熒光免疫試驗

關(guān)于熒光免疫試驗掌握：熒光的基本知識；熒光抗體染色與結(jié)果判斷。熟悉：熒光物質(zhì)。了解：熒光抗體的制備；熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)；熒光免疫分析；熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用。教學(xué)目的第2頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)熒光免疫試驗的組成因素第二節(jié)間接免疫熒光試驗第三節(jié)流式熒光免疫試驗第四節(jié)其他與熒光檢測相關(guān)的免疫試驗第五節(jié)熒光免疫試驗的臨床應(yīng)用第六節(jié)影響熒光免疫試驗的主要因素第3頁,共53頁，2024年2月25日，星期天熒光免疫試驗（fluoroimmunoassay):

以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體和抗原，通過與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，以此對待測物進(jìn)行定位、定性和定量分析的檢測技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性，是最早出現(xiàn)的免疫標(biāo)記技術(shù)。第4頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。第一節(jié)熒光免疫試驗的組成要素吸收能量激發(fā)態(tài)

基態(tài)熒光效率第5頁,共53頁，2024年2月25日，星期天熒光特點(diǎn)：

1可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；2一旦停止供能，熒光隨之瞬間消失；第6頁,共53頁，2024年2月25日，星期天(一)熒光的基本知識1.發(fā)射光譜:指固定激發(fā)光波長，在不同波長下記錄到的標(biāo)本發(fā)射熒光的譜圖。2.激發(fā)光譜:指固定檢測發(fā)射光波長，用不同波長的激發(fā)光照射標(biāo)品得到的熒光的譜圖。

一熒光及熒光物質(zhì)基礎(chǔ)知識第7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天熒光效率

＝吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）熒光色素本身的物理特性激發(fā)光強(qiáng)度及激發(fā)光波長決定于決定于3.熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率------熒光效率第8頁,共53頁，2024年2月25日，星期天定義:熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。

4.熒光壽命第9頁,共53頁，2024年2月25日，星期天5.熒光淬滅:熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。第10頁,共53頁，2024年2月25日，星期天如何避免：勿長時間照射脈沖瞬間照射避光保存猝滅劑：具有熒光猝滅作用的物質(zhì)熒光淬滅

第11頁,共53頁，2024年2月25日，星期天熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定（二）熒光物質(zhì)第12頁,共53頁，2024年2月25日，星期天熒光顯微鏡

利用一定波長的激發(fā)光對待測標(biāo)本進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位和半定量分析檢測。

二、熒光顯微鏡第13頁,共53頁，2024年2月25日，星期天隔熱濾光片：位于燈室聚光器前，作用阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，作用能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，作用阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護(hù)眼睛。熒光顯微鏡濾光片第14頁,共53頁，2024年2月25日，星期天透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路第15頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第16頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1、抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

三、熒光素-抗體結(jié)合物第18頁,共53頁，2024年2月25日，星期天有能與蛋白質(zhì)形成共價健的化學(xué)基團(tuán)熒光效率高，熒光色澤與背景組織的色澤對比度高。與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有性質(zhì)。標(biāo)記方法簡單、安全無毒。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。2熒光素要求第19頁,共53頁，2024年2月25日，星期天一、基本原理特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示意圖

第二節(jié)間接免疫熒光試驗第20頁,共53頁，2024年2月25日，星期天間接免疫熒光法示意圖第21頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共53頁，2024年2月25日，星期天間接法：

優(yōu)點(diǎn)：敏感度高于直接法制備一種熒光抗體可檢測多種抗原既可用于檢測抗原，也可檢測抗體缺點(diǎn)：易出現(xiàn)非特異性熒光方法較麻煩操作時間較長應(yīng)用：自身抗體的檢測第23頁,共53頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)本片上滴加特異性抗體37℃30minPBS洗滌滴加二抗

37℃30minPBS洗滌鏡檢二、實驗方法第24頁,共53頁，2024年2月25日，星期天三、注意事項1.熒光染色時間：一小時內(nèi)或2~8℃保存4小時，2.三種對照：①陽對：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰對：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.標(biāo)本片需保持濕潤，避免干燥4.滴加抗體或熒光標(biāo)記物,始終保持在未知抗原標(biāo)本上第25頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

-：無或僅見極微弱熒光。

+：熒光較弱但清楚可見。

++：熒光明亮。

+++：耀眼強(qiáng)熒光。特異熒光強(qiáng)度+以上判定為陽性，對照光應(yīng)呈-或±。根據(jù)+的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

熒光抗體染色及結(jié)果判斷第26頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗(flowcytometryandfluorescenceimmunoassay):采用人工微球和流式檢測方式對可溶性物質(zhì)進(jìn)行高通量分析的檢測方法。懸浮陣列；流式微球陣列第27頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

第四節(jié)

其他與熒光檢測相關(guān)的免疫試驗第28頁,共53頁，2024年2月25日，星期天其他熒光免疫試驗時間分辨熒光免疫測定熒光酶免疫測定熒光偏振免疫測定第29頁,共53頁，2024年2月25日，星期天自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光（一）基本原理時間分辨檢測原理示意圖1.時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定第30頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差。

stokes位移小，相互干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊時間分辨熒光免疫測定第31頁,共53頁，2024年2月25日，星期天發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少激發(fā)光譜帶較寬：300nm～350nm，靈敏度高3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時間分辨熒光免疫測定第32頁,共53頁，2024年2月25日，星期天4.熒光標(biāo)記物的相對比活性比活性：單位時間內(nèi)每個標(biāo)記分子可被探測到的信號量。Eu3+螯合物反復(fù)激發(fā)1000次/秒大大提高了熒光標(biāo)記物比活性時間分辨熒光免疫測定第33頁,共53頁，2024年2月25日，星期天結(jié)合β-二酮體Eu3+解離酸性增強(qiáng)液熒光增強(qiáng)Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物5.信號增強(qiáng)時間分辨熒光免疫測定第34頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法時間分辨熒光免疫測定第35頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（三）方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定第36頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（三）方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖第37頁,共53頁，2024年2月25日，星期天靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數(shù)量級標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高方法評價時間分辨熒光免疫測定第38頁,共53頁，2024年2月25日，星期天光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍(lán)光,485nm)熒光物質(zhì)二、熒光偏振免疫測定第39頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

抗原抗體競爭反應(yīng)AgF分子小，轉(zhuǎn)動速度快，偏振熒光弱

AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動速度慢，偏振熒光強(qiáng)若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖基本原理第40頁,共53頁，2024年2月25日，星期天方法評價

樣品用量少熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復(fù)性好快速，易自動化適于小、中等分子物質(zhì)檢測靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定第41頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

第五節(jié)熒光免疫試驗的臨床應(yīng)用

第42頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1.血清中自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)一、間接免疫熒光試驗第43頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.各種微生物的快速檢查和鑒定寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）細(xì)菌（藤黃微球菌)一、間接免疫熒光試驗第44頁,共53頁，2024年2月25日，星期天腫瘤（人肝癌細(xì)胞）間接免疫熒光試驗3、寄生蟲感染的診斷4、白細(xì)胞分化抗原的檢測5、人類白細(xì)胞抗原的檢測6、腫瘤組織中腫瘤標(biāo)志物的檢測7、激素和酶的組織定位第45頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（一）時間分辨熒光免疫試驗二、其他熒光免疫試驗1.內(nèi)分泌學(xué)中的應(yīng)用2.腫瘤學(xué)中的應(yīng)用3.免疫學(xué)中的應(yīng)用4.分子生物學(xué)的應(yīng)用5.微生物學(xué)中的應(yīng)用（二）熒光偏振免疫試驗第46頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)、影響熒光免疫試驗的主要因素一、熒光素-抗體結(jié)合物二、待檢標(biāo)本三、其他第47頁,共53頁