MiR-130b通過(guò)TGF-β1通路調(diào)節(jié)自噬對(duì)糖尿病腎臟纖維化的作用和機(jī)制的研究

MiR-130b通過(guò)TGF-β1通路調(diào)節(jié)自噬對(duì)糖尿病腎臟纖維化的作用和機(jī)制的研究目的:糖尿病腎病(DN)又稱(chēng)糖尿病腎小球硬化癥,糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥,同時(shí)也是導(dǎo)致糖尿病患者致死的首位原因。DN的發(fā)病機(jī)制龐雜,參與調(diào)控的通路眾多,在診斷上一般依賴(lài)尿微量白蛋白和腎臟組織活檢,缺乏有效的、穩(wěn)定的、非創(chuàng)傷性的檢測(cè)方法。醫(yī)治上給予降血糖和血壓,僅能延緩DN的發(fā)展。而人工透析和腎臟移植治療不僅代價(jià)高昂,而且應(yīng)用上有局限性。隨著對(duì)DN研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)自噬與DN腎臟纖維化聯(lián)系尤為密切。另一方面,miRNA是在機(jī)體穩(wěn)定存在的、擁有高度組織特異性的小分子RNA,在DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用重大。本研究旨在通過(guò)建立db/db小鼠模型和人腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng),對(duì)miR-130b的表達(dá)、纖維化相關(guān)蛋白以及自噬活性水平進(jìn)行研究,探討miR-130b對(duì)DN的自噬與腎臟纖維化的影響,并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),以揭示糖尿病腎病纖維化過(guò)程中的潛在機(jī)制,為DN的腎臟纖維化的預(yù)防和治療提供新方向。方法:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用db/db小鼠及C57BLKS小鼠建立糖尿病腎病模型和對(duì)照,監(jiān)測(cè)各組小鼠的一般情況和指標(biāo),喂養(yǎng)結(jié)束后收集相應(yīng)標(biāo)本檢測(cè)小鼠的空腹血糖、血肌酐等,并用HE和Masson染色觀察各組小鼠腎臟組織的病理學(xué)變化,透射電鏡下觀察腎臟細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)。qRT-PCR法和Westernblotting法檢測(cè)小鼠腎臟組織纖維化和自噬相關(guān)因子的表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,分別用miR-130bmimics和inhibitor及相應(yīng)的對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染濃度為0或10ng/mlTGF-β1處理的HMC細(xì)胞,qRT-PCR法、Westernblotting法、JC-1法檢測(cè)各組腎臟及細(xì)胞的自噬及纖維化相應(yīng)因子,以明確過(guò)表達(dá)或者下調(diào)miR-130b對(duì)腎臟和HMC細(xì)胞自噬和纖維化的影響,明確TGF-β1對(duì)HMC細(xì)胞自噬和纖維化的影響,明確miR-130b、TGF-β1、自噬與糖尿病腎臟纖維化之間的關(guān)系。預(yù)測(cè)miR-130b的靶基因并明確其與miR-130b的聯(lián)系。結(jié)果:db/db小鼠的空腹血糖較正常對(duì)照組明顯上升,血清肌酐明顯上升(P<0.001)。在db/db組的腎臟中可觀察到腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化和基底膜變厚等病理變化。miR-130b、纖維化因子Ⅰ型膠原蛋白、FNmRNA的表達(dá)都是db/db模型組腎臟較正常對(duì)照組腎臟組織中的表達(dá)升高明顯,差異顯著,分別為(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。WB檢測(cè)db/db模型組小鼠腎組織FN蛋白、colⅠ蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組小鼠相比升高明顯,且2組間的差異很大(P<0.001,P<0.01);db/db模型組小鼠腎組織ACVR1的表達(dá)水平比正常對(duì)照組要低(P<0.01);而自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)是降低的(P<0.01,P<0.01),p62的表達(dá)卻高于對(duì)照組(P<0.01)。透射電鏡下db/db模型組小鼠腎小球基底膜增厚明顯。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞纖維化相關(guān)因子結(jié)果顯示:高糖培養(yǎng)的模型組HMC細(xì)胞,其miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表達(dá)是高于正常對(duì)照組的(P<0.01),而miR-130b靶基因ACVR1的mRNA表達(dá)水平則低于對(duì)照組(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-130bmimics組與miR-130bmimicsNC組比較,miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表達(dá)水平升高,ACVR1mRNA的表達(dá)明顯減弱。相反地,轉(zhuǎn)染miR-130binhibitor組與miR-130binhibitorNC組比較,miR-130b與FN、ColⅠ的mRNA表達(dá)下降,但是ACVR1mRNA的表達(dá)水平升高。而轉(zhuǎn)染miR-130bmimics+TGF組與miR-130bmNC+TGF組相比,miR-130b及其靶基因ACVR1的mRNA表達(dá)分別呈上升和下降趨勢(shì),同時(shí)有FN、ColⅠ的表達(dá)下降。轉(zhuǎn)染miR-130binhibitor+TGF組與miR-130biNC+TGF組的比較結(jié)果顯示,前者在miR-130bFN、ColⅠmRNA表達(dá)方面比后者減少,伴隨著ACVR1mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。Westernblotting結(jié)果可見(jiàn):與正常對(duì)照組相比,模型組的自噬誘導(dǎo)蛋白Beclin1、LC3II/I的表達(dá)量都是減少的(P<0.001,P<0.001),而自噬抑制標(biāo)記蛋白p62的表達(dá)量呈上升趨勢(shì),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。纖維化相關(guān)蛋白FN、ColⅠ的相對(duì)表達(dá)量是增強(qiáng)的,于此同時(shí),模型組ACVR1的表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P<0.001)。轉(zhuǎn)染miR-130bmimics組相較于其N(xiāo)C組,自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)量減少劇烈(P<0.001)、LC3II/I的表達(dá)量亦如此(P<0.001),p62蛋白的表達(dá)水平則升高(P<0.001)。伴隨著FN、ColⅠ的表達(dá)增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染miR-130bmimics組靶基因ACVR1的表達(dá)量也低于其N(xiāo)C組(P<0.001)。而轉(zhuǎn)染miR-130binhibitor組與轉(zhuǎn)染miR-130binhibitorNC組比較,Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表達(dá)量則是卓越上升的,p62蛋白的表達(dá)明顯下降,而纖維化增強(qiáng)。與miR-130bmNC+TGF組比較,miR-130bmimics+TGF組Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表達(dá)水平下降幅度大,而p62的表達(dá)水平是升高的,伴有纖維化程度增強(qiáng)。與miR-iNC+TGF-β1組相比,miR-inhibitor+TGF-β1組的Beclin1的表達(dá)增強(qiáng),LC3II/I和靶基因ACVR1蛋白也是如此。自噬抑制標(biāo)記蛋白p62的表達(dá)水平有所下降,纖維化水平增強(qiáng)。JC-1線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)可見(jiàn),正常對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)于高糖模型組是升高的,說(shuō)明模型組HMC細(xì)胞的線(xiàn)粒體自噬可能受到了抑制。而轉(zhuǎn)染miR-130bmimics組與miR-130bmimicsNC組比較,其膜電位也是相對(duì)升高的。轉(zhuǎn)染miR-130binhibitor的情況卻恰恰相反,該組細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位是較miR-130binhibitorNC組相對(duì)下降的。結(jié)論:db/db