細(xì)菌的基因重組

關(guān)于細(xì)菌的基因重組

凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組（geneticrecombination），簡(jiǎn)稱重組。第2頁,共70頁，2024年2月25日，星期天作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。第3頁,共70頁，2024年2月25日，星期天重組與雜交的關(guān)系：重組是分子水平上的一個(gè)概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說的雜交（hybridization）則是細(xì)胞水平上的一個(gè)概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。真核微生物中的有性雜交、準(zhǔn)性雜交（parasexualhybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。第4頁,共70頁，2024年2月25日，星期天微生物中各種形式基因重組的比較重組范圍供體和受體的關(guān)系 整套染色體局部雜合高頻率低頻率部分染色體個(gè)別或少數(shù)基因細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié)性細(xì)胞真菌的有性生殖體細(xì)胞真菌的準(zhǔn)性生殖細(xì)胞間暫時(shí)溝通細(xì)菌的接合性導(dǎo)細(xì)胞間不接觸吸收游離DNA片段轉(zhuǎn)化噬菌體攜帶DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體提供遺傳物質(zhì)完整噬菌體溶源轉(zhuǎn)變噬菌體DNA轉(zhuǎn)染第5頁,共70頁，2024年2月25日，星期天基因重組的意義基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。雜交育種的優(yōu)點(diǎn)：①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺性方面，均比誘變育種前進(jìn)了一大步。②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。第6頁,共70頁，2024年2月25日，星期天基因重組的意義雜交育種的缺點(diǎn)：由于雜交育種的方法較復(fù)雜，工作進(jìn)展較慢，還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見。到了70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。第7頁,共70頁，2024年2月25日，星期天原核生物的基因重組原核生物的基因重組形式很多，機(jī)制較原始。特點(diǎn)：①片段性，僅一小段DNA序列參與重組；②單向性，即從供體菌向受體菌（或從供體基因組向受體基因組）作單方向轉(zhuǎn)移；③轉(zhuǎn)移機(jī)制獨(dú)特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第8頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（一）接合（conjugation，mating）

供體菌（“雄性”）通過性毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，就是接合子（conjugant）。第9頁,共70頁，2024年2月25日，星期天1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程第10頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共70頁，2024年2月25日，星期天中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！第12頁,共70頁，2024年2月25日，星期天AB[-][-]過濾器U型管實(shí)驗(yàn)第13頁,共70頁，2024年2月25日，星期天存在范圍：細(xì)菌：G–

較為多見如E.coli(大腸桿菌)、Salmonella(沙門氏菌)、Shigella(志賀氏菌)、Serratia(粘質(zhì)沙雷菌)、Vibrio(弧菌屬)、Azotobacter(固氮菌)、Klebsiella(克雷白氏桿菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)等最為常見放線菌：Streptomyces(鏈霉菌屬)、Nocardia(諾卡氏菌屬)接合還可發(fā)生在不同屬的菌種之間，如E.coli與Salmonellatyphimurium之間或S.typhimurium與Shigelladysenteriae之間第14頁,共70頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的接合機(jī)制接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性毛（sexpili）及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面有性毛不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性毛第15頁,共70頁，2024年2月25日，星期天F因子為附加體質(zhì)粒可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，可插入（整合）到染色體上第16頁,共70頁，2024年2月25日，星期天F因子的四種細(xì)胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性毛。第17頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共70頁，2024年2月25日，星期天接合的一般過程接合時(shí)F+細(xì)胞與F–細(xì)胞相遇，性菌毛與F–細(xì)胞表面發(fā)生吸附而形成接合管；F+細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)因子的一條DNA單鏈在特定的位點(diǎn)上發(fā)生斷裂；斷裂后的單鏈逐步解開，同時(shí)以另一條留存的環(huán)狀單鏈做模板，通過模板的滾動(dòng)，一方面把解開的單鏈以5’為先導(dǎo)通過性菌毛推入F–細(xì)胞中，另一方面，在供體細(xì)胞內(nèi)以滾動(dòng)的環(huán)狀模板重新合成一條互補(bǔ)的環(huán)狀單鏈，以取代傳遞到F–細(xì)胞中的那條單鏈。這種DNA復(fù)制機(jī)制稱為滾環(huán)模型（rollingcirclemodel）；在F–細(xì)胞中，以外來的供體DNA線狀單鏈為模板合成一條互補(bǔ)單鏈，并隨之恢復(fù)成環(huán)狀雙鏈F因子。至此，原來的F–菌株變成了F+菌株。原來的供體仍為F+菌株。第20頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）

通過病毒（defectivephage）的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，就稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。第21頁,共70頁，2024年2月25日，星期天由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式：一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。第22頁,共70頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)第23頁,共70頁，2024年2月25日，星期天1.普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。一般用溫和噬菌體作為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介。第24頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)或完全轉(zhuǎn)導(dǎo)（completetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，使其成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的重組體，稱作普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種現(xiàn)象就稱普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。第25頁,共70頁，2024年2月25日，星期天Salmonellatyphimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的野生菌株Salmonellatyphimurium（鼠傷寒沙門氏菌）的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株P(guān)22嗜菌體供體菌受體菌第26頁,共70頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)導(dǎo)模型供體菌受體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介—噬菌體誤包轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)子雙交換同源配對(duì)10-6～10-8第27頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共70頁，2024年2月25日，星期天過程：（1）P22在供體菌內(nèi)增殖時(shí)，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數(shù)（10–6~10–8）噬菌體的衣殼將與噬菌體頭部核心大小相似的一段供體DNA片段誤包入其中，形成了一個(gè)完全不含噬菌體自身DNA的缺陷噬菌體。（2）供體菌裂解時(shí)，如把少量裂解物與大量受體菌群體相混，這種完全缺陷噬菌體就會(huì)將這一外源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。（3）在這種情況下，由于一個(gè)受體細(xì)胞只感染了一個(gè)完全缺陷噬菌體，故受體細(xì)胞不會(huì)發(fā)生往常的溶原化，也不顯示其免疫性，更不會(huì)裂解和產(chǎn)生正常的噬菌體；而由于導(dǎo)入的外源DNA片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，在通過雙交換而整合到受體菌染色體組中，所以使后者成為一個(gè)遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。第29頁,共70頁，2024年2月25日，星期天S.typhimurium的P22噬菌體、E.coli的P1噬菌體、Bacillussubtilis的PBS1和SP10等噬菌體都能進(jìn)行完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。供體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介——噬菌體受體菌第30頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)簡(jiǎn)稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）。經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的媒介而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，外源DNA在其內(nèi)既不進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，也不迅速消失，而僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象就稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第31頁,共70頁，2024年2月25日，星期天受體菌外源DNA細(xì)胞分裂外源基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯而形成的少量酶獲得外源DNA獲得少量酶不斷稀釋第32頁,共70頁，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。第33頁,共70頁，2024年2月25日，星期天普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。第34頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction，restrictedtransduction）指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。最初于1954年在E.coliK12中發(fā)現(xiàn)。第35頁,共70頁，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：①只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因，一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因；②該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；③缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主染色體過程中，發(fā)生低頻率（～10-5）“誤切”（不正常切離，abnormalexcesion）或由于雙重溶源菌的裂解而形成；④

局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過UV等因素對(duì)溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后才產(chǎn)生。第36頁,共70頁，2024年2月25日，星期天局限轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子出現(xiàn)頻率的高低分類第37頁,共70頁，2024年2月25日，星期天溫和噬菌體感染整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中第38頁,共70頁，2024年2月25日，星期天缺陷噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，通過DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。E.coli的λ嗜菌體和φ80嗜菌體具有局限轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。第39頁,共70頁，2024年2月25日，星期天比較項(xiàng)目普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因供體染色體或染色體外的任何基因供體染色體上與原噬菌體緊密連鎖的少數(shù)幾個(gè)個(gè)別基因噬菌體寄生的位置不結(jié)合在寄主染色體特定位置上結(jié)合在寄主染色體特定位置上獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的方法通過敏感菌的裂解或容源菌的誘導(dǎo)紫外線誘導(dǎo)容源菌轉(zhuǎn)導(dǎo)子的區(qū)別一般穩(wěn)定，非溶原性（不表現(xiàn)出任何噬菌體的性狀，包括免疫性）一般不穩(wěn)定，呈缺陷溶原性（對(duì)同源噬菌體具有免疫性，但不表現(xiàn)出其它噬菌體的性狀）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較第40頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

受體菌（recipientcell，receptor）直接吸收供體菌（donorcell）的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱轉(zhuǎn)化子（transformant）。（三）轉(zhuǎn)化（transformation）

1.

定義第41頁,共70頁，2024年2月25日，星期天原核生物Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌）、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Xanthomonas（黃單胞菌屬）等。2.

轉(zhuǎn)化微生物的種類第42頁,共70頁，2024年2月25日，星期天真核微生物Saccharomycescerevisiae（釀酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脈孢菌）、Aspergillusniger（黑曲霉）等。第43頁,共70頁，2024年2月25日，星期天①受體細(xì)胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)②供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1×107

D

左右③菌株間的親緣關(guān)系密切3、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件第44頁,共70頁，2024年2月25日，星期天感受態(tài)（competence）

感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，能發(fā)生轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞都處于感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。第45頁,共70頁，2024年2月25日，星期天自然感受態(tài)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制；人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。（該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān)?。┑?6頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

感受態(tài)感受態(tài)受遺傳控制，但也存在個(gè)體差異。感受態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間不同；出現(xiàn)時(shí)間：只在細(xì)菌生長(zhǎng)的某一時(shí)期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長(zhǎng)時(shí)期Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌）的感受態(tài)出現(xiàn)在生長(zhǎng)曲線中的指數(shù)期的中期，Bacillus（芽胞桿菌屬）的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。第47頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞的比例：當(dāng)處于感受態(tài)高峰時(shí)，群體中呈感受態(tài)的細(xì)胞因菌種而不同.Bacillussubtilis不超過10~15%Streptococcuspneumonia和Haemophilusinfluenzae（流感嗜血桿菌）達(dá)到100%感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定，但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響：cAMP、Ca2+等最明顯。如用CaCl2

處理E.coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。轉(zhuǎn)化DNA的最低濃度：在群體中含有15%感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，0.1

gDNA/ml細(xì)胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化第48頁,共70頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子。膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白（membrane-associatedDNAbindingprotein）細(xì)胞壁自溶素（autolysin）幾個(gè)核酸酶第49頁,共70頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化因子（transformingprinciple）轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。一般只有15kb左右。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同。良好的轉(zhuǎn)化因子有dsDNA（最宜于細(xì)胞表面結(jié)合）、ssDNA和質(zhì)粒DNA，通常不能與核染色體組發(fā)生重組。第50頁,共70頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1.0％，最高為20％。能發(fā)生轉(zhuǎn)化的最低DNA濃度極低，為化學(xué)方法無法測(cè)出的1×10－5mg／mL（即1×10－11g／mL）。第51頁,共70頁，2024年2月25日，星期天自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）

4、轉(zhuǎn)化的類型根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：第52頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

5.

轉(zhuǎn)化過程（1）自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡(jiǎn)稱自然轉(zhuǎn)化）1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化過程研究得較深入的就是這種G＋細(xì)菌。第53頁,共70頁，2024年2月25日，星期天目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：①建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞②外源游離DNA分子第54頁,共70頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化的過程以S.Pneumoniastrr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附：雙鏈DNA片段與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)（主要在新形成細(xì)胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合，此時(shí)，細(xì)胞膜上的膽堿可促進(jìn)這一過程。在吸附過程的前階段，如外界加入DNA酶，就會(huì)減少轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。稍后，DNA酶即無影響，說明此時(shí)該轉(zhuǎn)化因子已進(jìn)入細(xì)胞；切割：在吸附位點(diǎn)上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5×106的DNA片段；入胞：DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞，這是一個(gè)耗能的過程。分子量小于5×105的DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。這時(shí)如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細(xì)胞壁的通透性，故可提高轉(zhuǎn)化頻率；第55頁,共70頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化的過程重組：來自供體菌的單鏈DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)配對(duì)，接著受體染色體組上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA交換、整合和取代，于是形成了一個(gè)雜合DNA區(qū)段（heterozygousregion）。在這一過程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的參與；復(fù)制：受體菌的染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個(gè)未獲供體基因；轉(zhuǎn)化子形成：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂后，一個(gè)子細(xì)胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個(gè)細(xì)胞與原始受體菌一樣。第56頁,共70頁，2024年2月25日，星期天枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）第57頁,共70頁，2024年2月25日，星期天strR，存在抗鏈霉素的基因標(biāo)記strS，有鏈霉素敏感型基因標(biāo)記第58頁,共70頁，2024年2月25日，星期天自然轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對(duì)核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）供體菌和受體菌之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多；b）不需要活的DNA給體細(xì)胞；第59頁,共70頁，2024年2月25日，星期天提高質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率的二種方法：1）使質(zhì)粒形成多聚體，這樣進(jìn)入細(xì)胞后重新組合成有活性的質(zhì)粒的幾率大大提高；2）在質(zhì)粒上插入受體菌染色體的部分片段，或?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)含有與該質(zhì)粒具有同源區(qū)段的質(zhì)粒的受體菌——重組獲救。第60頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（2）人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細(xì)菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；第61頁,共70頁，2024年2月25日，星期天可轉(zhuǎn)化的形狀莢膜多糖的合成專一性酶的合成專一性蛋白質(zhì)的合成抗藥性第62頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（四）原生質(zhì)體融合（