香菇菌種制作技術(shù)規(guī)程

DBXX/XXXXX—XXXX香菇菌種制作技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了香菇（Lentinulaedodes）菌種的術(shù)語和定義，生產(chǎn)要求，母種、原種與栽培種生產(chǎn)、檢驗、入庫及留樣的技術(shù)流程要點。本文件適用于江西省區(qū)域香菇母種、原種和栽培種菌種制作要求。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB9688食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準GB19170香菇菌種GH/T1013-2015香菇NY/T528-2010食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗NY/T1731食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范NY/T1742食用菌菌種通用技術(shù)要求NY/T1935食用菌栽培基質(zhì)質(zhì)量安全要求GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志（GB191-2008,ISO780:1997,MOD）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。為了便于使用，以下重復(fù)列出了GH/T1013-2015和GB19170-2003中的一些術(shù)語和定義。3.1香菇Lentinulaedodes香菇又名香孽、香信、香苑、冬菇、椎茸(日本)。屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌亞門（Agaricomycotina）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Aganicales）、類臍菇科（Omphalotaceae）、香菇屬（Lentinus）的一類木腐菌，子實體肉質(zhì)或近肉質(zhì)。[GH/T1013-2015，3.1]3.2菌種spawn通過生產(chǎn)試驗測試具有特異性、均一性和穩(wěn)定性，豐產(chǎn)性好、抗性強的香菇菌株或品種，生長在適宜基質(zhì)上培養(yǎng)物，包括母種、原種和栽培種。3.3母種stockculture經(jīng)分離、雜交、誘變等各種方法選育得到的具有結(jié)實性的香菇菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，以玻璃試管和培養(yǎng)皿為培養(yǎng)容器和使用單位，也稱為一級種、試管種。[GB19170-2003，3.1]3.4原種motherspawn由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶或（12～17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋為容器，也稱為二級種。3.5栽培種plantingspawn由原種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以菌種瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm聚丙烯塑料袋為容器。栽培種只能用于栽培，不可再次擴大繁殖菌種，也稱為三級種。3.6固體菌種solidspawn以富含木質(zhì)素、纖維素和淀粉等天然有機物為主要原料，添加適量的有機氮源和無機鹽類，具一定水分含量的培養(yǎng)基培養(yǎng)的純菌絲體。3.7液體菌種liquidspawn指采用與母種營養(yǎng)成份相同不加瓊脂的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到的純雙核菌絲體，菌絲體在培養(yǎng)基中呈絮狀或球狀，液體菌種可以作為原種或栽培種直接接種在培養(yǎng)袋中。4菌種生產(chǎn)要求4.1人員要求香菇菌種生產(chǎn)所需要的技術(shù)人員和檢驗人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)、掌握香菇基礎(chǔ)知識及香菇菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。4.2場所和廠房要求香菇菌種生產(chǎn)應(yīng)選擇地勢高、通風(fēng)良好、空氣清新、水源近、排水通暢和交通便利的場所。要求周邊300m之內(nèi)無釀造廠、食用菌栽培場等污染源。香菇菌種生產(chǎn)廠房要求有各自隔離的攤曬場、原材料庫和配料分裝庫。配套有配料室、攪拌室、裝袋（瓶）室、滅菌室、冷卻室、接種室、培養(yǎng)室（通風(fēng)好，有紗窗）、菌種檢測室及菌種冷藏庫等各環(huán)節(jié)的設(shè)施。冷卻室、接種室和培養(yǎng)室都應(yīng)要有離子凈化設(shè)施。4.3生產(chǎn)設(shè)備要求香菇菌種生產(chǎn)需要粉碎機、電子秤、攪拌機、裝袋（瓶）機、高壓鍋或常壓滅菌鍋、離子凈化器、超凈工作臺或接種箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、搖床、液體菌種灌（30L～250L）、冰箱、顯微鏡等設(shè)備。5母種生產(chǎn)5.1菌種生產(chǎn)流程培養(yǎng)基配制→分裝→滅菌→冷卻→無菌檢驗→接種→培養(yǎng)→檢驗→母種5.2容器試管選用18mm×180mm或者20mm×200mm；培養(yǎng)皿選用直徑7cm～9cm玻璃培養(yǎng)皿或一次性塑料培養(yǎng)皿。5.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。如果配方中的葡萄糖替換成蔗糖，稱為PSA培養(yǎng)基。CPDA培養(yǎng)基(綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，水1000mL。可根據(jù)實際情況自行選擇配方。5.4分裝5.4.1試管分裝分裝培養(yǎng)基至試管1/4處，用棉塞或硅膠塞子封閉試管口，每5支試管為1把，牛皮紙或報紙包棉塞，棉線扎緊，棉塞向上放置。棉塞應(yīng)采用梳棉，不能使用脫脂棉。5.4.2培養(yǎng)皿分裝培養(yǎng)基裝入300mL～500mL三角瓶至刻度的2/3處，用帶濾膜的封口膜封口后滅菌。培養(yǎng)皿用報紙包好滅菌。滅菌后稍微冷卻在超凈工作臺內(nèi)將三角瓶中的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基占培養(yǎng)皿高度的1/3～1/2。5.5滅菌放入滅菌鍋滅菌，在121℃～124℃（0.11MPa～0.12MPa）下滅菌25min。5.6冷卻5.6.1試管冷卻滅菌后溫度降到（65±5）℃時，在空氣清潔的室內(nèi)擺斜面，要求斜面長度不超過試管長度的2/3。5.6.2培養(yǎng)皿冷卻滅菌后溫度降到（65±5）℃時，在超凈工作臺內(nèi)將三角瓶中的培養(yǎng)基分裝至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基占培養(yǎng)皿高度的1/3～1/2。5.7無菌檢驗抽取3%～5%冷卻的試管或培養(yǎng)皿，在28℃下培養(yǎng)48h，無微生物長出為滅菌合格。5.8母種制備5.8.1超凈工作臺消毒先用體積分數(shù)75%酒精將超凈工作臺以及接種工具、接種袋(瓶)表面擦拭消毒，再將接種針、接種袋放置到超凈工作臺上進行紫外照射30min。5.8.2香菇菌種分離挑選生長兩天左右、長勢良好、形狀規(guī)則、未開傘、無蟲蛀的香菇子實體做為種菇，用體積分數(shù)75%的酒精對種菇表面擦洗消毒，并用無菌濾紙充分吸干后放置在潔凈的培養(yǎng)皿中。用雙手將菇體掰開，用滅過菌的接種刀，在菌蓋與菌柄交界處切取10mm×5mm“目”字形組織小塊為接種材料。用接種針挑選取一小塊組織片，迅速地接入試管斜面培養(yǎng)基的中央，然后將試管口和棉花塞在酒精燈火焰上過火滅菌后塞好，將接種后的試管放入25℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，2d～3d后組織塊及周圍便長出白色的菌絲，7d～8d菌絲可長滿試管斜面。5.8.3轉(zhuǎn)管培養(yǎng)選取斜面上菌絲茁壯、長勢優(yōu)良的試管，用接種針挑?。?～5）mm×(3～5)mm的菌塊，按無菌操作要求，轉(zhuǎn)接到新的試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基中，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d～20d，當(dāng)菌絲長滿培養(yǎng)基表面，即得母種，可用于生產(chǎn)原種。5.8.4菌種檢查接種48h后應(yīng)做首次檢查，挑揀出未萌發(fā)或受污染者。母種菌落長至直徑約2cm左右時，進行第二次檢查，待長滿管前再檢查一次，剔除或丟棄污染、生長不良的菌種。6原種與栽培種生產(chǎn)6.1生產(chǎn)技術(shù)流程培養(yǎng)基配制→裝袋（瓶）→滅菌→冷卻→接種→培養(yǎng)→檢查→原種（栽培種）。6.2固體菌種生產(chǎn)6.2.1培養(yǎng)基配方（1）雜木屑78%、麥麩20%、石膏粉1%、白糖或紅糖1%；（2）雜木屑78%、麥麩18%、玉米粉2%、石膏1%、白糖或紅糖1%；（3）雜木屑79%、麥麩20%、石膏1%。（2）雜木屑63%、棉籽殼15%、麥麩20%、石膏1%、白糖或紅糖1%；（3）雜木屑63%、玉米芯粉15%、麥麩20%、白糖或紅糖1%、石膏1%。各地可根據(jù)當(dāng)?shù)卦腺Y源適當(dāng)調(diào)整配方。所有原料應(yīng)符合NY/T1935規(guī)定。6.2.2容器原種采用850mL以下、瓶口直徑≤4cm、耐126℃高溫的透明玻璃瓶子，或采用（12～17）cm×（22～28）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。栽培種采用同原種要求的玻璃瓶子，或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.04～0.05）mm的聚丙烯塑料袋。以上聚丙烯塑料袋均要求符合GB9688《食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準》要求。6.2.3裝袋（瓶）采用裝袋（瓶）機或人工進行裝袋（瓶），人工裝袋（瓶）需用打孔器在袋口處打孔，孔直徑1cm～1.5cm，深度為8cm～12cm，每袋（瓶）裝培養(yǎng)基500g～600g。6.2.4滅菌培養(yǎng)基質(zhì)裝袋（瓶）后4h內(nèi)進行滅菌。高壓滅菌：組合培養(yǎng)基在121℃～124℃（0.11MPa～0.14MPa）下滅菌2h。常壓滅菌：在3h之內(nèi)使滅菌溫度達到100℃，保持100℃10h～12h。6.2.5冷卻滅菌完成后取出置于凈化冷卻區(qū)域冷卻至室溫。6.2.6接種6.2.6.1接種前準備同5.8.1。6.2.6.1接種操作6.2.6.1.1原種接種前一天備好母種，接種時再核對確保無誤。嚴格按照無菌操作要求，將接種工具在酒精燈灼燒滅菌，冷卻后挑取菌塊2cm～3cm到菌袋(瓶)中，每支母鐘接原種6～8袋(瓶)。6.2.6.1.2栽培種接種前一天備好原種，接種時再核對確保無誤。嚴格按照無菌操作要求，將接種工具在酒精燈灼燒滅菌，冷卻后挑取5g～6g塊狀原種到菌袋(瓶)中，每袋(瓶)原種接栽培種60～100袋(瓶)。6.2.7培養(yǎng)溫度控制在22℃～26℃，空氣濕度在60%~75%，通風(fēng)避光培養(yǎng)。6.2.8質(zhì)量檢查原種及栽培種在菌絲封口前，每日例行檢查。按照NY/T1284要求進行檢查。6.3液體菌種生產(chǎn)6.3.1培養(yǎng)基配方見5.3，不加瓊脂粉。6.3.2三角瓶液體菌種生產(chǎn)采用150mL～500mL三角瓶，液體培養(yǎng)基添加至刻度的2/3處，并放入3-5個玻璃珠（直徑為0.4cm～0.6cm）用帶濾膜的封口膜封口后滅菌。滅菌條件同6.2.4。取3mm～5mm大小母種10～15塊菌塊接種在液體培養(yǎng)基中，在23℃～25℃，振蕩頻率（攪拌速度）135r/min～145r/min下振蕩培養(yǎng)6d～8d。6.3.3發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)條件6.3.3.1裝罐和滅菌填裝液體培養(yǎng)基至液體發(fā)酵罐2/3處，按照液體發(fā)酵罐說明書要求，對液體發(fā)酵罐和液體培養(yǎng)基滅菌，待液體培養(yǎng)基冷卻至30℃以下時進行接種。6.3.3.2接種與培養(yǎng)將培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種接入到液體發(fā)酵罐中，接種量為培養(yǎng)基總體積的8%～10%，培養(yǎng)溫度（23±2）℃，攪拌轉(zhuǎn)速140r/min～180r/min，罐壓0.04MPa，通風(fēng)量0.7N·m3/h。培養(yǎng)5d～7d。6.3.3.3出菇袋接種液體菌種可作為原種或栽培種使用，液體菌種接種在出菇袋中要采用專用液體菌種接種槍進行，嚴格執(zhí)行無菌操作，每袋接種10mL～15mL。7檢驗、入庫及留樣7.1檢驗7.1.1抽樣質(zhì)檢部門的抽樣應(yīng)具有代表性。母種按品種、培養(yǎng)條件、接種時間分批編號；原種、栽培種按菌種來源、制種方法和接種時間分批編號。按批隨機抽取被檢樣品。母種、原種、栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%、5%、1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支（瓶/袋）；超過100支（瓶/袋）的,可進行兩級抽樣。7.1.2母種檢查要求（表1）表1香菇母種感官要求項目要求檢驗方法容器完整、無破損、無裂紋、潔凈肉眼觀察棉塞或無棉蓋體干燥、整潔、松緊適度、能滿足透氣和過濾要求肉眼觀察菌種外觀菌絲生長量長滿容器肉眼觀察菌絲體特征潔白、平整、無角變?nèi)庋塾^察菌絲體分泌物無肉眼觀察菌落邊緣整齊肉眼觀察雜菌菌落無肉眼觀察，必要時使用5×放大鏡觀察斜面背面外觀培養(yǎng)基不干縮，顏色均勻，無暗斑、無色素肉眼觀察7.1.3原種感官要求（表2）表2香菇原種感官要求項目要求檢驗方法容器完整、無破損、無裂紋肉眼觀察棉塞或無棉蓋體干燥、整潔、松緊適度、能滿足透氣和濾菌要求肉眼觀察培養(yǎng)基上表面距瓶（袋）口的距離（50±5）mm肉眼觀察菌種外觀菌絲生長量長滿容器肉眼觀察菌絲體特征濃密、生長旺健肉眼觀察培養(yǎng)物表面菌絲體生長均勻、無高溫抑制線肉眼觀察培養(yǎng)基及菌絲體緊貼瓶壁、無干縮肉眼觀察菌絲分泌物允許少量無色至棕黃色水珠肉眼觀察雜菌菌落無肉眼觀察，必要時使用5×放大鏡觀察子實體原基無肉眼觀察7.1.4栽培種感官要求（表3）表3香菇栽培種感官要求項目要求檢驗方法容器完整、無破損、無裂紋肉眼觀察棉塞或無棉蓋體干燥、整潔、松緊適度、能滿足透氣和濾菌要求肉眼觀察培養(yǎng)基上表面距瓶（袋）口的距離（50±5）mm肉眼觀察菌種外觀菌絲生長量潔白濃密、生長旺健肉眼觀察菌絲體特征生長均勻、無高溫抑制線、無原基和菇蕾肉眼觀察培養(yǎng)基及菌絲體緊貼瓶壁、無干縮肉眼觀察菌絲分泌物允許少量無色至棕黃色水珠肉眼觀察雜菌菌落無肉眼觀察，必要時使用5×放大鏡觀察子實體原基無肉眼觀察7.1.5液體菌種感官要求（表4）表4香菇液體菌種種感官要求項目要求檢驗方法容器完整、無破損、無裂紋肉眼觀察菌絲生長量培養(yǎng)基1/2～1/3肉眼觀察菌絲體特征白色至透明、生長旺健的絮狀或球狀菌體肉眼觀察培養(yǎng)基及菌絲體清澈、無雜色肉眼觀察雜菌無雜菌肉眼觀察，必要時使用5×放大鏡觀察7.2入庫母種檢驗完成后應(yīng)及時入庫，詳細記錄各生產(chǎn)環(huán)節(jié)（分別記錄各級菌種的接種、長滿、檢驗、入庫的時間），庫房溫度應(yīng)該1℃～6℃，避光，適當(dāng)通風(fēng)，但應(yīng)該對空氣進行殺菌處理。香菇母種在庫中貯存時間不應(yīng)長于50d，貯存時