谷實(shí)夜蛾腸道微生物介導(dǎo)番茄植株防御反應(yīng)及其機(jī)理的研究

谷實(shí)夜蛾腸道微生物介導(dǎo)番茄植株防御反應(yīng)及其機(jī)理的研究昆蟲腸道內(nèi)棲息著大批微生物,這些微生物攜帶著與宿主昆蟲相關(guān)的遺傳信息,并能夠影響昆蟲的行為和生理狀況。盡管已有部分研究發(fā)現(xiàn)昆蟲腸道共生微生物能夠介導(dǎo)植物的防御反應(yīng),但這些研究的主要對(duì)象集中在甲蟲或者一些刺吸式昆蟲上,而對(duì)鱗翅目昆蟲腸道共生微生物調(diào)控植物防御反應(yīng)的研究截至到目前仍然比較缺乏。本研究首先利用16SrRNA測(cè)序和MALDI-TOF質(zhì)譜法等方法鑒定從野外玉米地采集的谷實(shí)夜蛾（Helicoverpazea）（鱗翅目夜蛾科）腸道回流液中分離得到腸道相關(guān)的細(xì)菌微生物。分別通過對(duì)番茄植株和室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾進(jìn)行細(xì)菌的接種侵染,檢測(cè)被侵染后番茄植株中多酚氧化酶（Polyphenoloxidase,PPO）活性和被侵染后室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾幼蟲唾液腺中葡萄糖氧化酶（Glucoaseoxidase,GOX）活性,從而找到對(duì)兩者均有作用效果的細(xì)菌菌株。通過酶活性檢測(cè)、生物測(cè)定、熒光定量PCR、激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)、SDS、Westernblot蛋白質(zhì)雜交等方法,研究被路德維希腸桿菌（Enterobacterludwigii,E.ludwigii）接種侵染后的谷實(shí)夜蛾對(duì)番茄植株中防御信號(hào)所調(diào)控的基因表達(dá),相關(guān)防御酶活性以及植物激素含量的影響。然后,利用SDS和Westernblot研究了E.ludwigii接種侵染對(duì)谷實(shí)夜蛾在番茄葉片上分泌GOX的影響。最后,通過激光共聚焦顯微鏡研究了E.ludwigii接種侵染對(duì)谷實(shí)夜蛾在番茄葉片上分泌腸道回流液的影響,并利用所設(shè)計(jì)的E.ludwigii特異性引物檢測(cè)E.ludwigii是否可以通過谷實(shí)夜蛾腸道回流液等方式與番茄葉片接觸。本研究從生理生化和分子水平上證實(shí)谷實(shí)夜蛾腸道相關(guān)細(xì)菌主要通過影響其宿主昆蟲唾液中葡萄糖氧化酶等成分來間接影響番茄植株抗蟲誘導(dǎo)防御反應(yīng),研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.來源于田間和實(shí)驗(yàn)室的谷實(shí)夜蛾腸道相關(guān)細(xì)菌分離與鑒定采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法分別培養(yǎng)了從田間采集和實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾幼蟲中收集腸道回流液,首先發(fā)現(xiàn)野外采集的谷實(shí)夜蛾單位體積腸道回流液中的細(xì)菌群落總數(shù)明顯多于室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾單位體積腸道回流液中的細(xì)菌群落總數(shù)。然后再結(jié)合16SrRNA測(cè)序和biotyper等鑒定方法,16種從田間采集的谷實(shí)夜蛾中分離到菌株被送去測(cè)序和鑒定,得到14種不同種菌株。其中屬于Enterobacter有5種菌種,有4種菌株屬于Pantoea,屬于Rahnella有2種,剩下的菌株分別屬于Erwinia、Klebsiella、Raoultella和Serratia。然而,從室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾腸道回流液中選擇的8個(gè)菌種被送去測(cè)序和鑒定,發(fā)現(xiàn)這8個(gè)菌種均屬于Enterococcus,并且這些菌株序列高度相似。2.谷實(shí)夜蛾腸道相關(guān)細(xì)菌的篩選首先發(fā)現(xiàn)從田間采集的谷實(shí)夜蛾幼蟲唾液腺中GOX活性顯著高于室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾唾液腺中GOX活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否唾液腺體中GOX活性與腸道細(xì)菌的功能,將從田間采集的谷實(shí)夜蛾分離得到的腸道相關(guān)微生物重新接種到室內(nèi)飼養(yǎng)的谷實(shí)夜蛾幼蟲,發(fā)現(xiàn)14種菌株中有4種可以提高幼蟲唾液腺體中GOX活性,它們分別為3-1,（Rahnellaaquatilis）、2b（E.ludwigii）、5-1（Enterobactersp.）和6-1（Pantoeaagglomerans）。同樣地,將分離得到的14種細(xì)菌分別接種到預(yù)先受到機(jī)械損傷處理的番茄葉片上,發(fā)現(xiàn)其中有三種菌株可以誘導(dǎo)番茄葉片中PPO活性,這些菌株分別是3-1（Rahnellaaquatilis）、2b（E.ludwigii）和5-1（Enterobactersp.）。3.E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾對(duì)番茄植株誘導(dǎo)防御反應(yīng)的影響接種了E.ludwigii的谷實(shí)夜蛾幼蟲取食番茄葉片后48h,可以明顯誘導(dǎo)番茄葉片中PPO活性。同時(shí),茉莉酸信號(hào)途徑調(diào)控與抗蟲相關(guān)的防御基因Pin2,CysPI和PPOF在受到預(yù)先被E.ludwigii接種侵染的幼蟲取食危害24h后的番茄葉片中的表達(dá)量明顯上升,而水楊酸信號(hào)途徑調(diào)控的與病程相關(guān)蛋白Pr1a（P4）的表達(dá)量明顯被抑制。當(dāng)讓初孵的谷實(shí)夜蛾幼蟲取食預(yù)先被E.ludwigii接種侵染的谷實(shí)夜蛾幼蟲為害過的番茄葉片,5天后稱量幼蟲的體重,發(fā)現(xiàn)幼蟲的體重增長(zhǎng)明顯被抑制。4.E.ludwigii接種番茄植株對(duì)其防御反應(yīng)的影響當(dāng)番茄植株被不同濃度的E.ludwigii直接接種侵染48h后,發(fā)現(xiàn)只有在濃度達(dá)到10⁹CFU/ml(OD₆₀₀=0.1)時(shí),E.ludwigii才能夠顯著抑制番茄葉片中PPO活性。同時(shí),番茄葉片在受細(xì)菌接種侵染24h后,番茄葉片中茉莉酸信號(hào)途徑調(diào)控與抗蟲相關(guān)的防御基因Pin2的表達(dá)量明顯被抑制,而水楊酸信號(hào)途徑調(diào)控的與病程相關(guān)蛋白Pr1a（P4）的表達(dá)量明顯上升。5.E.ludwigii接種對(duì)谷實(shí)夜蛾在番茄葉片上分泌GOX的影響通過對(duì)被E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾取食過的番茄葉片部位進(jìn)行洗脫,可以收集到幼蟲分泌在番茄葉片受傷部位上的蛋白質(zhì)。利用GOX特定的抗體和Westernblot蛋白質(zhì)雜交技術(shù),從受到不同蟲害處理的番茄葉片上洗脫下來的蛋白質(zhì)樣品中檢測(cè)目的蛋白GOX的存在以及含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未接種細(xì)菌E.ludwigii的谷實(shí)夜蛾幼蟲在番茄葉片上大約分泌GOX量明顯少于接種了E.ludwigii谷實(shí)夜蛾幼蟲在番茄葉片上分泌GOX的量。6.E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾唾液及GOX對(duì)番茄植株誘導(dǎo)防御反應(yīng)的影響通過人工收集幼蟲所分泌的唾液,將收集于E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾的唾液用來處理預(yù)先受到機(jī)械損傷的番茄葉片,發(fā)現(xiàn)與用收集于未被細(xì)菌接種侵染谷實(shí)夜蛾的唾液處理相比,番茄葉片中PPO活性被明顯誘導(dǎo)。同時(shí),通過解剖的方法獲得谷實(shí)夜蛾幼蟲唾液腺體,然后將收集于E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾的唾液腺體勻漿并用來處理預(yù)先受到機(jī)械損傷處理的番茄葉片,發(fā)現(xiàn)番茄葉片中PPO活性被明顯上升。此外,利用商品化的GOX直接處理預(yù)先受到機(jī)械損傷處理的番茄葉片,發(fā)現(xiàn)GOX濃度越高,其對(duì)番茄葉片中PPO活性誘導(dǎo)作用越強(qiáng)。7.E.ludwigii接種谷實(shí)夜蛾對(duì)其在番茄植株上分泌腸道回流液的影響盡管已有研究證明谷實(shí)夜蛾并不會(huì)在番茄植株上分泌可測(cè)含量的腸道回流液,但是E.ludwigii接種是否可以影響谷實(shí)夜蛾在番茄葉片上分泌腸道回流物尚不清楚。采用喂食含有熒光染料的人工飼料方法對(duì)預(yù)先被buffer和E.ludwigii接種的谷實(shí)夜蛾進(jìn)行處理,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡對(duì)腸道回流液以及被幼蟲所取食的番茄葉片受傷部位的觀察,發(fā)現(xiàn)E.ludwigii接種并不能改變谷實(shí)夜蛾不能在番茄植株上分泌可測(cè)含量的腸道回流物這一現(xiàn)象和結(jié)果。8.特異性引物檢測(cè)在被谷實(shí)夜蛾取食過的番茄葉片上E.ludwigii的存在特異性引物的設(shè)計(jì)主要是利用通用引物GS4和EC5來擴(kuò)增E.ludwigii的16S和23S之間的片斷（Intergenictranscribedspacer,ITS）,根據(jù)所擴(kuò)增得到的序列設(shè)計(jì)一條正義鏈ENTI