淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學研究

淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學研究高溫是植物生長的主要限制因子之一。世界氣象組織(IPCC)報告在21世紀末溫度可能增長1.4到5.8℃。在溫帶地區(qū),極端的高溫氣候?qū)⒊霈F(xiàn)的更加頻繁。溫度的升高對世界范圍內(nèi)的作物產(chǎn)量會造成嚴重的危害?；搓庈俎?MedicagosativaL.cv.HuaiYin)是我國唯一一個生長在江淮地區(qū)的苜蓿類型,具有極耐高溫、高濕特性,是我國寶貴的苜蓿品種之一。研究高溫脅迫下淮陰苜蓿蛋白質(zhì)組的變化,將對植物在高溫脅迫下的應答機制有一個更加深入的了解,并為植物耐熱相關新品種的選育提供方向。研究首先利用形態(tài)學標記和SSR標記鑒定了淮陰苜蓿的種質(zhì)特性及種內(nèi)遺傳變異。在成功建立一個雙向電泳體系的基礎上,研究了淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的生理和蛋白響應。并進一步對40℃不同處理時間淮陰苜蓿蛋白質(zhì)組進行雙向電泳分離,運用PDQuest8.0.1軟件分析差異蛋白點,并通過質(zhì)譜技術和Mascot工具對分析獲得差異蛋白點進行鑒定,在蛋白質(zhì)組學的角度探討了高溫下淮陰苜蓿的響應和可能機制。1、淮陰苜蓿種質(zhì)特性及種內(nèi)變異的分析研究通過形態(tài)學標記和SSR標記,分析了淮陰苜蓿的種質(zhì)特性及種內(nèi)變異。結果表明,淮陰苜蓿具有開花早,生育期短的特性,整個生育期約為249天。秋眠級1.7158,是個極秋眠品種。淮陰苜蓿初花期株高61.8-136.2cm；分枝數(shù)9-80個；主莖節(jié)間數(shù)13-23個；葉長2.5-4.4cm；葉寬0.8-2.49cm；主莖傾斜角度8.26-58.4°,趨于直立,淮陰苜蓿各形態(tài)特性的平均變異系數(shù)為24.2%。對淮陰苜蓿SSR的分析表明,淮陰苜蓿基因多樣性指數(shù)為25.32%。聚類分析結果表明,淮陰苜蓿單株間平均遺傳距離為10.26,相似系數(shù)平均為0.8。與其它苜蓿品種相比,淮陰苜蓿遺傳多樣性水平較低,大多數(shù)單株表現(xiàn)出相似的形態(tài)特征?；搓庈俎］^高的一致性可能與生長的地理環(huán)境有關?；搓庈俎７N內(nèi)變異的分析也為苜蓿蛋白質(zhì)組研究的取樣提供依據(jù)。2、適用于苜蓿葉片的雙向電泳技術以蒺藜苜蓿葉片為研究材料,對TCA-丙酮蛋白提取法、聚焦和凝膠染色方法等進行一系列優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn),采用改進的TCA-丙酮法提取總蛋白,17cmpH3-10的固定化梯度膠條聚焦123,000伏時,12%的SDS進行垂直電泳,膠體考染法染色可以獲得最佳的實驗結果。研究認為,改進的TCA-丙酮法能更好的去除樣品中的雜質(zhì),獲得更好的聚焦效果。同時也發(fā)現(xiàn),2-DE的聚焦效果與聚焦伏時和蛋白上樣量相關,更大的蛋白上樣量需要更長的聚焦時間才能使蛋白更好的聚焦,獲得清晰的2-DE圖譜。聚焦伏時過大,超過115,000伏時的情況下,會引發(fā)由于過度聚焦引起的水分和蛋白遷移,導致大量水平條紋對2-DE圖譜產(chǎn)生干擾。在此基礎上建立了一個適用于淮陰苜蓿葉片的雙向電泳體系。3、淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的響應為了研究淮陰苜蓿對不同高溫脅迫的響應,研究分析了不同溫度下(25℃、30℃、35℃和40℃)淮陰苜蓿的TTC降解能力、膜的熱穩(wěn)定性、丙二醛含量和蛋白質(zhì)組這四個方面的變化。研究發(fā)現(xiàn),溫度大于30℃就會引起由于膜穩(wěn)定性降低和膜脂質(zhì)過氧化而導致的細胞損傷,細胞損傷隨著時間的延長會逐漸恢復。與對照相比,在30v的環(huán)境條件下,淮陰苜蓿細胞活力呈先升高后降低,再升高的趨勢,在35和40℃的條件下,淮陰苜蓿細胞活力呈下降趨勢,這個趨勢在脅迫12h后得到緩解。35和40℃均會誘導脅迫蛋白的產(chǎn)生,但40℃誘導產(chǎn)生更多的脅迫蛋白。與35℃熱激處理的植株相比,40℃熱激處理的淮陰苜蓿植株顯示出更強的恢復能力。這些生理和蛋白質(zhì)組的變化說明淮陰苜蓿具有耐受高溫的能力,同時也為苜蓿耐熱蛋白質(zhì)組的研究提供理論基礎。4、淮陰苜蓿耐熱的蛋白質(zhì)組學研究淮陰苜蓿在蛋白質(zhì)組方面對高溫脅迫的響應尚不清楚。在這個研究中,淮陰苜蓿幼苗生長在不同溫度25℃(對照)和40℃(高溫處理)的生長室中,分別在處理后的24、48和72h收集植株葉片作為研究材料。研究分析了高溫對淮陰首蓿表型、生理和蛋白質(zhì)組學的影響。在蛋白質(zhì)組的分析上采用雙向電泳技術對提取蛋白進行分離,4個階段共有1.5倍以上差異的蛋白點96個,對這些蛋白點進行切膠酶解,質(zhì)譜成功鑒定了96個差異表達蛋白點中的81個。其中的5個蛋白進一步進行了mRNA水平的分析。蛋白質(zhì)組的分析結果對苜蓿耐熱的機理將在分子水平上有一個更好的認識。通過生物信息學分析,根據(jù)蛋白的功能將這些蛋白進行分類：證實這些蛋白與代謝相關的占7%,與能量相關的占48%,與蛋白合成相關的占1%,與蛋白運輸/儲存相關的占6%,與轉(zhuǎn)運相關的占4%,與胞內(nèi)運輸相關的占2%,與細胞結構相關的占1%,與信號轉(zhuǎn)導7%和疾病防御相關的占24%。這些蛋白位于細胞的中的葉綠體基質(zhì)(21%)、葉綠體類囊體(5%)、細胞質(zhì)(41%)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(9%)、微體(2%)、線粒體基質(zhì)(11%)、細胞核(4%)、細胞周質(zhì)(4%)、細胞質(zhì)膜(1%)和液泡(2%)。在此基礎上結合現(xiàn)有的文獻報道,對這些差異蛋白質(zhì)的功能、與耐熱的關系以及所起的作用等方面進行了分析討論。高溫逆境下,植株需要大量的能量用于啟動機體的防御性機制,比如抗氧化酶和熱激蛋白。熱激誘導與氨基酸代謝、蛋白合成、加工和轉(zhuǎn)運相關蛋白表達量的上調(diào),為脅迫響應蛋白的合成做準備。同時也促進了各種氨基酸的積累,增強了細胞的滲透調(diào)節(jié)能力。熱激促進了淮陰苜蓿的光合作用