SN 1005-2001出口肉品中富拉磷殘留量檢驗(yàn)方法 杯碟法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口肉品中富拉磷殘留量檢驗(yàn)方法杯碟法Methodforthedeterminationoffravophospholipolresidues2001-12-30發(fā)布l本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1—1993《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1單元：標(biāo)準(zhǔn)的起草與表述規(guī)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》及SN/T0005—1996《出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素生物學(xué)檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》的要求而編寫的。其中測定方法是采用日本厚生省《畜水產(chǎn)食品中的殘留物質(zhì)檢驗(yàn)方法》和美國AOAC《公定分析方法》中相應(yīng)的分析方法。但在技術(shù)內(nèi)容上稍有改變，經(jīng)驗(yàn)證后按規(guī)定格式要求進(jìn)行編寫。在標(biāo)準(zhǔn)中同時制定了抽樣和制樣方法。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。1出口肉品中富拉磷殘留量檢驗(yàn)方法杯碟法Methodforthedeterminationoffravophospholipolresiduesinmeatforexport—Cylinderplatemethod本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口肉品中富拉磷殘留量檢驗(yàn)的抽樣、制樣和杯碟測定法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口分割豬肉中富拉磷殘留量檢驗(yàn)，其他肉品可參照使用。2抽樣和制樣2.1檢驗(yàn)批以不超過2500件為一檢驗(yàn)批。同一檢驗(yàn)批的商品應(yīng)具有相同的特征。如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地規(guī)格和等級等。抽樣數(shù)量152.3抽樣方法按2.2規(guī)定的抽樣件數(shù)隨機(jī)抽取，逐件開啟。每件至少取一袋作為原始樣品，原始樣品總量不少于如每件中無小包裝或有小包裝但每袋質(zhì)量超過2kg者，則可用滅菌刀具在抽出的包件中，每件取不少于100g,混合后置于清潔容器內(nèi)，作為混合原始樣?；旌虾笤紭拥目偭坎簧儆?kg,加封后，標(biāo)2.4試樣制備將代表性樣品中的可食部分放入絞碎機(jī)中絞碎，充分混勻，用四分法縮分至不少于500g,作為試2.5試樣保存將試樣于—18℃以下冷凍保存。注：在抽樣及制樣的操作過程中，必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局2001-12-30批準(zhǔn)2002-06-01實(shí)施23.1方法提要用50%甲醇溶液抽提試樣中的富拉磷，均質(zhì)后，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH8.0,回流煮沸15min,冷的大小用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量地測定富拉磷的含量。3.2試劑和材料3.2.1富拉磷標(biāo)準(zhǔn)品：904μg/mg,由日本農(nóng)林水產(chǎn)省東京肥飼料檢查所提供。3.2.4生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉，溶解于1000mL水中，121℃高壓滅菌15min。3.2.5緩沖液1(pH7.0):稱取6.4g無水磷酸二氫鉀，18.9g無水磷酸氫二鈉溶于水中，定容至1000mL,121C高壓滅菌15min。3.2.6試驗(yàn)菌種：蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),由中國藥品生物制品檢定所提供，菌株號碼14579。3.2.7富拉磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的富拉磷標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量甲醇溶解，再加甲醇溶液[甲醇：水(體積分?jǐn)?shù))=1:1],配制成富拉磷濃度為1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置4℃冰箱中保存，可使用一個月。3.2.8富拉磷標(biāo)準(zhǔn)工作液：取一定量富拉磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用緩沖液1(3.2.5)稀釋成濃度為0.094,0.188,0.375,0.75,1.5μg/mL3.2.9培養(yǎng)基I:見附錄A中A1。3.2.10培養(yǎng)基I:見附錄A中A2。3.3儀器和設(shè)備3.3.3游標(biāo)卡尺：測量范圍0～150mm,精度0.02mm。3.3.4均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。3.3.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。3.3.6恒溫培養(yǎng)箱：0～50C,擱板應(yīng)保持水平。3.3.8恒溫水浴鍋。3.4測定步驟3.4.1樣液的制備稱取10.0g試樣于均質(zhì)杯內(nèi)，加入90mL50%甲醇，10000r/min均質(zhì)2min,轉(zhuǎn)入蒸餾瓶中，用氫氧化鈉溶液調(diào)至pH8.0,90℃回流煮沸15min,冷卻后移入離心管中，以3000r/min離心20min,取上清液作為試驗(yàn)樣液。3.4.2芽胞懸液的制備將試驗(yàn)菌種(3.2.6)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管內(nèi)，經(jīng)(28±1)C培養(yǎng)(18±1)h,取1mL菌液，加入盛有適量培養(yǎng)基I的克氏瓶中，涂抹均勻。置培養(yǎng)箱(28±1)C培養(yǎng)一周。鏡檢芽胞數(shù)達(dá)85%以上，用適量滅菌生理鹽水洗下菌臺，于65C恒溫水浴中加熱30min,再以3000r/min離心10min,棄去上清液，如此重復(fù)洗滌2～3次，再于65C水浴中加熱30min,最終用適量滅菌生理鹽水稀釋，制成芽胞懸3液，置4℃冰箱可保存數(shù)月。3.4.3芽胞懸液用量的確定在實(shí)際測定前把不同量的芽胞懸液加到培養(yǎng)基Ⅱ中，制成平板，培養(yǎng)(18±1)h,測定能使0.094μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生直徑≥10mm,清晰、完整的抑菌圈的最佳芽胞懸液用量。3.4.4檢定用平板的制備將培養(yǎng)基I熔化后，冷卻至45C～50℃,加入適量芽胞懸液(從3.4.3測得),混勻，取8mL注入培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻覆蓋其底面，保持水平，待其凝固。所用平板須當(dāng)天制備。3.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用富拉磷標(biāo)準(zhǔn)工作液(3.2.8)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0.375pg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液為參考濃度。每個標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度取三個檢定平板為一組，每個平板上置6個牛津杯，使牛津杯在半徑為2.8cm的圓面成60°角間距，其中3個間隔位的牛津杯中加0.375μg/mL參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，另3個間隔位的牛津杯加其他濃度的一種標(biāo)準(zhǔn)工作液。4個濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液共12個檢定平板，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線0.375μg/mL參考濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液將得到36個數(shù)值，而其他標(biāo)準(zhǔn)工作液分別得到9個數(shù)值。將陶瓦蓋蓋好，置(28±1)C培養(yǎng)(18±1)h。培養(yǎng)后，取出平板，除去牛津杯，精確測量各個濃度的抑菌圈直徑(精確到0.1mm),分別求出每組3個平板上參考濃度的抑菌圈直徑讀數(shù)和其他濃度的抑菌圈直徑讀數(shù)的平均值。再求出0.375pg/mL參考濃度36個抑菌圈直徑的平均值。用參考濃度的抑菌圈直徑的總平均值減去每組平板參考濃度的抑菌圈直徑平均值的差，即為每組平板的校正值。將校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H點(diǎn)的直徑，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，以抑菌圈直徑(mm)為縱坐標(biāo)(算術(shù)級),富拉磷標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(對數(shù)級),通過L和H點(diǎn)連一直線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。L=(3a+2b+c-e)/5 (1)H=(3e+2d+c-a)/5 (2)式中：L——標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度抑菌圈的直徑，mm;H——標(biāo)準(zhǔn)曲線上最高濃度抑菌圈的直徑，mm;c——參考濃度0.375μg/mL的36個抑菌圈直徑的平均值，mm;a,b,d,e——分別表示標(biāo)準(zhǔn)曲線中其他標(biāo)準(zhǔn)濃度(0.094,0.188,0.75,1.5μg/mL)的抑菌圈直徑經(jīng)校正3.4.6樣液的測定每份樣液取3個檢定平板，在每個平板上放6個已滅菌的牛津杯(按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線方法放置),在相間隔3只牛津杯里注滿試驗(yàn)樣液，在剩余的3只牛津杯里分別注滿富拉磷標(biāo)準(zhǔn)參考濃度工作液(0.375μg/mL)。將陶瓦蓋蓋好，于(28±1)℃下培養(yǎng)(18±1)h,然后取出平板，除去牛津杯。如有抑菌圈產(chǎn)生，準(zhǔn)確測量抑菌圈直徑(精確到0.1mm)。3.5結(jié)果的計(jì)算和表述如樣液抑菌圈直徑<10mm,如樣液抑菌圈直徑≥10mm,求出每組三個檢定平板上樣液和參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液抑菌圈直徑的平均值，經(jīng)校正后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的富拉磷濃度，通過式(3),計(jì)算試樣中富拉磷殘留量：X=c/m (3)c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的樣液中富拉磷濃度，pg/mL;m——每毫升最終樣液所代表的試樣量，g。44測定低限和回收率4.1測定低限本方法的測定低限為0.94mg/kg。4.2回收率富拉磷添加濃度在0.94pg/g時，回收率為93.9%;富拉磷添加濃度在3.75μg/g時，回收率為83.2%;富拉磷添加濃度在7.5μg/g時，回收率為92.8%。5(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)A1培養(yǎng)基I(保存及增菌用培養(yǎng)基)牛肉浸膏5.0g瓊脂15g蒸餾水1000mL將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解，調(diào)節(jié)pH,使其滅菌后pH為6.5±0.1,分裝于克氏瓶中，于121℃高壓滅菌15min。A2培養(yǎng)基I(基層及菌種用培養(yǎng)基)蛋白胨3.75g氯化鈉1.25g酵母膏1.25g瓊脂15g將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解，調(diào)節(jié)pH,使其滅菌后pH為7.3±0.1,分裝于錐形瓶中，于121℃高溫滅菌15min。6ThisstandardwasdraftedinaccordancewiththerequirementsoftheGB/T1.1—1993"Direc-tivesfortheworkofstandardization—Unit1:Draftingandpresentationofstandards—Part1:Gen-eralrulesfordraftingstandards"andSN/T0005—1996“Generalrulesfordraftingthestandardofbiologicalmethodforthedeterminationofpesticide,veterinarydrugresiduesandbiotoxinsincommoditiesforexport."Inthisstandard,therelevantmethodforthedeterminationofresiduesinanimalandaquaticproductsofHealthMinistryofJapanandtheofficalmethodofAOAC(U.S.A)areadoptedasthemethodofdetermination,whichistechnicallyequivalenttothoseoftheorigi-nal,butwithslightmodification.Aftergoingthroughverification,thisstandardwasdraftedaccord-ingtotheeditorialrequirementsforthestipulatedformat.Inaddition,themethodsofsamplingandsamplepreparationarealsospecifiedinthisstandard.AnnexAisthestandardannex.ThisstandardwasproposedbyandisunderthechargeofChinaNationalRegulatoryCom-missionforCertificationandAccreditation.ThisstandardwasdraftedbytheHubeiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauoftheThisstandardwasmainlydraftedbyZhaoHui,HuangYang,ZhangZongxian,XuXinsheng.Thisstandardispromulgatedforthefirsttime.7ProfessionalStandardMethodforthedeterminationofSN/T1005—2001ThisstandardspecifiesthemefravophospholipolresiduesbycyliThecharacteristicsofthecargowithinthesameQuantityofsampl26～1005intime.ApprovedbyGeneralAdministratSupervision,InspectionandQuarantineofthe8Incasetherearenotsmallbagsinsideeachpackage,oriftherearesm2.4PreparationoftesNote:Inthecourseofsamplingandsamplepreparation,precautionmustbetakentoavoidcontaminationoranyThefravophospholipolresiduesinthetestsampleareextractedwith50%methawhichfravophospholipolisdeterminedquantitativelybystandardcurvemethod.Unlessotherwisespecified,allreagentsshouldbeanalyticallypure,“water”isdistilled3.2.1Fravophospholipolstandard:904pg/mg,Providedbythestituteunderprovinceofagricultureforestandaquaticproducts,Tokyo,Japan.3.2.3Sodiumhydroxide:40%(m/m).3.2.4Physiologicalsaline:Dissolve8.5gofsodiumchloridein1000mLofwater,autoclaveat3.2.6Teststrain:Bacilluscereus,No.14579,providedbytheDrugandBiologi93.2.7Fravophospholipolstandardstocksolution:Accuratelyweighaproperamountfravophospholipolstandard,dissolvewithalittlemethanolanddilutewithmethanolsolution(methanol:distilledwater=1:1,V/V)toprepareafravophospholippolstandardstocksolutionof3.2.8Fravophospholipolstandardworkingsolution:FurtherdilutetheFravophospholipolstan-dardstocksolutionwithbuffersolutionI(3.2.5)toobtainaseriesofof0.094,0.188,0.375,0.75,1.5μg/mLinconcentrations,whichshouldbepreparedandusedonthesameday.3.3Apparatusandequipment3.3.1Culturedishes:90mm(id)glassorplastic3.3.2Cylinder:Stainlesssteel,(8.0±0.1)mm(od),(6.0±0.1)mm(id),(10.0±0.1)mmheight.3.3.3Verniercaliper:measuringrange:0~150mm,precision:0.02mm.3.3.4Homogenizer:Speed≥10000r/min.3.3.5Centrifuge:Speed≥4000r/min.3.3.6Incubator:0~50℃,itsshelfkepthorizontal.3.3.8Water-bath.3.3.10Others:Refluxcondenser,Stillflask,Rouxbottle,Centrifugaltubesetc.Weigh10.0gofsampleinasterilizedhomogenizingcup,and90mL50%methanol,homogenizeat3000r/minfor20min.Thesupernatantisusedfortestsamplesolution.mediumI.Spreadthecultureevenlyovertheentiresurface.Incubateat(28±1)℃foroneweesporesuspensionwithing.Preparethestandardcurvewithfravophospholipolstandardworkingsolution(3.2.8),usethefravophospholipolstandardworconcentrationsolution.Takethreeplat2.8cmradius.Fill3cylinderswithrefercylinderswithoneofotherconcentrationofstandardworkitions.theplatesout,removethecylinders.Measurethediameterofeachzoneofinhibition(accuratetoconcentrationfrom12platainedforeachconcentrationtothevalueitwouldbeiftheaverageofthereferenceconcentrationreadingforthatsetof3plateswasthesameasthecorrectionpoint.Bythesecorrectedvalues,cal-culatethevaluesofpointLandpointHbytheequation(1)and(2),andplotthepointLandpointHonthesemiloggraphpaper,usinglogarithmicscaleasabscissaforconcentrations(μg/mL)andarithmeticscaleasordinateforaveragezonediameters(mm).ConstructastraightlinethoughpointLandpointHasthestandardcurve.L=(3a+2b+c-e)/5 (1)H=(3e+2d+c-a)/5 (2)whereL—thezonediameterofthelowestpointofthestandardcurve,mm;H—thezonediameterofthehighestpointofthestandardcurve,mm;c—averageofall36readingsofreferenceconcentration(0.375μg/mL),mm;a,b,d,e—correctedaveragezonediametersforeachconcentration(0.094,0.188,0.75,1.5μg/mL)forthestandardcurve,mm.3.4.6DeterminationofsamplesolutionUsethreeplatesforeachtestsample,placesixsterilizedcylindersoneachplaterespectivelyattheplacesasforstandardcurvepreparation.Filltheintervalthreecylinderswithsamplesolution,andotherthreecylinderswith0.375rg/mLreferenceconcentrationsolution.Placetheclaycoversontheplatesandincubateat(28±1)℃for(18±1)h.Taketheplatesout,removethecylinders,mea-surediametersofinhibitionzoneasaccuratelyaspossible.3.5CalculationandexpressionoftheresultsIfthevalueoftheinhibitionzoneislessthan10mm,reportresiduesoffravophospholipolinsam-pl