平衡后放平，搖晃細胞工廠，使消化液鋪滿整個細胞面，帶細胞間質(zhì)疏松后倒掉，蓋好蓋子放到恒溫室5-10分鐘。注意事項:室溫消化細胞時肉眼觀測細胞面呈針眼狀時應(yīng)倒掉細胞消化液，避免細胞脫落。5.4懸液制備當細胞開始脫落時，將細胞工廠豎立在臺面上，把連接生長液桶細胞工廠接頭與細胞工廠相連，擰松右側(cè)蓋子，放到細胞工廠，啟動真空泵，打入1L生長液停止。蓋好蓋子，輔助人員雙手握住細胞工廠，上下小幅度迅速震蕩，使細胞充分分散。然后連接生長液，將細胞懸液打入生長液桶內(nèi)，混勻待用。注意事項：搖細胞工廠時要迅速有力度，使細胞充分分散。5.5分種將細胞懸液分4份均勻打入4個10層細胞工廠，并將殘液打入培養(yǎng)瓶中作對照。5.6培養(yǎng)輔助人員將細胞批號、代次、傳代比例、瓶編號、日期標記在細胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。5.7清場5.8觀測6、傳代5操作6.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液3/新生牛血清16004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液3200.9%～1%慶大霉素400.12%～0.13%7.5%NaHCO36401.8%～2%輔助人員先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，擰松桶蓋，操作人員解開線繩將外包裝紙向外翻至露出傳液瓶塞頂部位置右手拿住鏈接空氣過濾器及出液口管道，左手將包裝袋松動，一次性取出管道并放入MEM桶中，輔助人員需要將點燃酒精棉球始終放在桶口附近創(chuàng)造無菌環(huán)境。PBS、消化液管道均按此辦法安裝。輔助人員將所需溶液依次打開，操作人員用配液直管將溶液吸入MEM桶內(nèi)，加完后混勻待用。然后拔掉直管，將帶細胞工廠接頭不銹鋼管道與之相連，待用。注意事項：操作人員取管道時連接桶內(nèi)管道不能遇到包裝紙外部，將管道放入桶內(nèi)時，伸入桶內(nèi)管道不能遇到桶外部，否則此管道停止使用。6.2洗滌輔助人員將細胞工廠上清倒入廢液桶，交由操作人員與PBS管道相連，用真空泵打入1LPBS溶液，蓋好蓋子，搖晃幾次后倒掉。注意事項：千萬不能污染細胞工廠瓶口6.3消化輔助人員打開消化液瓶口，用火焰消毒后放在鹽水瓶架上待用。操作人員將細胞工廠平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.02~0.04ml/cm2)。平衡后放平，搖晃細胞工廠，使消化液鋪滿整個細胞面，帶細胞間質(zhì)疏松后倒掉，蓋好蓋子放到恒溫室5-10分鐘。注意事項:室溫消化細胞時肉眼觀測細胞面呈針眼狀時應(yīng)倒掉消化液，避免細胞脫落。6.4懸液制備當細胞開始脫落時，將細胞工廠豎立在臺面上，把連接生長液桶細胞工廠接頭與細胞工廠相連，擰松右側(cè)蓋子，放到細胞工廠，啟動真空泵，打入1L生長液停止。蓋好蓋子，輔助人員雙手握住細胞工廠，上下小幅度迅速震蕩，使細胞充分分散。然后連接生長液，將細胞懸液打入生長液桶內(nèi)，混勻待用。注意事項：搖細胞工廠時要迅速有力度，使細胞充分分散。5.5分種將細胞懸液打入4個10層細胞工廠和3個40層細胞工廠，并將殘液打入培養(yǎng)瓶中作對照。5.6培養(yǎng)輔助人員將細胞批號、代次、傳代比例、瓶編號、日期標記在細胞工廠上，放置到恒溫室靜置培養(yǎng)。5.7清場5.8觀測傳代6操作7.1配液配方MEM生長液名稱加入量（ml）含量控制范疇MEM培養(yǎng)基溶液96000/新生牛血清48004.5%～5.5%3%谷氨酰胺溶液9600.9%～1%慶大霉素1200.12