分子生物學(xué)第4章：蛋白質(zhì)的生物合成

第4章

蛋白質(zhì)生物合成第一節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄

(RNAtranscription)

●

基因表達(dá)的第一步●

以D.S.DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板●

在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下

●

模板單鏈DNA的極性方向為3’→5’,而非模板單鏈

DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’.DNA(書寫DNA序列時，僅寫非模板序列，可不注明極性方向)3’----TACTCAT----5’RNA5’----AUGAGUA----3’5’---ATGAGTA----3’Non-template(sensestrand)template(antisensestrand)若干基本概念

●

按AU，CG

配對的原則，合成RNA分子編碼鏈又稱有義鏈，是指與mRNA序列相同的那條鏈。非編碼鏈又稱反義鏈，是指那條根據(jù)堿基互補原則指導(dǎo)mRNA生物合成的DNA鏈?！衲骋换蛑灰砸粭l單鏈DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）

●RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion,elongation,termination

三過程

●從啟動子（promoter）到終止子（terminator）稱為轉(zhuǎn)錄單位

（transcriptionalunit）

●原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為polycistroninoperon

●轉(zhuǎn)錄原點記為+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值

真核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron,Nooperon

+1-10+10upstreamstartpointdownstream1.RNA聚合酶

從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來說，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個主要不同點：

A．轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物、以4種三磷酸核糖核苷（NTP）為底物；

B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板；

C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。

RNA聚合酶的主要功能：識別并結(jié)合于DNA上的啟動子；使DNA解鏈或恢復(fù)雙鏈；通過閱讀啟動子序列，確定轉(zhuǎn)錄方向和模板鏈；選擇正確的NTP，按5’－3’方向催化合成RNA；識別終止子，停止轉(zhuǎn)錄；和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速度；在受阻遏的情況下進(jìn)行自我調(diào)整，即借助于輔助因子切割轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端，恢復(fù)合成RNA。

1）大腸桿菌RNA聚合酶σβααβ’CoreEnzymeHoloEnzyme

forelongationforinitiation依靠靜電作用力依靠空間結(jié)構(gòu)非專一性與DNA結(jié)合專一性與

DNA結(jié)合結(jié)合常數(shù)；1011/mol結(jié)合常數(shù)；1014/mol半衰期；60min半衰期；數(shù)小時cover60bp

σβα

αβ’σ因子；★重復(fù)使用(Reusable)

★使全酶識別SextamaBox(-35),與模板鏈結(jié)合

★修飾RNApol

構(gòu)型，降低全酶與DNA的非專一性結(jié)合力（107/mol）

增強全酶與R,Bsite的專一性結(jié)合力

(1014/mol)導(dǎo)致RNA鏈的延伸緩慢α因子；★促使RNApol與DNA模板鏈結(jié)合

★位于前端的α因子使雙鏈解鏈為單鏈

★位于尾端的α因子使單鏈新聚合為雙鏈

★核心酶的組建因子

α+α→2α+β→+β’

★αArg-COOHR-PP(ADP)-R-PP…(40)ADP-核糖基化

ADP核糖基聚合酶

降低與promoter的特異結(jié)合力β因子；★促進(jìn)RNApol+NTP→RNAelongation

★完成NMP之間的磷酸脂鍵的連接

★Editing

★與

Rho(ρ)因子競爭RNA3’-end

★構(gòu)成HoloEnzyme后，β因子含有

兩個位點Isite(Rif

S);Esite(Rif

R);要求高濃度的ATPorGTP專一性地結(jié)合ATPorGTP對

NTP非專一性結(jié)合β’

因子；★強堿性亞基★促使RNA與非模板鏈（sensestrand）結(jié)合

★受K酶抑制

HoloEnzyme含有五個功能位點

★sensestrandDNAbindingpoint(β’)

★DNA/RNAhybridsite(β)

★D.S.DNAunwindingpoint(α)

★D.S.DNArewindingpoint(α)

★

σfactorpoint

原核生物RNApol(Core)的結(jié)構(gòu)與功能EnzymeMovementDNAcodingstrand(β’)Rewindingpoint(α)Unwindingpoint(α)RNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)DNAtemplatestrandHoloEnzyme使

DNA形成10-17bp的解鏈區(qū)

原核生物RNApol(Core)的結(jié)構(gòu)與功能EnzymeMovementRNAbindingsiteRNA/DNAhybrid(β)IEIsite(Rif

S);Esite(Rif

R);非專一性結(jié)合

NTP專一性地結(jié)合ATPorGTPThreeRNApolymerasesRNApolymeraseI,II,III2）RNApolymeraseinEukaryotes

Alpha-amanitin

(雙環(huán)十八肽)

isolatedfromAmanitaphalloides(death-cap)rRNAisstillmadeinpresentofα-amanitinα-amanitin-resistantRNApolImakes28s,18s,5.8srRNAα-amanitin-sensitiveRNApolIImakesmRNA(lowC.)α-amanitin-sensitiveRNApolIIImakes5srRNAtRNA…(highC.)RNApolIRNApolIIRNApolIII活性50-70％20-40％約10％位置核仁核質(zhì)核質(zhì)amanitinα-amanitin-resistantα-amanitin-sensitive物種特異功能28s,18s,5.8srRNA

mRNA5srRNAtRNA…真核生物RNA聚合酶比較2.轉(zhuǎn)錄的起始RNA聚合酶結(jié)合到識別位點移動到一個起始位點上建立一個開放式啟動子復(fù)合物（1）RNA聚合酶全酶與模板DNA接觸，生成非專一的復(fù)合物在模板上移動；（2）全酶識別啟動子，產(chǎn)生封閉的“酶-啟動子二元復(fù)合物”；（3）全酶與啟動子-10緊密結(jié)合，模板DNA局部解鏈，形成開放式復(fù)合物。（4）全酶與轉(zhuǎn)錄起始點結(jié)合，頭兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，形成酶-啟動子-RNA三元復(fù)合物。（5）轉(zhuǎn)錄起始成功，RNA聚合酶釋放σ因子，核心酶-DNA-新生的RNA形成轉(zhuǎn)錄延伸三元復(fù)合物。啟動子（Promoter）位于基因5’端的調(diào)控區(qū)域，能與RNA聚合酶結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄。

結(jié)構(gòu)影響其與RNApol的親和力，決定基因表達(dá)模式和表達(dá)水平。1）原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)SextamaBox;

RNApol.recognitionsite(Rsite)TTGAC(SextamaBox)-35siteRNApol.looselybindingsitePribnowBox;

TATAAT(pribnowBox)-10siteRNApol.firmlybindingsite(Bsite)－10盒和－35盒一起又稱作核心啟動元件（corepromoterelements）

某些特殊的強啟動子還有一個額外的元件，即UP元件（UPelement）。UP元件常位于核心啟動元件上游-40和-60之間，能夠加強啟動子的功能。Promoter的結(jié)構(gòu)與功能

(Prok.E.coliLac)

●-70~-40CAP—cAMPbindingsite

●-35~-10RNApol.bindingsite

核心啟動元件（corepromoterelements）

基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點CAP;CatabolitegeneActivatorProteincAMPAcceptorProtein(環(huán)化AMP受體蛋白)(降解物基因激活蛋白)

PromoterregionidentifiedbyDNAasemethod

RNApolymerase(noNTP)DNAsequencing

DNase

digestionDNA+dissolvePromoterregionincluding

SextamaBox;

RNApol.recognitionsite(Rsite)TTGAC(SextamaBox)-35siteRNApol.looselybindingsitePribnowBox;

TATAAT(pribnowBox)-10siteRNApol.firmlybindingsite(Bsite)Initiationsite;

+1RNAtranscriptionalstartpoint(Isite)

A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNAR-35

B

-10I+1SextamaBoxPribnowBoxInitiationl

SextamaBox與PribnowBox間距17bp,

有利于RNApol啟動l

SextamaBoxor

PribnowBoxmut.

間距趨近于17bp，upmutation間距遠(yuǎn)離于17bp，downmutation17bp的間距較17bp的序列對轉(zhuǎn)錄更為重要SextamaBoxand

PribnowBoxmut.

→

轉(zhuǎn)錄率下降100X→

轉(zhuǎn)錄率下降1000XPromoter與σfactor間的結(jié)合專效性

●決定了

strongpromoter&weakpromoter★不同啟動子的-35，-10區(qū)序列間存在較為

保守的標(biāo)準(zhǔn)序列(標(biāo)準(zhǔn)啟動子)

★啟動子中-35,-10區(qū)序列的差異影響與

RNApol

中

σ因子的結(jié)合能力

σ

factorisresponsibleforrecognitionofconsensussequenceofpromoterandonlyrequiredforinitiation.★與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性愈高

→啟動強度愈大

與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性愈低→啟動強度愈小

與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列差異很大→由另一種σ因子啟動E.coli;4σfactor→recognition4promotersBacillus;10σfactor→recognition10promoters

2）真核生物(RNA聚合酶II)的啟動子結(jié)構(gòu)

1-4Kb

-110－-80-70-30+1

GCbox

CAAC/TboxTATAboxCap

EnhancerUPEcorepromoter

Promoter(basicfactor)

l

Promoterfunctions

CAATbox

(modulator)controllingtranscriptionalefficiencyTATAbox

(selector)controllingstartingpointandefficiency

Isite

(initiator)determinationinitiationpointandcappingofmRNA

真核生物轉(zhuǎn)錄啟動

l

細(xì)胞膜l

Transcriptionalfactor(TF,transfactor)

RNApolCis-factorl

染色體狀態(tài)的調(diào)整

核小體

包裝的解體

外界信息的感知與傳遞細(xì)胞信號傳遞complex細(xì)胞核順式作用元件（Cis-actingelement）：能夠影響同一條DNA序列或相連DNA序列活性得特定的DNA片斷。例如，啟動子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列，它可以影響該基因和同一條染色體上另一個基因的表達(dá)活性。反式作用因子（Trans-actingfactor）：一種基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，能夠影響位于基因組別處或者另一條染色體另一個基因的表達(dá)活性（反式作用）。一般指蛋白質(zhì)，它通過同順式作用元件（DNA）之間的相互作用影響基因的表達(dá)。★transcriptable,translatablegene★

cisactingelementtranscriptablebutnontranslatablegene(tDNA,rDNA)nontranscriptable,nontranslatablegene(promoter,operator)

AffectstheactivityonlyofDNAsequencesonitsownmolecularofDNA,thispropertyusuallyimpliesthatthefactordoesnotcodeforprotein通過核苷酸自身的特異二級結(jié)構(gòu)控制與它緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，一般不編碼蛋白質(zhì)。(無基因產(chǎn)物的DNA功能區(qū))

基因的類型★transactingfactorAffectstheactivityofanygenelocatedongenomebyitstranslatedproduct.通過擴散自身表達(dá)產(chǎn)物（酶，調(diào)節(jié)蛋白）控制其他基因的表達(dá)可轉(zhuǎn)錄，可翻譯調(diào)節(jié)蛋白的DNA功能區(qū)可通過互補測驗體系確定其功能區(qū)域Cis(Latin=here)Incis=OnthesameDNAmolecularTrans(Latin=across)Intrans=OnthedifferentDNAmolecular★cis-dominantTheabilityofasite(cis-factor)tocontroladjacentgeneirrespectiveofthepresenceinthecellofotherallelesofthesite.cisactingfactor對與其緊密連鎖基因的控制效應(yīng)不受其等位基因的影響。蛋白質(zhì)mRNAPADNAPB轉(zhuǎn)錄起始點mRNA順式調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)反式調(diào)節(jié)BA

反式作用因子與順式作用元件相互作用影響基因表達(dá)l

基本水平轉(zhuǎn)錄的

cis-factor

(promoterorbasicfactor)

Corepromoter(Capsite,TATAbox必需因子)

UPE(UpstreamPromoterElement)(CAATbox,GCbox)

Forhousekeepinggene(constitutiveexpression)

與轉(zhuǎn)錄啟動相關(guān)的cis-factorsl

特異誘導(dǎo)高效表達(dá)的cis-factor

EnhancerForluxurygene(inducibleexpression)

l

Capsite;initiationpoint(+1)Cappingm7GpppA/G------70±---AUG---(inmRNA)1-4Kb

-70-30+1

CAAC/TboxTATAboxCap

EnhancerUPEcorepromoter

Promoter(basicfactor)

InitiationregionPyPyANT/(A)PyPyl

TATAbox/Hognessbox/Goldberg-Hognessbox(-30)RichATandrichGCflanked

richGC------TATAA(T)AA(T)------richGC

8297938563(37)8350(37)1-4Kb-70-30+1

CAAC/TboxTATAboxCap

EnhancerUPEcorepromoter

Promoter(basicfactor)

l

CAATbox(CATboxUPE)(-70)

GCGC-----GGC(T)CAATCT----

ResponsetoeffectoftranscriptionRange30bp±

1-4Kb

-70-30+1

CAAC/TboxTATAboxCap

EnhancerUPEcorepromoter

Promoter(basicfactor)

SpecialboxArabidopsis

Ibox(GATAAG)----5-20--------Gbox------Pea

Hbox(CCTACC)----5-20--------Gbox------

modulHSE(HeatShockElement)GRE(

GlucocoricoidResponseElement)糖皮質(zhì)激素應(yīng)激元件MRE(MetalResponseElement)TSE(TissueSpecialElement)l

InducibleexpressedbyenvironmentIg

ATGGAAAT+Oct-2factor→B細(xì)胞表達(dá)GHATGAATAT+Pit-1factor→腦下垂體表達(dá)

l

EnhancerEnhanceexpressionBasicexpressionPositionnotbefixedisolatedregionBi-directionalelementMono-directionalelementEnhancerPromoterNoforspecialgeneonlyforspecialgene★Enhancer與Promoter的比較與基本轉(zhuǎn)錄相關(guān)的trans-factor

Trans-factorforbasictranscription

l

TF(I,II,III)TranscriptionalFactorl

TBP(TATAboxBindingProtein)l

TAF(TBPAssociateFactor)l

RAP(RNApol.Associateprotein)真核生物中RNApol的作用必須有其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白在啟動子處的先期結(jié)合才能啟動轉(zhuǎn)錄Cis-factor+

TIC(TranscriptionalInitiateComplex)l

模板DNA中G/C的存在delayTranscriptiondelay(轉(zhuǎn)錄過程的延宕）

3.轉(zhuǎn)錄的延伸Pre-matureterminationoftranscription

——RNApausing由于核小體致密的結(jié)構(gòu)l

3’-end具有高親和力結(jié)合的核蛋白質(zhì)影響l

SilencerorDNAloop結(jié)構(gòu)的影響l

DNA分子的彎曲4.Transcriptiontermination轉(zhuǎn)錄終止概念Terminator

isasequenceofDNA,representedattheendofthetranscript,thatcausesRNApolymerasetoterminatetranscription.Terminator種類Rho-independentterminator

Rho-dependentterminator

DifficulttoidentifytheprimarytranscriptInprokaryotesInEukaryotesbecausepre-mRNAprocessing

Rho-independentterminator(simpleterminator)

PalindromicsequenceG/CrichregionthatformhairpinsofvaryinglengthsinRNAG/CrichhairpinarefollowedbyarunofUresiduesinRNA

Structure

Rho-dependentterminatora)

Structurel

Palindromicsequence

l

noG/Crichinpalindrom

butformloosehairpininRNAl

palindromicsequencearenotfollowedbypolyA/TinDNA●Rhofactorbeneededforterminationb)Function

RNApolRNApolpausing60’’moreorlessorread-throughterminationRhoRhofactorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingatarho-dependentterminator.

c)Rho-factor(ρ)l

55kdl

ContestRNA3’-endwithβfactorl

ATPase-like,GTPase-likeactivityl

轉(zhuǎn)錄終止效率取決于緊隨回文的下游序列---保證RNA/DNA具有一定松弛的結(jié)合力---過低的結(jié)合力→成為Rho-independentterminator---過高的結(jié)合力→引起RNApolread-through---各依賴Rho

因子的終止子間的效率差異取決于終止子區(qū)DNA/RNA間結(jié)合力的差異Rho

因子對轉(zhuǎn)錄的終止過程Anti-termination破壞終止點RNA的莖－環(huán)結(jié)構(gòu)

原核生物由于轉(zhuǎn)錄－翻譯耦聯(lián)，mRNA立即通過核糖體合成蛋白質(zhì)，氨基酸的濃度作為信號決定了核糖體的移動。Trp操縱子前導(dǎo)序列可以形成兩種可能的二級結(jié)構(gòu)

依耐于蛋白因子的抗轉(zhuǎn)錄終止5.Pre-RNAprocessinginEukaryotes

pre-mRNAX≈7kb±;Max.≈20kb;4-10xmatureRNAX≈8Introns

概念;pre-RNAcappingtailingsplicingmethylationediting

生物學(xué)意義;matureRNA

●preventpre-RNAfromdigestedbyRNaseastemplate

l

interruptedgenemoveintrons原核與真核生物mRNA比較半衰期多/單順反子5’帽子結(jié)構(gòu)，3’的poly（A）尾巴最大的差異是真核基因是斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄翻譯被時空阻隔，mRNA有一個加工成熟的階段斷裂基因表達(dá)程序先轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄物，即核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），又叫前體mRNA；然后經(jīng)過刪除核連接，去除無關(guān)的DNA間隔序列的轉(zhuǎn)錄物，便形成成熟的mRNA分子；它從細(xì)胞核中輸送到細(xì)胞質(zhì)，再翻譯成相應(yīng)的多肽鏈。這種在mRNA成熟過程中其轉(zhuǎn)錄物被剪除掉的對應(yīng)DNA部分叫做間隔序列或內(nèi)含子，被保留下來的對應(yīng)的DNA部分叫編碼序列或外顯子。

pre-RNAcapping

Cap-0m7GpppXpYp-------Cap-1

m7GpppXmpYp-------Cap-2m7GpppXmpYmp-------

Types&structureofCAPinEukayotesCap0New3’-OHendCap1Cap2m6A

thepositioncanbemethylatedalsoinCap1帽子結(jié)構(gòu)的意義翻譯起始的必要結(jié)構(gòu)，給翻譯起始因子與mRNA的識別提供信號保護mRNA免遭核酸酶破壞，增加穩(wěn)定性pre-RNAtailing●概念

Apoly(A)tail(50-200±)

beadded

at

-20Nt±tailingsignal(AAUAAA)

from3’-endofPre-RNARabbitα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA-----------poly(A)3’-20Rabbitβ-globinmRNA5’-------UGGCUAAUAAA-----------poly(A)3’-20Manα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA------------poly(A)3’-20Manβ-globinmRNA5’-------UGCCUAAUAAA------------poly(A)3’-20

Poly（A）尾巴的功能提高mRNA穩(wěn)定性，利于從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)但是組蛋白沒有尾巴可能對翻譯效率有影響，保持mRNA一定的半衰期pre-RNA剪接的分子基礎(chǔ)

剪接裝置與底物

a)核內(nèi)RNA(nRNA/hnRNA)l

RNApolI→18s,5.8s,28srRNA(nucleolus)

RNApolII→mRNA,U1,U2,U4,U5-SnRNA

(nucleoplasm)

RNApolIII→tRNA,5srRNA,U6-SnRNA

(nucleolus&nucleoplasm)

l

SnRNA≤200Nt;5’-endwithCap-2RichU(namedSnRNAU1—U6)b)RNP(核內(nèi)僅次于組蛋白的重要蛋白)

l

Electronmicroscopepictureofnuclear(Pre-RNA+nucloe-protein)→250kdcomplex

完成capping,tailing,splicing,transfering…

Ribosenuclearproteosome(RNP)

pre-RNA+SnRNA+>8proteins核糖核蛋白體c)

Intron---邊界保守序列高度保守，成為剪接過程重要的識別序列人類許多重要疾病的病因junctionseq.mut.→異常剪接→病癥例；地中海貧血癥1/4Junctionseq.mut.ofGlobingene→干擾mRNA成熟

mRNA剪接的一致序列幾乎所有的核內(nèi)mRNA前體內(nèi)元都有相同的起始和結(jié)尾：外元/GU－內(nèi)元－AG/外元（主要），或者外元/AU－內(nèi)元－AC/外元（次要）更確切的順序隨后又被發(fā)現(xiàn)如下：5’-AG/GUAAGU－內(nèi)元－YNCURAC－YNNAG/G-3’，兩端的/符號是外元和內(nèi)元的界限，Y代表嘧啶（U或者C），YN代表大約9個嘧啶，R代表嘌呤（A或G），N代表如何一個堿基。A是一個特殊的A，它參與分叉切割中間體的形成。剪接需要的一致序列（動物）mRNA前體剪接過程中形成套索樣結(jié)構(gòu)GroupIIsplicingmodel(Michel1982)

Junctionsequence

BranchSite

of7Ntupstreamof3’-junctionseq.

●

5’----exon-----

GUGCG---------B.S----Py

AU----exon---3’

供點受點----Py

Pu

Py

PyUA

Py---

100%

●在BranchSite的兩側(cè)存在一些短的序列，與其上游10-50Nt處互成IR,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(但A

不包含在IR序列內(nèi),從而被排除成芽狀突起）

5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’Intron

IRIR

5’

GAU