山慈菇(杜鵑蘭)快速繁殖技術(shù)優(yōu)化及鐵皮石斛葉cDNA-PCR文庫的構(gòu)建

山慈菇（杜鵑蘭）快速繁殖技術(shù)優(yōu)化及鐵皮石斛葉cDNAPCR文庫的構(gòu)建山慈菇是常用的名貴中藥材,具有清熱解毒、化痰散結(jié)等功效,臨床上常用作抗腫瘤藥物?！吨腥A人民共和國藥典》(國家藥典委員會(huì),1995,2000,2005)記載：山慈菇為蘭科(Orchidaceae)植物杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don)Makino)、獨(dú)蒜蘭(Pleionebulbocodioides(Franch.)Rolfe)或云南獨(dú)蒜蘭(PleioneyunnanensisRolfe)的干燥假鱗莖,主要分布于四川、云南、貴州等長江以南各省區(qū)。由于具有較大的藥用價(jià)值,因此對(duì)于山慈菇的需求量較大,同時(shí)自身繁殖率低,使得野生山慈菇(杜鵑蘭)的生存狀態(tài)惡化,數(shù)量急劇減少。因此,通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)其體外的快速繁殖具有重大的藥用、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境意義。課題以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的杜鵑蘭為外植體,通過最佳基本培養(yǎng)基、最佳植物激素及濃度、最佳有機(jī)添加物及濃度的確定,再進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn),從而獲得杜鵑蘭體外快速繁殖的最佳培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基,最佳激素濃度為1.Omg/LNAA,最佳有機(jī)添加物濃度為100g/L土豆汁(PE)。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示,1/2MS+50g/LBE+50g/LPE+0.75mg/L6-BA+0.75mg/LNAA,30.0g/L蔗糖,3.0g/L活性炭,5.5g/L瓊脂,pH值5.8～6.2,為杜鵑蘭體外快速繁殖的最佳培養(yǎng)條件。另選取各個(gè)生長時(shí)期具有特征的材料,采用石蠟切片技術(shù)對(duì)杜鵑蘭形態(tài)發(fā)生過程進(jìn)行觀察,結(jié)合杜鵑蘭外部形態(tài)發(fā)育過程,對(duì)其發(fā)育進(jìn)行初步研究。另以RACE技術(shù)為基礎(chǔ),鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)葉總RNA為起始材料,通過逆轉(zhuǎn)錄和末端轉(zhuǎn)移構(gòu)建出兩端含有特定序列的cDNA,然后以連接有引入序列的引物進(jìn)行PCR,在實(shí)驗(yàn)條件下擴(kuò)增生物體中微量mRNA的cDNA,構(gòu)建cDNAPCR文庫。該方法構(gòu)建的cDNAPCR文庫能使cDNA放大100倍以上。通過比較,cDNAPCR文庫的PCR效果明顯高于逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR效果。以5pg的總RNA為起始材料構(gòu)建的cDNAPCR文庫仍可得到一定