DMD的基因診斷進(jìn)修

DMD基因診斷概述單基因?。褐赣捎趩蝹€(gè)基因的突變而引起的遺傳病，其遺傳方式符合孟德爾定律。人類大約有2.5萬個(gè)基因，目前約有2千個(gè)單基因病的致病基因被鑒定?；蛟\斷：利用分子遺傳學(xué)技術(shù)在DNA或RNA水平上對某一基因進(jìn)行突變分析，從而對特定的疾病進(jìn)行診斷。多數(shù)單基因病目前尚無有效的治療。對于一些嚴(yán)重的單基因病可通過基因診斷和產(chǎn)前診斷的方法，避免再生育患兒。DMD疾病介紹Duchennemusculardystrophy（DMD）假肥大型（進(jìn)行性）肌營養(yǎng)不良杜氏肌營養(yǎng)不良兒童最常見的致死性肌肉疾病遺傳方式：X連鎖隱性遺傳發(fā)病率：1/3500活產(chǎn)男嬰DMD臨床特征3～5歲隱襲起病，病情進(jìn)行性加重，9～12歲不能行走，多于20歲左右死亡。學(xué)步較晚，不愿意行走或跑、行走緩慢，活力下降、易于跌倒、不能跳躍、上樓困難。90%有肌肉假性肥大，腓腸肌最明顯，觸之堅(jiān)韌。鴨步：骨盆帶肌肉無力。Gower征：自仰臥位起立時(shí)，先翻身轉(zhuǎn)為俯臥位，屈膝、髖關(guān)節(jié)，用手按壓膝部以輔助股四頭肌的肌力，雙手攀附下肢緩慢地站立。肩胛帶肌受累松弛，呈游離肩；前鋸肌和斜方肌萎縮無力，兩臂前推或上舉時(shí)，肩胛骨呈翼狀豎立于背部，稱翼狀肩。大多數(shù)伴心肌損害，少數(shù)可出現(xiàn)充血性心力衰竭。30%患兒有不同程度的智力障礙。腱反射減弱，直至消失肌酶：CK等活性明顯升高肌電圖：肌源性損傷免疫組化：蛋白消失或減少。晚期多因呼吸道感染，心力衰竭死亡。BMD：貝氏肌營養(yǎng)不良，臨床特征同DMD，發(fā)病年齡較晚，進(jìn)展緩慢，病情較輕，存活期長。DMD基因定位：位于Xp21結(jié)構(gòu)：全長2.5Mb，是人類最大基因；cDNA長14Kb，含79個(gè)外顯子。功能：表達(dá)dystrophin蛋白，具有細(xì)胞支架、抗?fàn)坷?、防止?xì)胞膜在收縮活動時(shí)撕裂。突變類型：缺失型：60—65%；點(diǎn)突變和微缺失：30%；重復(fù)型突變：5%發(fā)病機(jī)制

DMD基因↓dystrophin蛋白↓與肌膜上的其他蛋白形成DAPC復(fù)合體↓在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架蛋白之間形成一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)↓保護(hù)肌纖維和肌膜在長期的反復(fù)機(jī)械收縮過程中免受損傷和壞死DMD的危害發(fā)病率高致死性肌肉病多于13歲前失去獨(dú)立行走能力，青春期后期死亡給家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)目前沒有有效的治療措施DMD基因檢測常用方法18個(gè)外顯子的多重PCR技術(shù)連鎖分析——單體型分析胎兒性別鑒定變性高效液相色譜——DHPLCMLPA基因測序多重PCR技術(shù)多重PCR（mPCR）在一個(gè)PCR體系中由多對不同的引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的DNA片斷。DMD基因兩組9重PCR

A組：4、8、17、19、44、45、48、51、60號外顯子

B組：Pm、3、6、12、13、43、47、50、52號外顯子突變檢出率：60%左右。mPCR反應(yīng)體系試劑（Reagents）體積（Volume）10

Buffer1

lMgCl21

ldNTPs(10mM)0.3

lGoldTaq（5U/

l）0.15

lPrimers(100ng/

l）2.5

lDNA模板(30ng/

l)0.7

lddH2O4.35

lmPCR反應(yīng)條件連鎖分析目的：檢測攜帶者非缺失型的產(chǎn)前診斷與mPCR聯(lián)合分析方法：在DMD基因內(nèi)部及下游200kb范圍選擇11個(gè)雜合度較高的微衛(wèi)星（STR）位點(diǎn)，進(jìn)行單體型分析11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)詳細(xì)情況

Marker名稱等位基因5’CA123452CA123457CA1234544CA1234545CA1234549CA1234550CA1234559CA1234563CA1234579CA123453’CA12345PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色各重復(fù)片斷存在多種形式長度最小的重復(fù)片段命名為1依此類推注意：基因內(nèi)部的交換重組胎兒性別鑒定原理：檢測性別決定基因SRY方法：兩重PCR擴(kuò)增SRY、DMD6號外顯子（內(nèi)對照）分析：SRY基因和內(nèi)對照均有產(chǎn)物為男性有內(nèi)對照產(chǎn)物而無SRY產(chǎn)物為女性DMD遺傳咨詢DMD為X連鎖隱性遺傳病，女性攜帶者，所生男孩有50%為患兒，所生女孩有50%為攜帶者。女性攜帶者中約1.7%可表現(xiàn)有輕重不同的癥狀，且有較高患擴(kuò)張性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。先證者的母親有2/3的可能為攜帶者。母親外周血中未檢出致病基因：1、先證者為新發(fā)突變；2、母親為生殖腺嵌合體（15～20%）。有DMD家族史或曾生育患兒的女性再生育時(shí)須行DMD產(chǎn)前診斷。舉例

先證者出生時(shí)正常，7歲時(shí)因“行走困難”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診為“肌營養(yǎng)不良”，現(xiàn)15歲不能獨(dú)坐，先證者有一舅舅有類似癥狀，15歲死亡。今先證者姐姐孕23周，要求行DMD基因診斷。先證者DMD

基因mPCR檢測結(jié)果：47、48、50號外顯子缺失。胎兒SRY檢測為陰性，說明為女性胎兒。先證者為DMD基因47、48、50號外顯子缺失型DMD患者。胎兒SRY陰性，說明為女性胎兒。連鎖分析示胎兒遺傳了與先證者相同的DMD基因，且未見母源49CA片段，說明胎兒及其母親均為DMD致病基因攜帶者。診斷報(bào)告咨詢意見DMD為X連鎖隱性遺傳病，胎兒出生后一般不會患DMD疾病，但有文獻(xiàn)報(bào)道1.7%的DMD女性攜帶者可表現(xiàn)有輕重不同的癥狀，且有較高患擴(kuò)張性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)；孕婦及其胎兒均為DMD致病基因攜帶者，孕婦再生育或胎兒將來生育時(shí)需行DMD產(chǎn)前診斷。DHPLC技術(shù)變性高效液相色譜（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC）是一種用離子對反向高效液相色譜法分離并檢測異源雙鏈，從而高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)，其專利產(chǎn)品為WAVEDNA片段分析系統(tǒng)。DHPLC的核心組成分離柱無孔多苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球體疏水，電中性三乙基銨醋酸鹽（TEAA）離子對試劑，其疏水基團(tuán)與分離柱的疏水基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),正電荷與核酸主鏈上的磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷反應(yīng)乙腈將核酸從TEAA上洗脫下來，其濃度越大洗脫立力越強(qiáng)DHPLC的檢測類型外顯子缺失的檢測外顯子點(diǎn)突變的檢測女性攜帶者的檢測外顯子缺失的DHPLC檢測

原理：大小和序列不同的片斷與分離柱的結(jié)合力不同隨著乙腈濃度的增高不同的片斷將先后從分離柱上洗脫下來用紫外分光儀檢測洗脫液濃度的連續(xù)變化，有產(chǎn)物的片斷將形成峰缺失片斷則不形成峰點(diǎn)突變和攜帶者的DHPLC檢測

原理：突變型與野生型DNA雜交形成異源雙鏈和同源雙鏈異源雙鏈和同源雙鏈在某一溫度下解鏈的程度不同所以與分離柱的結(jié)合力不同隨著乙腈濃度的增高異源雙鏈和同源雙鏈將先后從分離柱上洗脫下來用紫外分光儀檢測洗脫液濃度的連續(xù)變化，形成異源雙峰檢測步驟PCR擴(kuò)增DMD基因上的86個(gè)片段各片段的PCR產(chǎn)物分別與相應(yīng)的野生型PCR產(chǎn)物1：1混合雜交上樣檢測對于有異源雙峰的片斷進(jìn)行測序41號外顯子A患者，B母親，C大姐，D二姐

DNA序列測定原理PCR體系中含有正常dNTP和四色熒光標(biāo)記的ddNTP。ddNTP的3′端為-H，其不能和后續(xù)dNTP形成磷酸二酯鍵，從而終止延伸。PCR反應(yīng)中dNTP與ddNTP產(chǎn)生競爭，形成大量不同片斷的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)熒光峰識別每一個(gè)堿基。MLPA多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplexligat