培養(yǎng)基一般采用高壓蒸汽滅菌法

細(xì)菌培養(yǎng)的基本技術(shù)細(xì)菌培養(yǎng)的基本技術(shù)1實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)某種細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)需要而選擇多種原料配制而成的培養(yǎng)基，不僅含有這種細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還要有適宜的pH。本實(shí)驗(yàn)所用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，應(yīng)用較廣泛，適于芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)原理2

配制好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌。滅菌是指殺死一定環(huán)境中所有微生物的細(xì)胞、芽孢和孢子。對(duì)不同的材料，應(yīng)當(dāng)采取不同的滅菌方法。培養(yǎng)基一般采用高壓蒸汽滅菌法，就是將待滅菌的培養(yǎng)基放入密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，通過加熱使鍋內(nèi)的水沸騰并產(chǎn)生水蒸汽。當(dāng)水蒸汽將鍋內(nèi)的冷空氣排盡以后，關(guān)閉排氣閥并繼續(xù)加熱，這時(shí)鍋內(nèi)的壓力就會(huì)升高，最終使菌體蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到滅菌的目的。接種環(huán)是用火焰燒灼滅菌的。配制好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌。滅菌是指殺死一3

將某種細(xì)菌接種在徹底滅菌的培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，就能夠得到生長(zhǎng)良好的細(xì)菌群體，它們?cè)谂囵B(yǎng)基上會(huì)呈現(xiàn)出一定的形態(tài)特征。將某種細(xì)菌接種在徹底滅菌的培養(yǎng)基上，經(jīng)過一4目的要求1．通過對(duì)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制，了解配制培養(yǎng)基的一般步驟和方法。2．了解滅菌的基本原理，以及實(shí)驗(yàn)室中常用的滅菌方法。3．初步學(xué)會(huì)細(xì)菌培養(yǎng)的基本技術(shù)。目的要求5材料用具芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂。天平、角匙、200mL燒杯、試管、漏斗、量筒、玻璃棒、滴管、膠管、彈簧夾、鐵架臺(tái)、酒精燈、石棉網(wǎng)、三角架、火柴、紗布、棉花、牛皮紙、線繩、標(biāo)簽、接種環(huán)、精密pH試紙(或pH計(jì))、金屬小筐、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫箱。NaCl、1mol/L的NaOH溶液、體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精溶液、蒸餾水。材料用具6方法步驟一、培養(yǎng)基的配制1．稱量用天平稱取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2g瓊脂。將稱好的牛肉膏、蛋白胨和NaCl放入燒杯。2．溶化向上述燒杯中加入蒸餾水100mL，用玻璃棒攪勻后，放到酒精燈上加熱。當(dāng)牛肉膏和蛋白胨溶化后，加入瓊脂，并繼續(xù)用微火加熱。在瓊脂溶化的過程中，要控制火力的大小，并且不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦。待瓊脂完全溶化后，補(bǔ)加蒸餾水至100mL。方法步驟73．調(diào)pH用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)pH，直到pH為7.4～7.6為止。4．培養(yǎng)基的分裝按右圖所示，將培養(yǎng)基趁熱分裝到潔凈的試管中，培養(yǎng)基的高度約為試管高度的1/5。注意：分裝時(shí)不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。3．調(diào)pH用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，邊滴85．加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個(gè)棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長(zhǎng)度的2/3在試管口內(nèi)，如下圖所示。5．加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢以后，在管口上加一個(gè)棉塞。棉塞能9例：在葉綠體色素提取和分離與利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)金黃色葡萄球菌二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，①裝色素濾液的試管和②接種培養(yǎng)基的試管均要用到棉塞。下列有關(guān)①和②所用棉塞的特點(diǎn)及其作用的說法，正確的是（）A、二者用的都是脫脂棉，可以防止水分吸附B、二者的都不是脫脂棉，有利于水分的吸附C、②所用的棉塞應(yīng)該比①更緊，以防雜菌污染D、①所用的棉塞應(yīng)該比②更緊，以防濾液蒸發(fā)D例：在葉綠體色素提取和分離與利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)金黃色葡萄球106．包扎每10支試管用線繩捆成一捆，并且在管口外面包上一層牛皮紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名

6．包扎每10支試管用線繩捆成一捆，并且在管口外面包上一11二、滅菌1．打開高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水(最好用開水)，水面與底架平齊為宜。高壓蒸汽滅菌鍋的構(gòu)造如右下圖所示。二、滅菌122．將扎好的試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得太擠，否則會(huì)影響滅菌效果。3．加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣槽內(nèi)。以兩兩對(duì)稱的方式，同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)緊固螺栓，以防漏氣。2．將扎好的試管管口向上豎放在滅菌3．加蓋，并將排氣軟管插入134．排出鍋內(nèi)的冷空氣。接通電源，當(dāng)壓力上升到49kPa時(shí)，打開排氣閥放氣，當(dāng)壓力降到0時(shí)，關(guān)閉排氣閥。重復(fù)上述放氣過程一次，以徹底排出鍋內(nèi)的冷空氣。5．當(dāng)鍋內(nèi)的壓力上升到98kPa時(shí)，控制火力大小，使壓力維持在98kPa左右

20min，切斷電源。6．當(dāng)壓力降至0以后，打開排氣閥，10min以后，旋松緊固螺栓，取出試管。最后，將滅菌鍋里的水排放干凈。4．排出鍋內(nèi)的冷空氣。接通電源，當(dāng)壓力5．當(dāng)鍋內(nèi)的壓力上升14三、擱置斜面當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，將試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上。擱置的長(zhǎng)度要合適，使培養(yǎng)基形成的斜面的長(zhǎng)度不超過試管總長(zhǎng)的一半。三、擱置斜面15四、接種1．用肥皂將雙手洗凈，擦干，再用

酒精(體積分?jǐn)?shù)為75%)棉球擦拭雙手。2．當(dāng)手上的酒精揮發(fā)完畢后，點(diǎn)燃酒精燈。注意：一定要等手上的酒精揮發(fā)完畢后，再點(diǎn)燃酒精燈，否則，容易將手燒傷。四、接種2．當(dāng)手上的酒精揮發(fā)完畢后，點(diǎn)燃163．接種，操作程序見下圖。注意：整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程都要非常小心，不要碰翻酒精燈，以免燒傷。（1）用左手大姆指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種和斜面試管，右手?jǐn)Q松棉塞、不取下。（2）右手拿接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌，特別是箍處。3．接種，操作程序見下圖。注意：整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程都要非常小心17（3）火焰邊取下兩個(gè)棉塞，不能放下；燒灼管口一周。（4）將接種環(huán)伸入試管內(nèi)，冷卻后，輕輕挑取少量菌體，立即將接種環(huán)抽出。（3）火焰邊取下兩個(gè)棉塞，不能放下；燒灼管口一周。（4）將接18（6）抽出接種環(huán)后，燒管口，塞棉塞，接種環(huán)滅菌。（5）火焰旁將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸到斜面培養(yǎng)基的底部，由里向外畫蛇形細(xì)線，線要畫得細(xì)些。（6）抽出接種環(huán)后，燒管口，塞棉塞，接種環(huán)滅菌。（5）火焰旁19例：B圖是否正確？如不正確糾正方法是不正確。接種管宜放在菌種管上面例：B圖是否正確？不正確。接種管宜放在菌種管上面204．熄滅酒精燈。實(shí)驗(yàn)后的帶菌培養(yǎng)基，如果用的是致病菌，必須經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后方能倒掉；如果是非致病菌，也要經(jīng)加熱后再倒掉。5．接種完畢，將所接菌種、接種日期、接種者姓名填寫在標(biāo)簽上。4．熄滅酒精燈。實(shí)驗(yàn)后的帶菌培5．接種完畢，將所接菌種、接21五、培養(yǎng)將接種后的試管放入恒溫箱內(nèi)，在25℃下培養(yǎng)5～7d，或在37℃下培養(yǎng)24h。結(jié)論斜面培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況如何？將觀察到的結(jié)果和得出的結(jié)論填寫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。五、培養(yǎng)結(jié)論22討論1．在高壓蒸汽滅菌開始以前，為什么要將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡？

在高壓蒸汽滅菌以前，如果高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的冷空氣沒有排盡，當(dāng)壓力上升到98kPa時(shí)，鍋內(nèi)的溫度就不會(huì)上升到應(yīng)有的高度，導(dǎo)致滅菌不徹底。討論在高壓蒸汽滅菌以前，如果高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)232．滅菌完畢以后，如果壓力未降到0就打開排氣閥，會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？為什么？如果壓力未降到零就打開排氣閥，試管內(nèi)的培養(yǎng)基就會(huì)沖出管口。這是因?yàn)楦邏赫羝麥缇亙?nèi)外壓力不平衡的緣故2．滅菌完畢以后，如果壓力未降到0就打開排氣閥，會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)243．接種操作為什么一定要在火焰 旁邊進(jìn)行？空氣中存在有大量的微生物，而接種燈的火焰旁能形成一個(gè)無菌區(qū)域，在這里操作，可以避免雜菌污染3．接種操作為什么一定要在火焰 旁邊進(jìn)行？25練習(xí)：1、培養(yǎng)細(xì)菌需要根據(jù)某種細(xì)菌的________________配制特定的________________.其中______________培養(yǎng)基應(yīng)用廣泛.2、為使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，需要在配制好的各營(yíng)養(yǎng)成分的液體加入___________,溶化冷卻即可.3、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值,用濃度為1mol/L的_________或____________溶液進(jìn)行調(diào)節(jié).營(yíng)養(yǎng)需要培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂HClNaOH練習(xí)：營(yíng)養(yǎng)需要培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂HClNaOH264、對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌就是要利用高溫殺死_______________________________.壓力要達(dá)到_________KPa,維持____________分鐘.5、擱置斜面時(shí)培養(yǎng)基不能溫度_____________否則培養(yǎng)基會(huì)變成___________應(yīng)趁熱將試管放置成斜面形,使管內(nèi)培養(yǎng)基形成的斜面長(zhǎng)度不超過試管總長(zhǎng)的______________.培養(yǎng)基中的一切微生物9820太低固體1/24、對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌就是要利用高溫殺死____培養(yǎng)基中的一切276、微生物接種時(shí)各項(xiàng)操作必須在_________條件下進(jìn)行.因此必須在___________中操作.接種環(huán)境在___________上用灼燒去滅菌,雙手用_______%的酒精消毒.7、接種時(shí)將滅菌的接種環(huán)挑取少許________,迅速插入培養(yǎng)基試管里,在斜面上由_________向________連連續(xù)劃幾道__________線,然后將試管口在火焰上灼燒,塞上_____________.無菌無菌箱酒精燈75菌體里外蛇形細(xì)棉塞6、微生物接種時(shí)各項(xiàng)操作必須在_________條件無菌無菌287、接種后的試管要放入________箱中在______0С下培養(yǎng)___________天,即可見斜面上出現(xiàn)_______________.8、接種后塞上棉塞的作用是_________________.且棉塞要塞進(jìn)試管的深度為棉塞總長(zhǎng)的_______恒溫371菌落防止雜菌污染、保證通氣良好2/3255----77、接種后的試管要放入________箱中在______0С29例1、根據(jù)下面“枯草桿菌的培養(yǎng)和觀察”的實(shí)驗(yàn)步驟，回答問題1、實(shí)驗(yàn)前一周，取少許新鮮的干稻草切成碎段，放入錐形瓶中，加水（水：草=10：1）并煮沸30分鐘后，即用棉塞塞住瓶口，放在不見光的溫暖處，或恒溫箱中。3---5天后，觀察到液體混濁，表面出現(xiàn)一層白色薄膜。2、用玻璃棒挑少量薄膜，涂在載玻片上，蓋上蓋玻片，在高倍鏡下可以觀察到許多不活動(dòng)的枯草桿菌群體。例1、根據(jù)下面“枯草桿菌的培養(yǎng)和觀察”的實(shí)驗(yàn)步驟，回答問題30

枯草桿菌的芽孢可耐高溫而不致被殺死，而在煮沸的情況下其它菌類會(huì)因高溫使蛋白質(zhì)變性而死亡。問：在煮沸的新鮮干稻草液中為什么會(huì)出現(xiàn)枯草桿菌？枯草桿菌的芽孢可耐高溫而不致被殺死，而在煮沸31例2、以下是關(guān)于食品的腐敗和食品的保存的實(shí)驗(yàn)步驟；1、取標(biāo)有A----F的六只錐形瓶，瓶?jī)?nèi)各放入30mL肉湯澄清液2、在A瓶中加入3角匙食鹽；B瓶中加入15mL食醋；用棉塞塞住瓶口，A、B瓶都放在恒溫箱中，溫度為30---370C3、C、D、E、F瓶中不加任何物質(zhì)，都放置于空氣中暴露1h，然后用棉塞住它們的瓶口。例2、以下是關(guān)于食品的腐敗和食品的保存的實(shí)驗(yàn)步驟；324、將C瓶放在30---370C恒溫箱中，D瓶放在室溫下，E瓶放在40C左右的冰箱冷藏室內(nèi)，F(xiàn)放在-100C的冷凍室內(nèi)。5、一周后觀察，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。請(qǐng)你根據(jù)生物學(xué)原理對(duì)六瓶中食品的變化情況作一預(yù)測(cè)，并簡(jiǎn)述理由。4、將C瓶放在30---370C恒溫箱中，D瓶33答：A、B、F、肉湯不會(huì)腐??；因A瓶高濃度鹽抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖；B瓶高濃度的有機(jī)酸也能抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖；F低溫抑制了微生物的生長(zhǎng)和繁殖；E肉湯在短時(shí)間內(nèi)基本不會(huì)變質(zhì)；但可能有少許低溫型微生物能生長(zhǎng)繁殖；C、D兩瓶肉湯都會(huì)腐??；因有適合微生物生長(zhǎng)繁殖的溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等條件。答：A、B、F、肉湯不會(huì)腐?。灰駻瓶高濃度鹽抑制微生物的生長(zhǎng)34例3：在錐形瓶中裝入一定量液體培養(yǎng)基，接入N0個(gè)乳酸菌之后密封，放在250C溫箱中連續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，其間每30分鐘測(cè)定一次