化妝品光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活

———附件5光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定試驗(yàn)方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范圍本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定試驗(yàn)的基本要求和方法。本方法適用于預(yù)測(cè)化妝品用化學(xué)原料的潛在光毒性。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)化妝品用化學(xué)原料是否具有潛在光毒性。3定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本方法。3.1光反應(yīng)性Photoreactivity化學(xué)物質(zhì)由于吸收光子而與另一個(gè)分子發(fā)生反應(yīng)的性質(zhì)。3.2光毒性Phototoxicity皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應(yīng)，或者全身應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應(yīng)。本方法所述光毒性包括光刺激性、光過(guò)敏性和光遺傳毒性。3.3輻照度Irradiance照射到某一表面的紫外線或可見光的強(qiáng)度，單位為瓦每平方米（W/m2）或毫瓦每平方厘米（mW/cm2）。3.4光照劑量Doseoflight照射到某一表面的紫外線或可見光的量[=強(qiáng)度×?xí)r間（秒）]，單位為焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。3.5活性氧種類ReactiveOxygenSpecies，ROS活性氧種類，包括單線態(tài)氧和超氧陰離子。3.6單線態(tài)氧SingletOxygen，SO由光輻照化學(xué)物質(zhì)通過(guò)Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的一種自由基。3.7超氧陰離子SuperoxideAnion，SA由光輻照化學(xué)物質(zhì)通過(guò)I型光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的一種自由基。4試驗(yàn)原理一些具有光反應(yīng)性的化學(xué)物質(zhì)暴露于紫外線時(shí)，吸收某一波長(zhǎng)光子，誘導(dǎo)發(fā)色團(tuán)激發(fā)，激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到氧分子上，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧（包括單線態(tài)氧SO和超氧陰離子SA），活性氧是光毒性反應(yīng)中的重要中間物質(zhì)。單線態(tài)氧和咪唑反應(yīng)生成的過(guò)氧化物中間體對(duì)N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）反應(yīng)生成NBT+，其在560nm波長(zhǎng)下具有光吸收。本試驗(yàn)方法通過(guò)分光光度法測(cè)定化學(xué)物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后對(duì)RNO在440nm下吸光度的減少及對(duì)NBT+在560nm下吸光度的增加來(lái)判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光反應(yīng)性。5試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑應(yīng)在配制后1個(gè)月內(nèi)使用，并且在使用前應(yīng)超聲處理，以免物質(zhì)析出、沉淀對(duì)試驗(yàn)造成影響。主要試劑配制方法如下：5.1磷酸二氫鈉。5.2磷酸氫二鈉。5.3N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）。5.4咪唑。5.5氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）。5.6pH7.4的20mmol/L磷酸鈉緩沖液（NaPB）稱取593mgNaH2PO4·2H2O（CAS：13472-35-0）和5.8gNa2HPO4·12H2O（CAS:10039-32-4），加入約900mL水，混勻，用1mol/L的HCl將pH值調(diào)節(jié)為7.4，定容至1000mL后混勻。于2℃~8℃冰箱或室溫保存。5.70.2mmol/LN,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO，CAS：138-89-6）稱取3mgRNO，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.80.2mmol/L咪唑（CAS：288-32-4）稱取13.6mg咪唑，溶于10mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻，得到20mmol/L咪唑溶液。用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液將20mmol/L咪唑溶液稀釋100倍，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.90.4mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，CAS：298-83-9）稱取32.7mgNBT，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.10溶劑的選擇優(yōu)先使用分析級(jí)二甲基亞砜（DMSO）。對(duì)于不溶于DMSO的受試物，可使用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液作為溶劑。如果受試物在DMSO和磷酸鈉緩沖液中不溶或不穩(wěn)定，也可使用其他溶劑，但應(yīng)保證受試物在所選溶劑中穩(wěn)定，且參考化學(xué)物質(zhì)的SO值和SA值應(yīng)在附錄A規(guī)定的范圍內(nèi)。5.11待測(cè)化學(xué)物質(zhì)溶液的配制待測(cè)化學(xué)物質(zhì)的分子量應(yīng)是已知的。測(cè)試終濃度為200μmol/L，如果在200μmol/L濃度下的反應(yīng)混合物有沉淀、著色或其他干擾等現(xiàn)象，則可以使用20μmol/L為終濃度進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)待測(cè)化學(xué)物質(zhì)在20μmol/L的終濃度下得到陽(yáng)性結(jié)果，表示該物質(zhì)具有光反應(yīng)性；但在濃度低于20μmol/L下得到陰性結(jié)果，不能表示該物質(zhì)無(wú)光反應(yīng)性。待測(cè)化學(xué)物質(zhì)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，所有操作均應(yīng)避免在強(qiáng)紫外線和強(qiáng)可見光照射（例如頭頂燈下或在自然光暴露的窗戶附近工作），以避免在試驗(yàn)前待測(cè)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生光激活或光降解。待測(cè)化學(xué)物質(zhì)在試管中稱重，加入5.10項(xiàng)溶劑，渦旋混勻，超聲5-10min，配制成10mmol/L（終濃度200μmol/L）。當(dāng)終濃度200μmol/L的反應(yīng)混合物在光照前觀察到沉淀、著色或其他干擾等現(xiàn)象時(shí)，需將10mmol/L的溶液用DMSO稀釋成1mmol/L溶液（終濃度20μmol/L）。對(duì)于不溶于DMSO的化學(xué)物質(zhì)，使用其他溶劑（如磷酸鈉緩沖溶液）時(shí)，須使得反應(yīng)混合物中含有20μLDMSO（2%，v/v）。5.12陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照以奎寧鹽酸鹽二水合物（CAS：6119-47-7）作為陽(yáng)性對(duì)照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作為陰性對(duì)照。用DMSO按與受試物相同的方法將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照配制成10mmol/L的儲(chǔ)備溶液，分裝后于-20℃冰箱凍存，于使用當(dāng)天解凍，避免反復(fù)凍融，1個(gè)月內(nèi)使用完畢。6儀器和設(shè)備6.1太陽(yáng)光模擬器6.1.1選擇合適的光源用于提供紫外線和可見光的照射，通過(guò)濾光片減少波長(zhǎng)小于290nm的UVC，使光源盡量接近室外日光。推薦的測(cè)試條件如下：配備濾光片的太陽(yáng)模擬器（減少紫外線波長(zhǎng)<290nm）（見附錄B）—輻照度：1.8mW/cm2至2.2mW/cm2，照射1小時(shí)（例如，AtlasSuntestCPS+的指標(biāo)設(shè)置值為250W/m2），—UVA光照劑量：6.5J/cm2至7.9J/cm2（見附錄B）。配備濾光片的太陽(yáng)模擬器（減少紫外線波長(zhǎng)<300nm）（見附錄B）—輻照度：3.0mW/cm2至5.0mW/cm2，照射1小時(shí)（例如，SericSXL-2500V2），—UVA光照劑量：11J/cm2至18J/cm2（見附錄B）。6.1.2測(cè)試條件根據(jù)實(shí)際選擇合適具體條件。6.1.3ROS的產(chǎn)生受溫度影響，太陽(yáng)光模擬器應(yīng)配備溫度控制裝置，光照期間溫度在20℃~29℃。6.2反應(yīng)容器推薦使用石英反應(yīng)容器（規(guī)格見附錄C），避免液體蒸發(fā)以及由于塑料蓋造成的UV損失。也可使用其他UV透射率大于95%的蓋子或密封件替代。實(shí)驗(yàn)室使用其他容器時(shí)，應(yīng)使用附錄A中的參考化學(xué)物質(zhì)（序號(hào)1-17號(hào)）確定合適的儀器輻照度及光劑量。6.3酶標(biāo)儀。6.4UVA紫外照度計(jì)。6.5顯微鏡。7分析步驟7.1將下列成分在避光條件下混合：7.1.1溶劑為DMSO的受試物：?jiǎn)尉€態(tài)氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB480μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB855μL0.4mmol/LNBT125μL10或1mmol/L受試物20μL7.1.2溶劑為NaPB的受試物：?jiǎn)尉€態(tài)氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB460μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB835μL0.4mmol/LNBT125μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL以20μL溶劑替代受試物，作為空白對(duì)照。渦旋或超聲5~10min后，將200μL反應(yīng)混合物加入到96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行。96孔板加樣詳見附錄D。7.2在100倍顯微鏡下檢查反應(yīng)混合物中各組分溶解情況。如有沉淀、析出等現(xiàn)象，需降低受試物濃度重新檢測(cè)或停止檢測(cè)。將96孔板震蕩5s后，使用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定光照前SO檢測(cè)孔在440nm下的吸光度及SA檢測(cè)孔在560nm下的吸光度。7.3將96孔板置于石英反應(yīng)器中，或蓋上其他具有高UV透射率的蓋子或密封件，置于太陽(yáng)光模擬器中照射1h。記錄光照前后的溫度。7.4完成光照后，將96孔板震蕩1min，使用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定光照后SO檢測(cè)孔在440nm下的吸光度及SA檢測(cè)孔在560nm下的吸光度。步驟流程圖見附錄E8分析結(jié)果表述8.1SO值和SA值的計(jì)算計(jì)算受試物及對(duì)照品的SO值和SA值，根據(jù)三個(gè)平行孔的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。1．根據(jù)光照前后SO測(cè)試孔在440nm下的吸光度計(jì)算受試物的SO值SO式中：A440(-)：光照前440nm下的吸光度A440(+)：光照后440nm下的吸光度a：光照前空白對(duì)照440nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對(duì)照440nm下的吸光度（平均值）2．根據(jù)光照前后SA測(cè)試孔在560nm下的吸光度計(jì)算受試物的SA值SA式中：A560(-)：光照前560nm下的吸光度A560(+)：光照后560nm下的吸光度a：光照前空白對(duì)照560nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對(duì)照560nm下的吸光度（平均值）8.2試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：1．光照前，反應(yīng)混合物中沒有受試物沉淀。2．光照前后，受試物對(duì)反應(yīng)混合物沒有顏色干擾。3．試驗(yàn)過(guò)程中溫度控制在20℃~29℃范圍內(nèi)。4．所有測(cè)試孔A440及A560應(yīng)在0.02~1.5范圍內(nèi)。5．應(yīng)根據(jù)歷史數(shù)據(jù)平均值±2標(biāo)準(zhǔn)偏差建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)控范圍。以下為根據(jù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得出的95%置信區(qū)間：200μmol/L奎寧鹽酸鹽二水合物200μmol/L二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至28.3受試物的光反應(yīng)性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判受試物的光反應(yīng)性：分類樣品濃度SOSA具有光反應(yīng)性200μmol/L≥25和≥70<25和/或有干擾和≥70≥25和<70和/或有干擾具有弱光反應(yīng)性200μmol/L<25和≥20，<70具有光反應(yīng)性20μmol/L≥25和≥20無(wú)光反應(yīng)性200μmol/L<25和<20不確定不屬于上述任何一種情況如受試物在200μmol/L和20μmol/L濃度下均有沉淀、著色或其他干擾，則認(rèn)為該受試物不適用于本方法，受試物的光反應(yīng)性不確定。9其他限制說(shuō)明在活性氧（ROS）檢測(cè)過(guò)程中，會(huì)發(fā)生如下兩個(gè)反應(yīng)：?jiǎn)尉€態(tài)氧和咪唑反應(yīng)生成的過(guò)氧化物中間體對(duì)N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用；超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）反應(yīng)生成NBT+。該方法不適用于對(duì)上述兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生干擾的化學(xué)品測(cè)試，例如，抗壞血酸和其他還原性化學(xué)品，它們會(huì)將四唑鹽直接還原為甲瓚，抗壞血酸還加速咪唑衍生物的氧化，在ROS測(cè)定中提供假陽(yáng)性預(yù)測(cè)。

附錄A參考化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果可接受范圍表117種參考化學(xué)物質(zhì)SO值和SA值測(cè)定數(shù)據(jù)的可接受范圍。編號(hào)化學(xué)物名稱CAS編號(hào)SOSA溶劑濃度1對(duì)氨基苯甲酸150-13-0-8~12-11~7DMSO200μmol/L2對(duì)氨基苯甲酸乙酯94-09-7-7~9-7~17DMSO200μmol/L3鹽酸多西環(huán)素10592-13-9115~429230~468DMSO200μmol/L4紅霉素114-07-8-15~11-9~21DMSO200μmol/L5非諾貝特49562-28-977~203-31~11DMSO20μmol/L6L-組氨酸71-00-1-8~128~120NaPB200μmol/L7諾氟沙星70458-96-7131~27157~161DMSO200μmol/L88-甲氧基補(bǔ)骨脂素298-81-731~1370~126DMSO200μmol/L9水楊酸異辛酯118-60-5-5~11-8~20DMSO20μmol/L10吖啶260-94-6182~328121~243DMSO200μmol/L11鹽酸氯丙嗪69-09-0-56~7066~106DMSO200μmol/L12雙氯芬酸鈉15307-79-634~41647~437DMSO200μmol/L13呋噻米54-31-931~225-7~109DMSO200μmol/L14酮基布洛芬22071-15-4120~34677~151DMSO200μmol/L15萘啶酮酸389-08-254~24688~470DMSO200μmol/L16奧美拉唑73590-58-6-221~10330~216DMSO200μmol/L17鹽酸異丙嗪58-33-320~168-3~77DMSO200μmol/L

附錄B太陽(yáng)光模擬器光譜分布圖1推薦的兩種太陽(yáng)光模擬器的光譜能量分布

附錄C石英反應(yīng)容器聚四氟乙烯板聚四氟乙烯板石英片石英片固定夾多孔板固定夾多孔板圖2石英反應(yīng)容器推薦規(guī)格圖示石英蓋板推薦厚度為3mm附錄D96孔板加樣示意圖96孔板加樣示例如下：123456789101112A單線態(tài)氧SO檢測(cè)孔BBPNT1T2T3T4T5T6T7CBPNT1T2T3T4T5T6T7DBPNT1T2T3T4T5T6T7EBPNT1T2T3T4T5T6T7FBPNT1T2T3T4T5T6T7GBPNT1T2T3T4T5T6T7超氧陰離子SA檢測(cè)孔注：1.B為空白對(duì)照；2.P為陽(yáng)性對(duì)照（奎寧鹽酸鹽二水合物），N為陰性對(duì)照（二苯甲酮-4）；3.T1-T7為第1至第7種受試物。

附錄E試驗(yàn)流程圖將各反應(yīng)成分在避光條件下混合↓混合（渦旋或者超聲5-10分鐘）↓200μL混合物加入到96孔板中（每組3個(gè)平行）↓100倍顯微鏡下檢查溶解情況↓震蕩5s后，檢測(cè)440nm和560nm吸光度↓光照1小時(shí)↓震蕩1min后，檢測(cè)440nm和560nm吸光度附件6體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗(yàn)方法U937CellLineActivationTest1范圍本方法規(guī)定了體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗(yàn)的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品用化學(xué)原料潛在致敏性的評(píng)價(jià)。2試驗(yàn)?zāi)康谋驹囼?yàn)用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)變化，以評(píng)價(jià)受試物引起皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性。3定義3.170%細(xì)胞存活率濃度值70%cellviability（CV70）受試物染毒后，細(xì)胞存活率為70%時(shí)對(duì)應(yīng)的受試物濃度值。3.2刺激指數(shù)stimulationindex（S.I.）與溶劑對(duì)照相比，扣除同型對(duì)照后流式細(xì)胞儀測(cè)定的受試物陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)強(qiáng)度值。3.3CD86有效作用濃度值EffectiveConcentration150（EC150）CD86的相對(duì)熒光強(qiáng)度值達(dá)到150時(shí)對(duì)應(yīng)的受試物濃度值。4試驗(yàn)的基本原則當(dāng)致敏物質(zhì)接觸皮膚后，樹突狀細(xì)胞在移動(dòng)到淋巴器官的過(guò)程中分化成熟，并上調(diào)一系列表面分子的表達(dá)。體外培養(yǎng)類樹突狀細(xì)胞：人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，并和受試物共暴露48h后，使用熒光抗體染料對(duì)細(xì)胞表面分子CD86染色并用流式細(xì)胞儀測(cè)定，從而評(píng)價(jià)受試物是否具有致敏性。5試劑5.1細(xì)胞選用人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞（Thehumanhistiocyticlymphomacellline，U937細(xì)胞）。細(xì)胞使用前應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。推薦使用cloneCRL1593.2細(xì)胞株。5.2培養(yǎng)基RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、適量抗生素，配制成1640完全培養(yǎng)基。5.3染色緩沖液磷酸鹽緩沖液中加入5%的胎牛血清。5.4染料和抗體類物質(zhì)7-氨基放線素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidiumiodide,PI）FITC標(biāo)記的小鼠單克隆CD86抗體（FITC-CD86）FITC標(biāo)記的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6試驗(yàn)方法6.1細(xì)胞準(zhǔn)備6.1.1細(xì)胞培養(yǎng)U937懸浮細(xì)胞使用1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞復(fù)蘇一周并通過(guò)穩(wěn)定性檢測(cè)后可開展試驗(yàn)。細(xì)胞最大培養(yǎng)濃度不超過(guò)2×106個(gè)/mL，復(fù)蘇后使用不超過(guò)6周，傳代次數(shù)不超過(guò)21代。6.1.2細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)細(xì)胞復(fù)蘇兩周后，選用松香酸（AA）或2,4,6-三硝基苯磺酸作為陽(yáng)性對(duì)照，乳酸（LA）作為陰性對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞可以準(zhǔn)確對(duì)陽(yáng)性物質(zhì)和陰性物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定區(qū)分時(shí)視為通過(guò)穩(wěn)定性檢測(cè)。6.2受試物處理溶劑：完全培養(yǎng)基（優(yōu)先選擇）或二甲基亞砜（DMSO）受試物儲(chǔ)備液：第一次運(yùn)行至少選擇6個(gè)濃度。于試驗(yàn)前一天制備，應(yīng)用1640完全培養(yǎng)基配制0.4mg/mL的受試物溶液，或者應(yīng)用DMSO配制50mg/mL的受試物溶液。由于沒有進(jìn)行劑量測(cè)定，因此在第一次運(yùn)行時(shí)，應(yīng)在相應(yīng)的溶劑中配制6種系列濃度儲(chǔ)備液（最終濃度為1、10、20、50、100和200μg/mL）。受試物工作液：于試驗(yàn)當(dāng)天制備，用完全培養(yǎng)基配制的受試物溶液可以直接使用，用DMSO配制的受試物溶液需用完全培養(yǎng)基稀釋125倍得到工作溶液。將工作液等體積加入細(xì)胞懸液中進(jìn)行染毒，即最終細(xì)胞接觸濃度是工作液濃度再稀釋2倍。連續(xù)運(yùn)行的濃度選擇：基于第一次運(yùn)行的結(jié)果選擇至少4個(gè)第二次運(yùn)行的濃度，任何后續(xù)運(yùn)行的濃度都是基于之前所有運(yùn)行的單個(gè)結(jié)果來(lái)選擇。由于濃度間隔設(shè)置較小會(huì)影響濃度效應(yīng)，所以建議以下推薦使用的最終濃度(單位：μg/mL)進(jìn)行試驗(yàn)：1、2、3、4、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200。如果以上濃度無(wú)法測(cè)得受試物的70%細(xì)胞存活率濃度值（70%cellviability，CV70），可以進(jìn)行濃度調(diào)整。但受試物最終細(xì)胞接觸濃度最高不超過(guò)200μg/mL；如果CD86的陽(yáng)性值在1μg/mL，則對(duì)0.1μg/mL進(jìn)行評(píng)估，以確認(rèn)不會(huì)導(dǎo)致CD86超過(guò)陽(yáng)性閾值的受試物的濃度；DMSO最終接觸濃度不得超過(guò)0.4%。選擇標(biāo)準(zhǔn)：至少2個(gè)濃度與前一次試驗(yàn)相同；確認(rèn)非細(xì)胞毒性下的最高CD86陰性濃度;確認(rèn)所有非細(xì)胞毒性CD86陽(yáng)性濃度；確認(rèn)最低細(xì)胞毒性濃度；在EC150(或最高陰性非細(xì)胞毒性濃度)和CV70（或溶解度評(píng)估允許的最高濃度）之間均勻選擇其他所需濃度；若前兩次運(yùn)行有差異，盡可能選擇多的共同濃度；若存在干擾，需重新選擇陽(yáng)性濃度。6.3對(duì)照物處理培養(yǎng)基對(duì)照、溶劑對(duì)照（與受試物同法稀釋）、陽(yáng)性對(duì)照松香酸（DMSO溶解，最終濃度50μg/mL）、陰性對(duì)照LA（完全培養(yǎng)基溶解，最終濃度200μg/mL），每種對(duì)照需要準(zhǔn)備三對(duì)復(fù)孔。6.4細(xì)胞鋪板及染毒以3x105個(gè)/mL細(xì)胞傳代培養(yǎng)2天或以1.5x105個(gè)/mL傳代培養(yǎng)3天后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，取100μL/孔受試物工作液和100μL/孔細(xì)胞懸液1:1混合接種于96孔無(wú)菌平板中，每種條件下一對(duì)復(fù)孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgG1同型對(duì)照染色。每次CD86表達(dá)檢測(cè)均需設(shè)置培養(yǎng)基對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各三對(duì)復(fù)孔（當(dāng)使用培養(yǎng)基作為溶劑時(shí)，溶劑對(duì)照與培養(yǎng)基相同），用密封帶蓋住板，在37±2°C，5±1%CO2，≥95%濕度下培養(yǎng)孵育45h±3h。6.5CD86表達(dá)檢測(cè)孵育結(jié)束后，檢查并確定溶解度（若在顯微鏡下觀察到晶體或液滴，則會(huì)產(chǎn)生干擾）。用排槍將細(xì)胞吹兩下從96孔平板對(duì)應(yīng)移至V型板中，離心棄上清；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重懸細(xì)胞；用7-AAD染色細(xì)胞（5μL/孔，10min室溫，避光）；用100μL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100μL染色緩沖液中重新懸浮細(xì)胞；用FITC標(biāo)記的抗CD86或小鼠IgG1（5μL/孔，30min，4°C，避光）染色細(xì)胞；用100μL冰冷染色緩沖液清洗兩次；用100μL冰冷PBS清洗一次；在冰冷PBS中再懸浮細(xì)胞（96孔板中100μL或流式管中200μL）。注意：整個(gè)染色操作應(yīng)在冰上進(jìn)行，在每一個(gè)洗滌步驟中，不要通過(guò)反復(fù)的移液來(lái)重懸細(xì)胞，而是在棄去上清液后通過(guò)短暫的渦旋來(lái)分散細(xì)胞即可。用流式細(xì)胞儀對(duì)每組細(xì)胞的細(xì)胞存活率及CD86陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行測(cè)定。分別用以下用公式計(jì)算出受試物的細(xì)胞存活率（CV70）和受試物的細(xì)胞刺激指數(shù)（S.I.）。CV70=C1+V1：大于70%最小細(xì)胞活性值V2：小于70%最大細(xì)胞活性值C1（μg/mL）：V1對(duì)應(yīng)的受試物濃度C2（μg/mL）：V2對(duì)應(yīng)的受試物濃度S.I.=CD86+%：CD86陽(yáng)性細(xì)胞百分比6.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)繪制SSC/FSC散點(diǎn)圖，調(diào)節(jié)儀器電壓，圈出U937細(xì)胞群P1門；繪制7-AAD直方圖，圈出活細(xì)胞P2門；繪制FITC/SSC散點(diǎn)圖，放置十字門，分析細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)。通過(guò)獲取完全培養(yǎng)基/IgG1孔表達(dá)值，設(shè)置FITC/SSC十字門分析標(biāo)記，以便在可能的情況下，所有三個(gè)或至少兩個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的IgG1位于0.6至0.9%區(qū)域內(nèi)；如果這無(wú)法實(shí)現(xiàn)，則設(shè)置分析標(biāo)記，使一個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的IgG1在0.6至0.9%，另一個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的IgG1在0.9%至1.5%；如果這仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)，則IgG1數(shù)據(jù)分布太廣，必須放棄運(yùn)行。之后在不移動(dòng)分析標(biāo)記的情況下，測(cè)量每個(gè)孔中IgG1陽(yáng)性細(xì)胞或CD86陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。細(xì)胞顯示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散點(diǎn)圖中，設(shè)置為對(duì)數(shù)比例（Log），以便清楚地識(shí)別第一門R1門中的（population）細(xì)胞群和消除碎片。設(shè)置流式細(xì)胞儀，每孔獲得P1門細(xì)胞10000個(gè)或包括死亡細(xì)胞在內(nèi)的多達(dá)20,000個(gè)細(xì)胞，或在分析開始后1min內(nèi)獲取數(shù)據(jù)。7結(jié)果評(píng)價(jià)7.1試驗(yàn)成立條件7.1.1完全培養(yǎng)基對(duì)照細(xì)胞平均存活率>90%；至少兩個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的IgG1≥0.6且<1.5%；若丟棄一個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的離群值后，剩下的兩個(gè)完全培養(yǎng)基對(duì)照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；完全培養(yǎng)基對(duì)照校正后的CD86基礎(chǔ)表達(dá)值≥2%且≤25%。7.1.2DMSO溶劑對(duì)照的平均存活率>90%；若丟棄一個(gè)DMSO對(duì)照的異常值后，剩下的兩個(gè)DMSO對(duì)照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；丟棄異常值后，DMSO溶劑對(duì)照CD86S.I.的平均值小于250%。7.1.3陽(yáng)性對(duì)照三對(duì)復(fù)孔中至少兩個(gè)為陽(yáng)性（CD86S.I.≥150），必要時(shí)配制陽(yáng)性對(duì)照系列濃度，應(yīng)存在劑量反應(yīng)。7.1.4陰性對(duì)照三對(duì)復(fù)孔中至少有兩個(gè)為陰性（CD86S.I.<150%），且細(xì)胞活性≥70%。7.1.5溶解度干擾：受試物處理后45±3h(細(xì)胞染色前)在顯微鏡下觀察到晶體或滴狀，則提示測(cè)試受到受試物溶解度干擾。7.1.6顏色干擾：受試物FITC標(biāo)記IgG1散點(diǎn)圖如發(fā)生位置偏移，則提示測(cè)試受到受試物顏色干擾（IgG1熒光通道幾何平均數(shù)S.I.≥150%）。7.2致敏性結(jié)果判定每種受試物至少進(jìn)行兩次獨(dú)立的CD86表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)。每種受試物表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)，如果CD86S.I.僅在最高非細(xì)胞毒性濃度下高于150%，則在第一次試驗(yàn)中無(wú)法判定。每次表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)，如果CD86S.I.在所有非細(xì)胞毒性濃度下低于150%，且無(wú)干擾（溶解度、顏色、細(xì)胞毒性），則該次CD86表達(dá)判定為陰性；如果CD86S.I.高于150%，不論有無(wú)劑量反應(yīng)和/或干擾，則該次CD86表達(dá)均判定為陽(yáng)性。如果兩次試驗(yàn)CD86表達(dá)結(jié)果一致，則可判定該受試物是否具有致敏性；如果兩次試驗(yàn)CD86表達(dá)不具有一致性，則需進(jìn)行第三次試驗(yàn)。如果第一次試驗(yàn)無(wú)法判定，第二次與第三次結(jié)果不一致，則需進(jìn)行第四次試驗(yàn)。最終的預(yù)測(cè)將基于三次或四次單獨(dú)運(yùn)行的結(jié)果來(lái)綜合判定。7.3有效作用濃度計(jì)算對(duì)于判定具有致敏性的物質(zhì)，進(jìn)一步計(jì)算其有效作用濃度值（EffectiveConcentration，EC），選用以下公式計(jì)算CD86的有效作用濃度值（EC150）。EC150=C1+S.I.1:S.I.<150（EC150）最低刺激指數(shù)值S.I.2:S.I.≥150（EC150）最低刺激指數(shù)值C1（μg/mL）:S.I.1對(duì)應(yīng)的受試物濃度C2（μg/mL）:S.I.2對(duì)應(yīng)的受試物濃度8結(jié)果解釋本試驗(yàn)結(jié)果能預(yù)測(cè)受試物的致敏性，可作為皮膚致敏性整合測(cè)試和評(píng)估方法（IATA）中的檢測(cè)方法之一，這些結(jié)果在有限的范圍內(nèi)外推到人類。附件7皮膚吸收體內(nèi)試驗(yàn)方法SkinAbsorption:inVivoMethod1范圍本方法規(guī)定了化妝品原料皮膚吸收體內(nèi)試驗(yàn)方法的術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。本方法適用于化妝品原料經(jīng)皮吸收的體內(nèi)試驗(yàn)。本試驗(yàn)方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，需要提供更多的科學(xué)依據(jù)說(shuō)明其可行性。2試驗(yàn)?zāi)康谋痉椒U述了化妝品原料經(jīng)皮吸收的體內(nèi)試驗(yàn)方法，以便為化妝品原料的毒性分類、標(biāo)簽標(biāo)識(shí)和應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。3定義3.1未吸收劑量unabsorbeddose染毒后，從皮膚表面洗脫下來(lái)的和附著在遮蓋裝置上受試物的量，還包括在染毒過(guò)程中從皮膚表面揮發(fā)的量。3.2吸收劑量（體內(nèi)）absorbeddose（invivo）去除受試部位皮膚的受試物后，包括在尿液、籠具沖洗液、糞便、呼出氣體（若有測(cè)試）、血液、各種組織（若有采集）以及保留在尸體中受試物的量。3.3可吸收劑量absorbabledose皮膚沖洗后，存留在皮膚表面或皮膚組織內(nèi)受試物的量。4試驗(yàn)的基本原則受試物（最好用放射性同位素標(biāo)記）施用于動(dòng)物去毛的皮膚上，試驗(yàn)設(shè)定具有代表性的一個(gè)或多個(gè)劑量組。在預(yù)定的染毒時(shí)間內(nèi)，采用適宜的（非封閉、半封閉式或封閉式）遮蓋裝置覆蓋染毒部位以防止動(dòng)物舔舐試驗(yàn)樣品，并讓受試制備物與動(dòng)物皮膚持續(xù)接觸染毒一段時(shí)間。在染毒結(jié)束時(shí)，去除遮蓋裝置并用適宜的清潔劑清洗動(dòng)物皮膚，保留用過(guò)的遮蓋裝置和清洗液以備分析測(cè)定，并換上新的遮蓋裝置。在染毒前、染毒期間和染毒結(jié)束后，試驗(yàn)動(dòng)物均需在單獨(dú)的代謝籠中飼養(yǎng)，并收集其排泄物和呼出氣體以備分析測(cè)定。如果有充足的證據(jù)表明極少產(chǎn)生或不產(chǎn)生揮發(fā)性的放射性代謝產(chǎn)物，則可以不收集動(dòng)物呼出氣體。通常，每個(gè)劑量組內(nèi)設(shè)幾個(gè)動(dòng)物試驗(yàn)組，一組在染毒結(jié)束后立即處死，其他組依次在預(yù)定時(shí)間間隔點(diǎn)處死。每一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)處死的試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)采集血樣以及受試部位皮膚進(jìn)行分析，并分析動(dòng)物尸體以確定未被排泄的受試物的量。采集的樣品以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行分析，并對(duì)受試物經(jīng)皮吸收的程度進(jìn)行評(píng)估。5試驗(yàn)方法5.1受試物受試物是指被用于研究其滲透特性的物質(zhì)。受試物最好用放射性同位素標(biāo)記。制備的受試物（包括純品、稀釋品或者直接施用于皮膚的包含受試物的制備物）應(yīng)與人體或者其他潛在目標(biāo)種屬可能的暴露形態(tài)一致（或是理想的替代物）；制備過(guò)程中出現(xiàn)任何不同于實(shí)際使用情形的改變必須有充分的理由。必要時(shí)，受試物可溶解或者懸浮于適當(dāng)?shù)娜苊街?，?duì)于非水性溶媒，應(yīng)了解其吸收特性以及與受試物的潛在相互作用。5.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境5.2.1動(dòng)物物種、品系的選擇大鼠是最常用種屬，但也可使用皮膚吸收速率與人類更相似的無(wú)毛系列動(dòng)物品系。一般選用年輕成年健康的單性別動(dòng)物（通常用雄性）。試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過(guò)平均體重的±20%。如雄性大鼠的適宜體重為200g~250g，在該體重范圍的上半?yún)^(qū)內(nèi)更好。5.2.2性別和數(shù)量通常，由單一性別的至少4只動(dòng)物組成一個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)測(cè)試樣品的每個(gè)預(yù)定觀察終點(diǎn)需設(shè)一組。試驗(yàn)中的每個(gè)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)處死一組動(dòng)物，比如在染毒結(jié)束時(shí)間點(diǎn)（通常是6h或24h）和后續(xù)觀察期結(jié)束時(shí)間點(diǎn)（例如48h和72h）。若已有資料表明受試物的經(jīng)皮毒性存在明顯的性別差異，則應(yīng)選用更敏感的性別，否則可任選一種。5.2.3飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。試驗(yàn)期間（最好也包括試驗(yàn)之前的適應(yīng)期）動(dòng)物應(yīng)在代謝籠中單籠飼養(yǎng)，盡量避免食物和水溢出容器影響試驗(yàn)結(jié)果。5.3試驗(yàn)步驟5.3.1試驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備試驗(yàn)開始前，每只動(dòng)物應(yīng)做好標(biāo)記加以區(qū)別，并在各自的籠具中至少飼養(yǎng)5天以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。然后，在染毒前約24h，將每只動(dòng)物肩部和背部局部皮膚去毛，并用丙酮輕輕擦拭皮膚表面以去除皮脂，因肥皂殘留物有可能促進(jìn)皮膚對(duì)測(cè)試物的吸收，故不推薦用肥皂水清洗皮膚。剃毛面積應(yīng)足夠大，以確保能可靠地計(jì)算出每平方厘米皮膚對(duì)受試物的吸收量，剃毛皮膚面積應(yīng)該至少為10cm2，該面積對(duì)于體重在200g~250g范圍內(nèi)的大鼠是適宜的。動(dòng)物準(zhǔn)備完成后，重新放回代謝籠。5.3.2皮膚染毒在皮膚表面確定特定面積的受試部位，將已知量的受試制備物均勻地涂抹于該部位。用量通常應(yīng)采用人體可能的接觸量，固體受試物通常為1~5mg/cm2，液體受試物最多可達(dá)10μL/cm2?？筛鶕?jù)受試物預(yù)期的使用情況、研究目的以及物理性質(zhì)調(diào)整染毒劑量，但應(yīng)有適當(dāng)理由。染毒后，受試部位應(yīng)避免被觸碰。通常，受試部位應(yīng)采用非閉合的遮蓋裝置覆蓋（如透氣尼龍紗布罩），典型裝置的示例如圖1所示。某些特定情況下，受試部位應(yīng)采取閉合性保護(hù)。若半揮發(fā)性測(cè)試物質(zhì)的揮發(fā)導(dǎo)致受試物的回收率超出可接受的范圍（另見5.4），應(yīng)在受試物裝置上覆蓋活性炭過(guò)濾器以捕獲揮發(fā)的受試物（見圖1）。任何覆蓋裝置都不應(yīng)損傷皮膚，也不能吸收或與受試制備物發(fā)生反應(yīng)。染毒后，將動(dòng)物放回單獨(dú)的代謝籠中以便收集排泄物。圖1一種用于覆蓋和保護(hù)受試部位皮膚的典型遮蓋裝置設(shè)計(jì)示例圖5.3.3染毒時(shí)間和取樣染毒期是指在皮膚開始接觸受試物，至清洗去除受試物之間的時(shí)間間隔。所采用的染毒時(shí)間（一般為6h或24h）應(yīng)與通常人體可能的接觸時(shí)間相對(duì)應(yīng)。染毒結(jié)束后，將動(dòng)物飼養(yǎng)于代謝籠中保留直至預(yù)定的處死時(shí)間點(diǎn)。染毒結(jié)束后，應(yīng)對(duì)受試皮膚進(jìn)行觀察并記錄任何可見的刺激癥狀。在整個(gè)研究過(guò)程中，應(yīng)采用代謝籠分別收集尿液和糞便，并可在14C-標(biāo)記的二氧化碳和揮發(fā)性14C化合物（>5%）產(chǎn)生時(shí)進(jìn)行收集和定量分析。尿液、糞便和捕獲液（如14C標(biāo)記的二氧化碳和揮發(fā)性14C化合物）應(yīng)在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)從每組中單獨(dú)收集。若有足夠的資料證明很少或幾乎不產(chǎn)生放射性代謝物，則可采用開放式籠架。整個(gè)試驗(yàn)期間，應(yīng)定期觀察動(dòng)物的毒性或異常反應(yīng)。染毒期，從開始皮膚接觸后至24h以及隨后的每一天，均應(yīng)收集排泄物直至試驗(yàn)結(jié)束。一般而言，采集三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的排泄物通常就足夠了，但某些受試制備物的特征或現(xiàn)有動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可能會(huì)要求有更適宜、或更多的收集時(shí)間點(diǎn)以便研究。染毒結(jié)束時(shí)，從每只動(dòng)物身上移去保護(hù)裝置并單獨(dú)保留以便試驗(yàn)分