幾丁質(zhì)酶OfChtⅡ和O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶hOGA的晶體結(jié)構(gòu)及活性抑制

幾丁質(zhì)酶OfChtⅡ和O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶hOGA的晶體結(jié)構(gòu)及活性抑制糖苷水解酶(glycosidehydrolases,GH)是一類負(fù)責(zé)催化含糖化合物中糖苷鍵斷裂的酶,在自然界中廣泛存在。GH18家族幾丁質(zhì)酶和GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是其中重要的兩類,它們都采用了底物輔助保留催化機(jī)理。GH18家族幾丁質(zhì)酶廣泛分布于細(xì)菌、真菌、線蟲、植物、節(jié)肢動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi),主要負(fù)責(zé)水解環(huán)境中或生物體自身的幾丁質(zhì),在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、病原入侵、胚胎發(fā)育、昆蟲蛻皮和免疫防御等多種生命活動(dòng)中都發(fā)揮了重要的作用。對(duì)昆蟲而言,幾丁質(zhì)是其外骨骼、氣管和中腸圍食膜的重要結(jié)構(gòu)組分,因此幾丁質(zhì)酶對(duì)于昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。在昆蟲眾多的幾丁質(zhì)酶中,II分支幾丁質(zhì)酶(ChtII)是其中結(jié)構(gòu)域數(shù)目最多、分子量最大的一種。鱗翅目昆蟲中,ChtII與I分支幾丁質(zhì)酶(ChtI)和幾丁質(zhì)酶h(Chi-h)共同參與蛻皮過程中表皮幾丁質(zhì)的水解,雖然ChtI和Chi-h的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)得到了很好的研究,但ChtII的結(jié)構(gòu)仍不清楚。目前ChtII的研究集中在基因水平,通過RNA干擾使ChtII基因表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致昆蟲蛻皮障礙并死亡,因此ChtII可以作為一個(gè)潛在的殺蟲劑靶標(biāo),而ChtII抑制劑的研究也有助于新型農(nóng)藥的開發(fā)。GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)水解O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)翻譯后修飾的糖苷水解酶,對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)正常的O-GlcNAc水平至關(guān)重要。O-GlcNAc是真核生物中一種重要的動(dòng)態(tài)翻譯后修飾,參與細(xì)胞內(nèi)包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄翻譯和細(xì)胞循環(huán)在內(nèi)的多種重要生理過程,O-GlcNAc水平的失調(diào)與多種疾病密切相關(guān),如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等。O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶不僅能通過調(diào)控O-GlcNAc水平直接影響相關(guān)的生理過程,而且能通過O-GlcNAc與磷酸化修飾的相互作用間接影響更多的信號(hào)通路。因此,O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶的抑制劑在研究和治療O-GlcNAc失調(diào)引發(fā)的相關(guān)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本論文以農(nóng)業(yè)害蟲亞洲玉米螟來(lái)源的GH18家族幾丁質(zhì)酶(OfChtⅡ)和人來(lái)源的GH84家族的O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(hOGA)作為研究對(duì)象,主要獲得以下結(jié)果:(1)獲得了OfChtⅡ的基因和蛋白序列根據(jù)不同昆蟲ChtⅡ的保守序列設(shè)計(jì)引物,經(jīng)過同源序列獲取從亞洲玉米螟成蟲的cDNA中克隆獲得了OfChtⅡ的基因序列9077bp,GenBank登錄號(hào)為MF034108.1。其中編碼區(qū)為157-8943位核苷酸,編碼2929個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)為AS066823.1。序列分析發(fā)現(xiàn)OfChtⅡ有5個(gè)屬于GH18家族的特征結(jié)構(gòu)域以及7個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。5個(gè)GH18家族特征結(jié)構(gòu)域中有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的催化殘基發(fā)生突變,只有靠近C端的第二和第三個(gè)GH18結(jié)構(gòu)域有催化活性。(2)OfChtⅡ截短體的水解活性和結(jié)構(gòu)特征全長(zhǎng)的OfChtⅡ不穩(wěn)定且難以在體外重組表達(dá),因此我們重組表達(dá)了四個(gè)截短體:OfChtⅡ-C1,OfChtⅡ-C2,OfChtⅡ-C1C2和OfChtⅡ-B4C1。水解活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OfChtⅡ截短體對(duì)小分子底物的水解活性低,而對(duì)高聚底物的活性隨著結(jié)構(gòu)域數(shù)目的增加而升高,說明OfChtⅡ全長(zhǎng)在水解高聚底物時(shí)具有很大的潛力。通過懸滴蒸汽擴(kuò)散法獲得了OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2蛋白及蛋白-底物的晶體結(jié)構(gòu),二者的蛋白結(jié)構(gòu)具有很高的結(jié)構(gòu)相似性,都具有一個(gè)(β/α)8TIM桶組成的核心結(jié)構(gòu)域和一個(gè)幾丁質(zhì)插入結(jié)構(gòu)域。OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2的表面都存在著一條芳香族殘基組成的長(zhǎng)且深的底物結(jié)合裂縫,兼具OfChtⅠ和OfChi-h底物結(jié)合裂縫的結(jié)構(gòu)特征。但是,OfChtⅡ的活性口袋外部缺乏有利于晶態(tài)幾丁質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)元件,不過它的多個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域可能會(huì)彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。(3)OfChtⅡ小分子抑制劑的篩選和抑制機(jī)理研究篩選獲得了OfChtⅡ的多個(gè)小分子抑制劑,通過復(fù)合物晶體對(duì)部分抑制劑的抑制機(jī)理進(jìn)行了研究。其中殼八糖(G1cN)8占據(jù)了底物結(jié)合裂縫的-3到+5位點(diǎn),主要通過糖環(huán)與芳香族殘基的疏水堆積作用結(jié)合;聯(lián)吡啶并嘧啶類化合物2-8-S2結(jié)合在底物結(jié)合裂縫的+1和+2位之間,兩個(gè)2-8-S2分子通過π-π堆積與兩個(gè)保守的色氨酸形成一種雙側(cè)夾心結(jié)構(gòu)。(4)hOGA的小分子抑制劑設(shè)計(jì)和抑制機(jī)理研究設(shè)計(jì)合成了一系列具有新型骨架結(jié)構(gòu)的hOGA小分子抑制劑,包括NAG-噻唑啉的2-位衍生物,甘露糖構(gòu)型的NAM-噻唑啉衍生物和硫苷-萘酰亞胺雜合物分子。測(cè)定了化合物對(duì)GH20家族和GH84家族糖苷水解酶的活性和選擇性,通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子對(duì)接