DB13-T1721-2013辣椒輕斑駁病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

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DB13河 北 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB13/T1721—2013辣椒輕斑駁病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechncalRegulatosoretectonofeppermildevirus2013-2013-05-272013-06-15河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB13/T1721—2013DB13/T1721—2013前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王亞南、曹克強(qiáng)、王樹桐、胡同樂、楊軍玉、冀志蕊。IIDB13/T1721—2013DB13/T1721—2013DB13/T1721—2013（1000DB13/T1721—2013（1000、200L、L10L、5各種吸頭（1000L、200L、20L、L、5L）；離心管（1.5mL、0.6mL、0.2mL）；量筒（1000mL）。4.3主要試劑主要試劑和緩沖液見附錄C、D、E。辣椒輕斑駁病毒檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍（Peppermildmottlevirus，PMMoV）（）術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2.1辣椒輕斑駁病毒?。ɡ被颍ê停?.2辣椒輕斑駁病毒辣椒輕斑駁病毒（viuepermildeviru，簡(jiǎn)寫由63573原理依據(jù)PMMoV具有很強(qiáng)的免疫原性，可采用ELISA或免疫膠體金試紙條方法進(jìn)行檢測(cè)；依據(jù)PMMoV基因組序列的特異性，可采用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。PMMoV病原特性見附錄A。4材料、儀器、用具及藥品材料甜（辣）椒種子、葉片或果實(shí)。儀器、用具超低溫冰箱（箱內(nèi)溫度可達(dá)-80℃以下）；高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速在12000r/min以上）；PCR儀（常規(guī)配置）；凝膠成像系統(tǒng)（常規(guī)配置）；電泳儀（常規(guī)配置）；水平電泳槽（常規(guī)配置）；酶標(biāo)儀（常規(guī)配置）；1調(diào)查與取樣田間調(diào)查在甜（辣）椒生長(zhǎng)期進(jìn)行調(diào)查，帶有附錄B記述的PMMoV為害癥狀的植株為疑似病株。種子取樣在11月～翌年2月份對(duì)市場(chǎng)銷售的甜（辣）椒種子進(jìn)行扦樣（數(shù)量以滿足檢測(cè)鑒定所需為限），然后進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。（（-80℃）檢測(cè)與鑒定錄C。（DAS-ELISA）PMMoV（DAS-ELISAD。（RT-PCR）PCRE。，DAS-ELISA，RT-PCRRT-PCR2用DAS-ELISADAS-ELISA方法復(fù)檢。PCR33DB13/T1721—2013DB13/T1721—2013DB13/T1721—2013DB13/T1721—2013附錄A（資料性附錄）辣椒輕斑駁病毒病原特征分類和命名學(xué)名Peppermildmottlevirus（PMMoV）。分類地位煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）。病原特征病毒粒子18nm×312nm顯，螺距2.3nm。核酸核酸單鏈RNA，分子量2×106?；蚪MRNA由6357個(gè)核苷酸組成，共有4個(gè)ORF。蛋白分子量17。致病型L1L1aL2L3、L4LP1P1，2P1，2，3P1，2，3，4等5PMMoV中已經(jīng)先后發(fā)現(xiàn)P1，2P1，2，3P1，2，3，4等3L2、L3、L44附錄B（資料性附錄）辣椒輕斑駁病毒的寄主范圍、地理分布、生物學(xué)特性、為害癥狀、傳播途徑及鑒別寄主寄主范圍自然寄主辣椒屬植物。寄主范圍莧色藜、昆諾藜、曼陀羅、煙草、矮牽牛、羅勒、洋酸漿。地理分布生物學(xué)特性致死溫度致死溫度辣椒輕斑駁病毒的致死溫度95℃。稀釋限點(diǎn)辣椒輕斑駁病毒的稀釋限點(diǎn)為10-6mL/L～10-8mL/L。體外存活期辣椒輕斑駁病毒體外存活期30d以上。等電點(diǎn)辣椒輕斑駁病毒粒子等電點(diǎn)pH為3.38～3.7。B.4為害癥狀（辣B.5傳播方式5PMMoV：1.種子傳播；2.）；3.病殘；4.（）鑒別寄主白曼陀羅aete）局部壞死癥狀。曼陀羅（Daturastramonium）局部枯斑癥狀，無系統(tǒng)侵染。昆諾藜（Chenopodiumquinoa）局部斑駁癥狀，無系統(tǒng)侵染。心葉煙（Nicotianaglutinosa）局部枯斑癥狀，無系統(tǒng)侵染。野生煙（Nicotianasylvestris）局部枯斑癥狀，無系統(tǒng)侵染。B.6.6珊西煙（NicotianaXanthi-nc）B.6.6珊西煙（NicotianaXanthi-nc）局部枯斑癥狀，無系統(tǒng)侵染。6附錄C（規(guī)范性附錄）辣椒輕斑駁病毒免疫膠體金試紙條測(cè)定片至一片樣品檢測(cè)（15℃～30℃）MAX結(jié)果判定陰性結(jié)果：質(zhì)控線顯粉紅色，測(cè)試線未顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性。無效結(jié)果：質(zhì)控線和測(cè)試點(diǎn)線均未顯色，說明試紙條失效，檢測(cè)結(jié)果無效。C.4注意事項(xiàng)陰性結(jié)果：質(zhì)控線顯粉紅色，測(cè)試線未顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性。無效結(jié)果：質(zhì)控線和測(cè)試點(diǎn)線均未顯色，說明試紙條失效，檢測(cè)結(jié)果無效。C.4注意事項(xiàng)試紙條應(yīng)在2℃～8℃溫度應(yīng)在15℃～30℃。7附錄D（規(guī)范性附錄）辣椒輕斑駁病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試材包被抗體特異性辣椒輕斑駁病毒抗體（市售）。酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記的辣椒輕斑駁病毒抗體（市售）。底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉（NPP）。（pH7.4）PVP（MW24,000～40,000）20.0g，亞硫酸鈉1.3g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pH至7.4，溶解于1L1×PBST中，4℃貯存。包被緩沖液包被緩沖液碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pH至9.6，蒸餾水定容至1L，4℃貯存。（PBST）（）1.15g（無水g，氯化鉀0.2g，-200.5mLpH至7.41L，牛血清蛋白（BSA）或脫脂奶粉2.0g，PVP（MW24,000～40,000）20.0g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pH至7.4，溶解于1L1×PBST中，4℃貯存。底物緩沖液二乙醇胺97.0mL，氯化鎂0.1g，疊氮化鈉0.2g，調(diào)整pH至9.8，蒸餾水定容至1L，4℃貯存。D.2DAS-ELISA檢測(cè)程序包被抗體將PMMoV100μL，4h或4PBST4～6樣品制備8取樣品按1:10（W/V）加入提取緩沖液研磨勻漿。2000r/min離心10min，取上清4℃保存?zhèn)溆?。加樣在酶?lián)板中加入待測(cè)樣品，同時(shí)加入陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，每孔加100μL，放入保濕2h4，PBST洗滌4～6將酶標(biāo)抗體按照試劑盒說明用酶標(biāo)抗體緩沖液稀釋，加入酶聯(lián)板中，于每孔100μL，放入保濕盒2h。PBST洗滌4～6加底物將NPP加入底物緩沖液使終濃度為1mg/mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），混合均勻，加入酶聯(lián)板，每孔100μL。放入保濕盒，室溫避光顯色30min～60min。終止反應(yīng)每孔中加入50μL終止液，終止反應(yīng)。讀數(shù)酶標(biāo)儀在405nm下讀取光密度值（OD值）。D.3結(jié)果評(píng)定D.3結(jié)果評(píng)定OD405OD4050.15OD4050.050.05以微孔中陰性對(duì)照的2倍為標(biāo)準(zhǔn)，大于這個(gè)數(shù)值的樣品為陽性結(jié)果，小于這個(gè)數(shù)值為陰性結(jié)果，在閾值附近，判定為可疑樣品，需重復(fù)試驗(yàn)或用其它方法驗(yàn)證。9附錄E（規(guī)范性附錄）辣椒輕斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)（RT-PCR）試劑RNATrizolReagent購(gòu)自Invitrogen公司、三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇。反轉(zhuǎn)錄試劑M-MLV北京和RNA（連）PCR試劑rTaqDNA聚合酶、dNTP購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑：液氮、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。檢疫程序總RNA的提取總RNA的提取0.1g，加入1mlTrizol5min200μL，sec，2min～3min；12000rpm，4℃離心15min；2/3體積min；12000rpm，4℃離心15min，1mL75％（含RNADEPCH2O40μLRNA，5510min。RT-PCR引物序列上游引物（’）：-atttgcttcaaatgatccg；下游引物（’）：-tacattgtgacggtatttca-RT-PCRcDNA合成DEPCH2O：病毒RNA5×MMLVBuffer：4μL2μL1μL4μL11μL充分混合，90℃下變性1min，立即置于冰上，放置2min。DEPCH2O： 5.5μL10dNTPs（每10mmol/L） 2μLRnasin（40U/μL） 0.5MMLV反轉(zhuǎn)酶（10U/μL） 1μL20μL37℃孵育1h，70℃滅活10min。PCR擴(kuò)增體系及程序50μL體系中加入以下試劑：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μL5’-引物20pmol） 1L3’-引物20pmol） 1LdNTPs（每10mmol/L） 4μL10×Taq酶應(yīng)緩液 5μLddH2O 36.7μLTaq酶（5U/μL） 0.3μL50μL反應(yīng)程序：94℃4min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min。延伸10min。E.2.2.3凝膠電泳檢測(cè)取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物加6×l