2-3-分子生物學(xué)與基因工程

IntroductiontoBiochemicalEngineering

LeiChen,AssociateProfessorDepartmentofPharmaceuticalEngineeringTelmail:lchen@MolecularBiology一、回顧

1、創(chuàng)世說與進(jìn)化論達(dá)爾文、1859年《物種起源》，確立了進(jìn)化論的概念2、細(xì)胞學(xué)說（1847）德國Schleiden德國Schwann細(xì)胞學(xué)說的主要內(nèi)容有：①細(xì)胞是有機體，一切動植物都是由單細(xì)胞發(fā)育而來，即生物是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所組成；②所有細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和組成上基本相似；③新細(xì)胞是由已存在的細(xì)胞分裂而來；④生物的疾病是因為其細(xì)胞機能失常。3、經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué)●

19世紀(jì)中葉，蛋白質(zhì)●19世紀(jì)中葉到20世紀(jì)初，組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸被相繼發(fā)現(xiàn)（1935年，蘇氨酸）●著名生物化學(xué)家Fisher還論證了連接相鄰氨基酸的“肽鍵”的形成。

孟德爾GregorMendel(1822-1884),奧地利科學(xué)家，經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人1857-1864的7年中，進(jìn)行了豌豆的雜交研究，1865年發(fā)表了他的劃時代的論文《植物雜交試驗》在論文中提出了“遺傳因子”的概念，并得出了三條規(guī)律：●顯性規(guī)律(TheLawofDominance)●分離規(guī)律（TheLawofSegregation）●自由組合規(guī)律（TheLawofIndependentAssortment）在孟德爾遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，美國著名的遺傳學(xué)家Morgan又提出了基因?qū)W說。連鎖遺傳規(guī)律二、分子生物學(xué)定義

從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)

，主要指遺傳信息的傳遞（復(fù)制）、保持（損傷和修復(fù)）、基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）與調(diào)控。三、分子生物學(xué)發(fā)展簡史1、孕育階段（1820~1950年代）●1865年，孟德爾發(fā)表了他的《植物雜交實驗》一文，首次闡述了生物界有規(guī)律的遺傳現(xiàn)象?！斑z傳因子”●

1900年，孟德爾遺傳規(guī)律被證實，成為近代遺傳學(xué)基礎(chǔ)?！?/p>

1910年，Morgan的染色體—基因遺傳理論，Gene

存在于染色體上。進(jìn)一步將“性狀”與“基因”相耦聯(lián)，成為現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基石?！?944年，美國微生物學(xué)家Avery證明基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre

的雜合病毒實驗：

煙草花葉病毒的感染和繁殖過程－證實RNA也是重要的遺傳物質(zhì)。2、創(chuàng)立階段（1950~1970年代）●1953年，美國科學(xué)家Watson和英國科學(xué)家Crick提出DNADoubleHelixmodel1962年Watson、Crick與Wilkins共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎通過對DNA分子的X射線衍射研究證實了前兩者提出的DNA的模型●1958年Crick提出中心法則?！?958年，Meselson和Stahl證明DNA半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是遺傳消息能準(zhǔn)確傳代的保證。是物質(zhì)穩(wěn)性的分子基礎(chǔ)。

StahlMeselson●1959年，美籍西班牙裔科學(xué)家Uchoa和美國Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA和RNA的生物合成機理而分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎?！?961年，法國科學(xué)家Jacob（雅各布）

和Monod（莫諾）提出操縱子學(xué)說1965年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎●1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解讀了遺傳密碼及其在蛋白質(zhì)合成方面的技能而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。3、發(fā)展階段（1970年代以后）●

1970年，Temin和Baltimore在RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。1975年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎 ●1977年，Sanger等人發(fā)明了一種測定DNA分子內(nèi)核苷酸序列的方法（雙脫氧鏈終止法）。

桑格(Sanger）吉爾伯特(Gilbert）伯格（Berg）1980年，與Gilbert和Berg共享諾貝爾化學(xué)獎Sanger還由于測定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)而獲得1958年諾貝爾化學(xué)獎?！?983年，美國遺傳學(xué)家McClintoc因發(fā)現(xiàn)可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。1983.BarbaraMcClintock(86y)DNAtransposableelememt

●1989年Altman、Cech發(fā)現(xiàn)核酶（Ribozyme,某些RNA具有酶的功能）獲Nobel化學(xué)獎。

Kohler&Milstein→MonocloningantibodyRoberts&Sharp→SplittinggeneMullis&Smith→PCRtechnique&genemutationinlocusGilman&Rodball→G-proteinasasignalmolecularincellLewis&Nusslein-Volhard&Wieschaus→ControlgeneofbodydevelopinginDrosophila四、分子生物學(xué)研究內(nèi)容●DNA重組技術(shù)（基因工程）●基因的表達(dá)調(diào)控●生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究(結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）●基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究●DNA重組技術(shù)1、可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽

;2、可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu);3、可被用來進(jìn)行基礎(chǔ)研究

1972年,Boyer獲得第一個重組DNA分子1972-BergEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA五、分子生物學(xué)展望

21世紀(jì)是生命科學(xué)世紀(jì)，生物經(jīng)濟時代結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)成為新的熱門領(lǐng)域。ExamplesofGeneticEngineeringInsulinExamplesofGeneticEngineeringTheCoA-transferaseoftheclassicalclostridialacetonepathwaywasreplacedbyathioesterase.Thenewacetonepathwayisacetateindependent.ExamplesofMetabolicEngineeringDirectphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehydeExamplesofMetabolicEngineeringIntroductionofH2pathwaytobalance3HBproductionPolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-用于DNA的擴增PolymeraseChainReaction(PCR)(I)1993Nobelprizeinchemistry,KaryB.MullisandMichaelSmithPolymeraseChainReaction(PCR)(II)PolymeraseChainReaction(PCR)(III)PolymeraseChainReaction(PCR)PolymeraseChainReaction(PCR)PCRApplicationsPCR的應(yīng)用AmplificationofageneofinterestforcloningDNAcloning/recombinantDNA技術(shù)

重組DNA技術(shù)發(fā)展史40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息傳遞問題。50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。

1重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)2.關(guān)鍵性實驗技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠基

1、DNA分子的切割與連接技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學(xué)家有了進(jìn)行DNA操作的基本工具。2、載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收λ噬菌體的DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。3、Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈反應(yīng)重組DNA技術(shù)發(fā)展史重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique):是按照人們意愿，在體外對DNA分子進(jìn)行重組,再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝?；蚩寺?genecloning)分子克隆(molecularcloning)3重組DNA技術(shù)的概念重組DNA技術(shù)發(fā)展史4重組DNA技術(shù)的基本步驟1、四大要素

①外源基因②載體③工具酶④受體細(xì)胞

重組DNA技術(shù)發(fā)展史2、重組DNA技術(shù)的基本步驟

①目的基因的獲得與載體的制備②目的基因與載體DNA的連接③重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④重組體的篩選與重組DNA的鑒定⑤克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分離純化重組DNA技術(shù)發(fā)展史重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)發(fā)展史5重組DNA技術(shù)的意義重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時間重組DNA技術(shù)使人能對生物進(jìn)行定向改造體外大量擴增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。重組DNA技術(shù)發(fā)展史酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5’-OH末端末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3‘末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶Ⅲ從DNA鏈的3’末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5’末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5’或3’末端的磷酸基團(tuán)6重組DNA實驗中常見的主要工具酶重組DNA技術(shù)發(fā)展史限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）重組DNA技術(shù)發(fā)展史第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶重組DNA技術(shù)發(fā)展史Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)結(jié)構(gòu)，是

DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG重組DNA技術(shù)發(fā)展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口重組DNA技術(shù)發(fā)展史DNA連接酶:通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片斷連接成一個整體DNA分子。T4ˉDNA連接酶EcoRI連接酶T7ˉDNA連接酶重組DNA技術(shù)發(fā)展史目的基因的來源原核細(xì)胞真核細(xì)胞：cDNA或gDNA文庫人工合成及PCR擴增目的基因

天然DNA（染色體DNA、病毒DNA(噬菌體DNA)、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA）重組DNA技術(shù)發(fā)展史克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。重組DNA技術(shù)發(fā)展史載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。重組DNA技術(shù)發(fā)展史個