GB-T《核酸適體活性評價標準操作規(guī)范》

ICSFORMTEXT07.080FORMTEXTB20/39中華人民共和國國家標準GB/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2017FORMTEXTFORMTEXT核酸適體活性評價標準操作規(guī)范FORMTEXTGeneraltechniquerulesforactivityevaluationofaptamerFORMTEXT點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識FORMDROPDOWNFORMTEXTFORMTEXT-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施GB/TXXXXX—2017核酸適體活性評價標準操作規(guī)范范圍本標準規(guī)定了核酸適配體與靶標結合的親和力和特異性的評價，確立核酸適配體與靶標結合的專一性和選擇性的方法驗證，建立性能評價的技術通則。本標準適用于針對細胞，大分子，小分子，復雜靶標等不同層次靶標體系的核酸適配體。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求術語和定義核酸適配體(Aptamer)能夠與多種目標物（蛋白、藥物、金屬離子、無機或有機分子、細胞、組織）發(fā)生高親和性和特異性結合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）分子。平衡解離常數(shù)(disocciationconstant，Kd)是靶標物質被核酸配體結合一半時靶標物質的濃度常數(shù)。操作步驟核酸適配體與靶標的結合能力分析方法測定篩選獲得核酸適配體與靶標結合的平衡解離常數(shù)（Kd），Kd值越小表明兩者相互作用越強。Kd常用測定方法：熒光光譜法：適用于細胞，大分子，小分子，復雜靶標等。對核酸適配體進行熒光標記，稀釋到不同濃度，與相同濃度的靶標共混并在合適的條件下孵育，將結合后的靶標與未結合的核酸適配體分離，使用熒光光譜儀測定核酸-靶標復合物的熒光強度，繪制熒光強度與核酸適配體濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。流式細胞術：適用于細胞、大分子、小分子等。對核酸適配體進行熒光標記，釋到不同濃度；與相同濃度的靶標共混并在合適的條件下孵育，將核酸-靶標復合物通過流式細胞儀，測定帶有熒光標記的核酸-靶標復合物的數(shù)量，繪制其與核酸適配體濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。表面等離子共振法：適用于細胞、大分子、小分子等。將核酸適配體固定于芯片上，稀釋靶標到不同濃度，加入不同濃度梯度的靶標在合適的條件下孵育后清洗，通過表面等離子共振法設備測定核酸適配體結合的靶標的數(shù)量，繪制其與靶標濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。等溫滴定微量熱法：適用于大分子、小分子等，將核酸適配體和靶標進行透析處理，選擇適宜的樣品濃度，脫氣處理后，進行核酸適配體-靶標滴定試驗，同時進行對照實驗（滴水試驗，樣品滴定緩沖溶液試驗），所得數(shù)據(jù)經(jīng)過軟件分析即可得到Kd值。酶聯(lián)適配體分析法：適用于細胞等，將核酸適配體固定于基板上，洗脫后加入不同濃度梯度的靶標，孵育后沖洗，再加入帶有熒光標記的核酸適配體孵育后洗脫，通過熒光分析儀獲得熒光強度，繪制熒光強度與靶標濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。DNA捕獲元件法：適用于細胞、大分子、小分子等。將標記熒光集團和淬滅集團的核酸適配體與不同的濃度靶標混合，孵育后，檢測熒光強度。繪制熒光強度與靶標濃度的關系圖。擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。生物膜干涉法：適用于：細胞、大分子、小分子等。將核酸適配體固定于芯片上與不同的濃度靶標混合，孵育后清洗，利用生物膜干涉設備測定與核酸適配體結合的靶標數(shù)量，繪制其與靶標濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Target])，獲得Kd值。超濾法：適用于細胞、大分子等。對核酸適配體進行熒光標記，釋到不同濃度；與相同濃度的靶標共混并在合適的條件下孵育，使用超濾膜過濾，使用熒光光譜儀測定核酸-靶標復合物的熒光強度，繪制熒光強度與核酸適配體濃度的關系圖，擬合η=Bmax/(1+Kd/[Aptamer])，獲得Kd值。核酸適配體與靶標結合特異性驗證基于4.1的結果選擇親和力最高（即Kd值最低）的核酸適配體進行特異性驗證。選擇靶標和幾種靶標的結構類似物進行測試，使用4.1中介紹的方法分別測量核酸適配體與靶標以及幾種結構類似物的親和力（即Kd值）并進行比較，獲得特異性結果。防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。前??言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)劃起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：河北食品檢驗研究院等本標準主要起