(7.27)-中文版QIAGEN Plasmid Purification H細(xì)胞生物學(xué)

QIAGEN?PlasmidPurificationHandbook

使用前注意事項：1．

在提low-copy（低拷貝）增加lysisbuffer（裂解液）體積可以提高堿性裂解的效率以及DNA的產(chǎn)量。2．

BufferP1在使用前加RNaseAsolution（RNA酶溶液），一瓶BufferP1加入一小瓶RNaseA（用前瞬時離心），終濃度為100ug/ml。3．

檢測BufferP1是否有因低溫儲存而引起的SDS沉淀。如有必要，將SDS在37℃溶解。4．

BufferP3在4℃下預(yù)冷。5．

選擇性操作：把提供的LyseBluereagent（LyseBlue試劑）加入到BufferP1并在用前混勻。一瓶BufferP1加一小瓶LyseBlue（用前瞬時離心），這樣LyseBlue被稀釋1000倍。步驟（藍(lán)色為大提的量，括號里為中提的量。）1.

在選擇平板上挑選一個單克隆，在相應(yīng)抗性的LB2—5ml中進(jìn)行初培養(yǎng)：37℃搖床約300rpm下初培養(yǎng)約8h。

（使用的管子或燒瓶至少是培養(yǎng)體積的4倍。）2.

將初培養(yǎng)菌液用選擇性LB培養(yǎng)基稀釋到1/500到1/1000。High-copyplasmid（高拷貝質(zhì)粒）：用100-200ul（25-50ul）初培養(yǎng)液接種100ml（25ml）介質(zhì)。Low-copyplasmid（低拷貝質(zhì)粒）：用250-500ul（100-200ul）初培養(yǎng)液接種500ml（100ml）。37℃搖床約300rpm下初培養(yǎng)約12-16h。

（使用的燒瓶或容器至少是培養(yǎng)體積的4倍。培養(yǎng)細(xì)胞的濃度要達(dá)到約3-4×109個/ml，也即是每毫升的細(xì)胞干重約3g左右）3.

4℃離心機(jī)6000×g離心15min收集細(xì)菌細(xì)胞。

（如果想在此步驟停止以后再做，把細(xì)胞-20℃凍存。）4．10ml（4ml）BufferP1重懸細(xì)菌細(xì)胞。（為了使裂解液充分混合進(jìn)而能有效溶解，需使用較大的容器。并確保BuferP1里已經(jīng)加入RNaseA。如果BufferP1里已經(jīng)加入LyseBluereagent，為確保LyseBlue顆粒完全重懸使用前搖一下Buffer瓶子。為使細(xì)菌完全重懸，可以斡旋或者用膠吸管來回上下打散細(xì)胞直到?jīng)]有細(xì)胞團(tuán)留下為止。）6．

加入10ml（4ml）BufferP2，上下顛倒封蓋的管子4-6次徹底混合溶液，室溫（15-25℃）下放置5min。

（不要斡旋，因為斡旋能導(dǎo)致基因組DNA被剪斷。裂解液會有粘性。溶解反應(yīng)不要超過5min。裝有BufferP2的瓶子用后要立即蓋緊，以免被空氣中的CO2酸化。如果BufferP1里加有LyseBlue，那么在加入BufferP2后細(xì)胞懸浮液會呈現(xiàn)藍(lán)色?；靹蚝髴腋∫旱念伾珪芫?。如果懸浮液仍有無顏色區(qū)或者褐色細(xì)胞團(tuán)存在，請繼續(xù)混合直到顏色均一為止。）6．加10ml（4ml）預(yù)冷的BufferP3，立即上下顛倒4-6次混勻，然后放冰上20min（15min）。（預(yù)冷的BufferP3和冰上放置能促進(jìn)沉淀。加入BufferP3后有乳白色的物質(zhì)形成且裂解液粘性度減少。沉淀物中含有基因組DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞殘渣和KDS。為保證potassiumdodecylsulfate（十二烷基磷酸鉀）沉淀，裂解液要充分混合。若混合液依舊粘稠，請繼續(xù)混合徹底中和溶液。如果使用了LyseBlue試劑懸浮液混勻后藍(lán)色要徹底消失呈現(xiàn)無色。懸浮液均勻無色表明SDS已完全沉淀。）7．

≧20,000g4℃離心30min。立即轉(zhuǎn)移含有質(zhì)粒DNA的上清液。（離心前樣品需再次混合。離心要在非玻璃管（如聚丙烯）內(nèi)進(jìn)行。離心后上清液應(yīng)是清晰透明的。）8．

把上清液≧20,000g4℃離心15min。立即轉(zhuǎn)移含有質(zhì)粒DNA的上清液。（進(jìn)行第二次離心是避免仍有懸浮或顆粒物質(zhì)存在于QIAGEN-tip。是樣品渾濁的懸浮物質(zhì)能阻止QIAGEN-tip并且會降低或消除重力流。→（樣1）從清晰的裂解上清液里取120ul（240ul）樣品保存以備跑分析膠確定生長和裂解狀態(tài)是否最佳。）9．

用10ml（4ml）BuferQBT平衡QIAGEN-tip500（QIAGEN-tip100）以使柱子為空重力流。（因為平衡液中有洗滌劑存在，buffer流將通過降低表面張力自動開始。使得QIAGEN-tip徹底排空。因為當(dāng)半月液面達(dá)到柱子的上個玻璃面時buffer流會停止，所以QIAGEN-tip可以無人看著。）10．從第8步道到QIAGEN-tip用上清液使它通過重力流進(jìn)入樹脂。（上清液應(yīng)該立即轉(zhuǎn)移到QIAGEN-tip上。如果放置時間過長或者由于蛋白過度沉淀使上清液變得不透明，在轉(zhuǎn)移前請再次離心或者過濾以避免阻礙QIAGEN-tip。）→（樣2）從逆流道中取樣120ul（240ul）樣品保存以備跑分析膠確定DNA結(jié)合QIAGEN樹脂的效率。）11．用2×30ml（2×10ml）BufferQC洗QIAGEN-tip。（BufferQC通過重力流通過QIAGEN-tip。第一次清洗就足夠去除大部分質(zhì)粒DNA沉淀中的污染物。但是，當(dāng)培養(yǎng)體積較大或者菌種會產(chǎn)生大量的糖類時第二次清洗是必要的。→（樣3）從混合的清洗部分取出240ul（400ul）樣品保存以備跑分析膠。）12．用15ml（5ml）BufferQF洗提DNA。（把洗出液收集到一個15ml-50ml的管子里（管子自備）。這里不建議用戶使用聚碳酸酯材料的離心管，因為聚碳酸酯不抵抗下面使用的酒精。注：對于大于45-50kb的產(chǎn)物，把elutionbuffer在65℃預(yù)熱可能會有助于增高產(chǎn)量?！?）取60ul（100ul）洗出液保存以備跑分析膠。如果想在這一步停止以后再做，把洗出液在4℃保存。貯存時間最好不要長于過夜。）13．向DNA洗提液里加入10.5ml（3.5ml）（0.7體積）的室溫異丙醇沉淀DNA。混勻立即在≧15,000×g4℃離心30min。小心轉(zhuǎn)移上清液至另一瓶子。（雖然離心是在4℃進(jìn)行可以阻止樣品過熱，但是所有溶液還要放室溫以減少鹽類沉淀?；蛘呖梢杂靡淮涡詧A錐底的離心管5000×g4℃離心60min。因為異丙醇顆粒是玻璃表面所以可能會比從酒精沉淀產(chǎn)生的柔軟的含鹽顆粒更難看到。離心前在管的外面坐標(biāo)記便于小粒的定位。異丙醇小粒在管壁上結(jié)合得較松，所以在轉(zhuǎn)移上清液是要非常小心。）14．用5ml（2ml）70%室溫保存的乙醇洗滌DNA顆粒，在≧15,000×g4℃離心10min。小心轉(zhuǎn)移上清液至另一瓶子，不要激蕩DNA顆粒。（或者可以用一次性圓錐底的離心管5000×g4℃離心60min。70%乙醇可以移去沉淀的鹽并用更易揮發(fā)的乙醇替換異丙醇，這樣更易于DNA的再溶解。）15