酵母表達系統(tǒng)

關(guān)于酵母表達系統(tǒng)三酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母表達系統(tǒng)其它酵母表達系統(tǒng)第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（一）釀酒酵母表達系統(tǒng)釀酒酵母分泌系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)啟動子釀酒酵母表達系統(tǒng)存在的問題釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、釀酒酵母啟動子UASURSTATA起始位點編碼序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、轉(zhuǎn)錄起始位點；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1）糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的強啟動子，受葡萄糖誘導(dǎo)：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脫氫酶基因ADH釀酒酵母表達系統(tǒng)常用啟動子第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2）半乳糖激酶啟動子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和

GAL10基因連鎖在一起，獨立轉(zhuǎn)錄，共同調(diào)控B、GAL4產(chǎn)物與UAS結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄；GAL80產(chǎn)物抑制GAL4產(chǎn)物的活性，阻遏轉(zhuǎn)錄C、野生型GAL4表達水平低，產(chǎn)物活性可被GLAL80產(chǎn)物完全抑制，半乳糖誘導(dǎo)效果差半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2）半乳糖激酶啟動子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、將GAL4的啟動子換成GAL10的誘導(dǎo)型強啟動子B、半乳糖誘導(dǎo)GAL4高表達，不受GAL80產(chǎn)物抑制，激活GAL1等高效轉(zhuǎn)錄半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制PromoterGAL10第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3）pho4TS-PHO5啟動子A、PHO5啟動子在培養(yǎng)基缺磷酸鹽時啟動轉(zhuǎn)錄B、PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子C、pho4TS溫度敏感，35℃時失活，PHO5關(guān)閉D、pho4TS-PHO5啟動子通過降溫（23℃）誘導(dǎo)表達低溫誘導(dǎo)、磷酸鹽抑制第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天釀酒酵母系統(tǒng)常用分泌信號肽來源：

性結(jié)合因子：MF-α

酸性磷酸酯酶：PHO5

蔗糖酶：SUC2

殺手毒素因子：KIL2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天*保守性低，大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用*信號肽結(jié)構(gòu)：

釀酒酵母信號肽特點正電荷區(qū)疏水區(qū)極性區(qū)Met目的蛋白信號肽剪切位點第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天*分泌效率高*在酵母系統(tǒng)具有通用性*88個殘基組成

MF-α信號肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13編碼的二肽酶第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天糖基化位點：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進行糖基化

3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天*過糖基化（超糖基化修飾）：

N型或O型糖基的外鏈進一步形成龐大的、由甘露糖組成的、復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。增加了免疫原性、對活性與藥代穩(wěn)定性均有影響。*糖鏈組成O型糖鏈僅由甘露糖組成、而哺乳細(xì)胞的還含唾液酸基團釀酒酵母糖基化特點第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1）表達水平普遍不高

A、表達載體傳代不穩(wěn)定（YEp、YRp）

B、所采用的強啟動子調(diào)控不嚴(yán)謹(jǐn)

C、不能利用簡單的無機培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵2）分泌表達產(chǎn)物過糖基化4、釀酒酵母表達系統(tǒng)的缺陷第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（二）甲醇酵母表達系統(tǒng)甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母表達系統(tǒng)的應(yīng)用甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母（methylotrophicyeast)

指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。

畢赤酵母（Pichiapastoris)

漢森酵母（Hansenulaploymorpha)

假絲酵母（Candiaboidinii)

第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶A、甲醇代謝關(guān)鍵酶，占可溶蛋白的30%以上

B、名稱和拷貝數(shù)不同畢赤酵母/假絲酵母漢森酵母

醇氧化酶甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOXmethanoloxidase,MOXAOX1、AOX2MOX第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子AOX1與AOX2*畢赤酵母和假絲酵母基因組存在二個AOX基因AOX1、AOX2*AOX1與AOX2基因97%同源*AOX1占主導(dǎo)地位，負(fù)責(zé)AOX99%以上活性第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)

第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點A、表達水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150個甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達系統(tǒng)）E、可利用簡單無機鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實驗室和工業(yè)操作簡單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化

第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理宿主株與標(biāo)記基因甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件胞內(nèi)表達與分泌表達第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)宿主二大宿主系統(tǒng)主要特點項目畢赤酵母漢森酵母最適溫度30℃37℃最適pH值4.54.5甘油阻遏是否糖基化部分過度較正常高密度發(fā)酵100g/L100g/L第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)宿主二大宿主系統(tǒng)主要選擇標(biāo)記宿主

選擇標(biāo)記畢赤酵母

his4、G418、Zeocin、Cu++漢森酵母leu2、his3、ura3、G418第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)宿主畢赤酵母系統(tǒng)主要宿主株宿主株

特點Y11430野生型、Mut+GS115his4-、Mut+KM71his4-、aox1::ARG4(AOX1-)、Muts

SMD1168his4-

、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生長第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件YRp型載體：漢森系統(tǒng)傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達100拷貝。YIp型載體：A、在靶序列處線性化載體DNA，誘導(dǎo)同源重組B、有“插入”和“取代”二類整合模式C、主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合

第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天畢赤酵母系統(tǒng)模式表達載體第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1）AOX1位點插入宿主株:GS115、KM71可插入位點：5’AOX13’AOX1TT轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2）His4位點插入轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株:GS115、KM71可插入位點：5’His43’His4第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3）多基因插入事件（串聯(lián)整合）宿主株:GS115、KM71可插入位點：5’AOX13’AOX1TT轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4）基因取代（GS115，AOX1+）轉(zhuǎn)化子：His4+Muts第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天漢森酵母系統(tǒng)的高拷貝整合型表達載體高拷貝整合元件：A、高度重復(fù)序列：rDNA

提供多個整合位點B、缺陷型標(biāo)記基因：Leu2d

提高選擇壓力C、抗性標(biāo)記；neo

提高選擇壓力

第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達載體表達載體類型需要帶入ATG單位點第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達載體表達載體類型需要帶入ATG多位點第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達載體信號肽：PHO1第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達載體信號肽：MFα第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達載體信號肽：MFα標(biāo)記：Kan第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4、甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策載體穩(wěn)定性基因劑量整合位點甲醇利用表型mRNA5’端AT含量分泌信號表達產(chǎn)物穩(wěn)定性第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1）載體穩(wěn)定性同拷貝數(shù)時，整合型的比自主復(fù)制型的表達水平高YRp型載體的穩(wěn)定化：

選擇—非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費時，整合位點不確定。采用YIp型載體:

更易實現(xiàn)整合、整合位點清楚第38頁,共43頁，2024年2月25日，星期天