蛋白質(zhì)分子的特殊運(yùn)動(dòng)折疊

關(guān)于蛋白質(zhì)分子的特殊運(yùn)動(dòng)折疊分子生物學(xué)中心法則

蛋白質(zhì)折疊問題又被稱為第二遺傳密碼第2頁,共71頁，2024年2月25日，星期天給定一序列，它將怎樣折疊成其特定結(jié)構(gòu)？§9蛋白質(zhì)的折疊第3頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊研究的理論意義幾乎所有的生命活動(dòng)都是由蛋白質(zhì)完成的

而蛋白質(zhì)鏈只有折疊成天然結(jié)構(gòu)才有活性

生命從蛋白質(zhì)折疊開始！第4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊研究的應(yīng)用意義蛋白質(zhì)工程的醫(yī)藥保健產(chǎn)品市場(chǎng)每年數(shù)十億美元

已知二十多種疾病與蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊有關(guān)

（老年癡呆癥、瘋牛病等）蛋白質(zhì)折疊還是蛋白質(zhì)組研究的瓶頸之一第5頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Prion疾病第6頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Amyloidosis淀粉樣變性病AttributedtoFrerichs,1862Amyloid淀粉狀蛋白1854RudolphVirchow第7頁,共71頁，2024年2月25日，星期天有關(guān)蛋白質(zhì)折疊的幾項(xiàng)重要研究1930s吳憲指出蛋白質(zhì)變性是肽鏈的構(gòu)象變化而非共價(jià)鍵變化1960sC.Anfinsen

發(fā)現(xiàn)還原態(tài)RNaseA，在除去還原劑和變性劑后能夠自動(dòng)氧化恢復(fù)活性，提出蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)是其熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)1960s人工合成牛胰島素1940sL.Pauling在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解出之前，根據(jù)物理化學(xué)原理預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)螺旋和折迭結(jié)構(gòu)NobelPrize,1973第8頁,共71頁，2024年2月25日，星期天變性條件1.溫度2.

pH3.鹽4.變性劑有機(jī)溶劑脲鹽酸胍去垢劑尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26M第9頁,共71頁，2024年2月25日，星期天NativeProteinDenatured第10頁,共71頁，2024年2月25日，星期天變性原理破壞次級(jí)鍵不破壞共價(jià)鍵溫度：較高時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆pH：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì)鹽：活度，溶解度脲：競(jìng)爭(zhēng)氫鍵第11頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構(gòu)象，因而過去研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象上，而對(duì)變性態(tài)沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新第12頁,共71頁，2024年2月25日，星期天小分子蛋白質(zhì)去折疊轉(zhuǎn)變是可逆的。在周圍環(huán)境的誘導(dǎo)下，小分子蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，當(dāng)將環(huán)境刺激因素去掉后，去折疊的蛋白質(zhì)又可以在折疊。第13頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共71頁，2024年2月25日，星期天一、問題的提出蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)是由什么決定的？蛋白質(zhì)如何由一級(jí)結(jié)構(gòu)形成高級(jí)結(jié)構(gòu)？如何由一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)？上述提法實(shí)際上要解決相同的問題分子內(nèi)、分子間的相互作用折疊過程中是否存在中間態(tài)第16頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

絕大多數(shù)的小蛋白質(zhì)的去折疊與再折疊是可逆的“一級(jí)結(jié)構(gòu)不僅為空間結(jié)構(gòu)編碼，而且以某種方式規(guī)定指導(dǎo)著達(dá)到這種空間結(jié)構(gòu)所經(jīng)歷的途徑”——蛋白質(zhì)折疊的密碼／立體化學(xué)密碼／第二密碼。折疊密碼的復(fù)雜性：序列相近的蛋白取相同的空間結(jié)構(gòu)；序列相同的肽段可以取不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 第17頁,共71頁，2024年2月25日，星期天兩個(gè)主要的考慮方向１．熱力學(xué)條件２．動(dòng)力學(xué)條件化學(xué)反應(yīng)觀點(diǎn)； 相變觀點(diǎn)第18頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Milestone第19頁,共71頁，2024年2月25日，星期天

Anfinsen對(duì)Ribonuclease的研究提出了蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)的假說。Anfinsen'swork,1957-63:formationofnativedisulfidebondsinribonucleaseAandotherproteins.

Keydiscovery:theinformationneededforfoldingiscontainedintheaminoacidsequence.第20頁,共71頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)考慮Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說：

Anfinsen認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強(qiáng)度等），整個(gè)系統(tǒng)的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。第21頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)

變性蛋白的復(fù)性實(shí)驗(yàn)從二硫鍵入手,提出假設(shè),實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其正確性:材料:牛胰核糖核酸酶含4對(duì)二硫鍵26-84 40-9558-110 65-72-S-S-交聯(lián)方式:7x5x3x1=105種,天然只占其中一種第22頁,共71頁，2024年2月25日，星期天牛胰核糖核酸酶第23頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?：空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對(duì)）模型2：生物合成的結(jié)果模型3：先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固實(shí)驗(yàn)否定了前兩種假設(shè)，肯定了第三種第24頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一：1.脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除脲和巰基乙醇，3.pH~8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復(fù)性，酶活力重新獲得第25頁,共71頁，2024年2月25日，星期天巰基乙醇第26頁,共71頁，2024年2月25日，星期天脲變性過量巰基乙醇導(dǎo)致還原第27頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二1.

脲變性。RNAase+8M脲+巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2.透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲結(jié)果：酶活性恢復(fù)到~0.01第28頁,共71頁，2024年2月25日，星期天錯(cuò)配的二硫鍵只需要加一點(diǎn)點(diǎn)巰基乙醇就可復(fù)性第29頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)1.由實(shí)驗(yàn)一可知，模型２（生物合成的結(jié)果）不成立，因?yàn)殡x體條件下復(fù)性的蛋白具有全部酶活性（后來又有實(shí)驗(yàn)證明體外解折疊是完全的，全人工合成）2.由實(shí)驗(yàn)二可知，模型１（空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對(duì)））不成立，否則，復(fù)性的蛋白應(yīng)該具有幾乎全部酶活性3.模型３（先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固）能夠解釋both結(jié)果。結(jié)論：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)形成三級(jí)結(jié)構(gòu)所需要的所有信息包含在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。第30頁,共71頁，2024年2月25日，星期天Anfinsen實(shí)驗(yàn)Anfinsen實(shí)驗(yàn)的啟示：1.成功需要一點(diǎn)點(diǎn)運(yùn)氣（簡(jiǎn)單的單結(jié)構(gòu)域蛋白）2.抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質(zhì)3.

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐评聿皇堑玫秸_結(jié)論的必要條件正確的前提＋正確的推導(dǎo)＝正確的結(jié)論正確的前提＋錯(cuò)誤的推導(dǎo)＝正確或錯(cuò)誤的結(jié)論錯(cuò)誤的前提＋正確的推導(dǎo)＝錯(cuò)誤的結(jié)論（大概率）錯(cuò)誤的前提＋錯(cuò)誤的推導(dǎo)＝正確或錯(cuò)誤的結(jié)論Model1and2都有實(shí)驗(yàn)支持第31頁,共71頁，2024年2月25日，星期天同時(shí)代取得的其它一些結(jié)果折疊是以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行的。

ribonucleaseA去除5C-末端殘基后,蛋白質(zhì)就喪失了正確形成二硫鍵的能力。(H.Taniuchi,J.Biol.Chem.245,5459-5468;1970)含有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，相鄰結(jié)構(gòu)域的解折疊是近似相互獨(dú)立的。第32頁,共71頁，2024年2月25日，星期天LevinthalParadox對(duì)一個(gè)100個(gè)氨基酸殘基的小蛋白質(zhì)鏈假設(shè)：只有主鏈二面角和可以轉(zhuǎn)動(dòng)每個(gè)二面角只有3個(gè)可能值則：總構(gòu)象數(shù)為3200如果：每轉(zhuǎn)動(dòng)一次時(shí)間為10-15秒則：歷遍所有構(gòu)象約需1072年而：宇宙年齡為1.5

1010第33頁,共71頁，2024年2月25日，星期天三、折疊的動(dòng)力學(xué)考慮有無中間體？最低自由能構(gòu)象能否達(dá)到？折疊過程是怎樣的？第34頁,共71頁，2024年2月25日，星期天單一結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。兩態(tài)折疊第35頁,共71頁，2024年2月25日，星期天折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn)首先在折疊、去折疊的早期動(dòng)力學(xué)時(shí)(快速反應(yīng))中發(fā)現(xiàn)。(Cytochromec:A.IkaiandC.Tanford,Nature230,100-102;1971;ribonucleaseA:T.Y.Tsong,R.L.BaldwinandE.L.Elson,PNAS68,2712-2715;1971)第36頁,共71頁，2024年2月25日，星期天折疊中間態(tài)?無輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖（圓二色譜CD結(jié)果）第37頁,共71頁，2024年2月25日，星期天快速檢測(cè)蛋白質(zhì)折疊的方法第38頁,共71頁，2024年2月25日，星期天通過二硫鍵捕捉中間體

－－捕獲二硫鍵碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時(shí)間加入碘乙酸，得到二硫鍵數(shù)目不同，構(gòu)象不同的蛋白質(zhì)，然后利用柱層析分離第39頁,共71頁，2024年2月25日，星期天牛胰蛋白酶抑制劑的二硫鍵折疊途徑中間體限速第40頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊過程的時(shí)間尺度第41頁,共71頁，2024年2月25日，星期天多肽鏈能夠采取的構(gòu)象個(gè)數(shù)是個(gè)天文數(shù)字，平均每個(gè)Aa可以有10種構(gòu)象，100Aa的多肽鏈有10100種可能的構(gòu)象。從一個(gè)構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€(gè)構(gòu)象所需最短時(shí)間10－13s，則該蛋白嘗試所有的構(gòu)象的時(shí)間是1085s=1077y，而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外折疊的時(shí)間是10-1～10-3s.

結(jié)論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機(jī)嘗試所有可能的構(gòu)象直到遇到某個(gè)自由能最低的構(gòu)象，而是沿著某些確定的途徑進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象未必是最低自由能的構(gòu)象，而是動(dòng)力學(xué)途徑中所能得到的穩(wěn)定的構(gòu)象。LevinthalParadox第42頁,共71頁，2024年2月25日，星期天能量偏移限制了折疊過程中對(duì)不合理構(gòu)象的嘗試第43頁,共71頁，2024年2月25日，星期天對(duì)蛋白折疊過程的共識(shí)

－－兩種過程成核：小蛋白多步：大蛋白，以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝坏?4頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊的啟動(dòng)疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài)（moltenglobulestate）二級(jí)結(jié)構(gòu)生成框架結(jié)構(gòu)模型特殊作用的啟動(dòng)Disulfidebonds去折疊態(tài)中的殘留有序結(jié)構(gòu)第45頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共71頁，2024年2月25日，星期天1、局部肽段形成一些構(gòu)象單元（

螺旋、

折疊和轉(zhuǎn)角等）——Motifs——三級(jí)結(jié)構(gòu)；

2、肽鏈內(nèi)部的疏水作用引起一個(gè)塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。3、“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時(shí)，分子立體的結(jié)構(gòu)再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結(jié)構(gòu)第47頁,共71頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)折疊的現(xiàn)代研究從頭算(abinitio

)預(yù)測(cè)1D->3D目標(biāo)：疏水表面埋藏最大，loop熵減最小設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象病的研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊產(chǎn)生淀粉樣纖維，導(dǎo)致構(gòu)象病，eg:Alzheimer'sandParkinson'sdiseases(J.W.Kelly,NatureStruct.Biol.9,323-325;2002).第48頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共71頁，2024年2月25日，星期天折疊過程的動(dòng)力學(xué)模擬動(dòng)力學(xué)模擬能夠成功的再現(xiàn)折疊過程的細(xì)節(jié)，例如過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)(D.Baker,Nature405,39-42;2000)和折疊中間體

(C.Clementi,P.A.JenningsandJ.N.Onuchic,PNAS97,5871-5876;2000)第50頁,共71頁，2024年2月25日，星期天BakerD.等認(rèn)為，如果多肽鏈所采取的構(gòu)象中只有一個(gè)低自由能狀態(tài)，即天然構(gòu)象，則所有非天然構(gòu)象多肽鏈將遵循經(jīng)典熱力學(xué)假說，由高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，最終形成天然構(gòu)象。但有些蛋白，天然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低的構(gòu)象或唯一的低能構(gòu)象，多肽鏈采取非天然的構(gòu)象也很穩(wěn)定，而這兩種構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變需要克服很高勢(shì)壘而難以實(shí)現(xiàn)，那么蛋白質(zhì)在折疊過程中就會(huì)有兩種途徑的競(jìng)爭(zhēng)，一種是正確折疊形成天然構(gòu)象，一種是錯(cuò)誤折疊形成非天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)之所以能夠形成正確的構(gòu)象，是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)過程中起驅(qū)動(dòng)作用。第51頁,共71頁，2024年2月25日，星期天“輔助性組裝學(xué)說”相對(duì)于“自組裝”學(xué)說，認(rèn)為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助，分子伴侶與折疊酶一起，構(gòu)成了兩種重要的輔助折疊分子。第52頁,共71頁，2024年2月25日，星期天折疊酶折疊酶催化蛋白質(zhì)折疊過程中共價(jià)鍵的異構(gòu)化，主要有有PDI和PPI。PPI，脯胺酰順反異構(gòu)酶PDI，二硫鍵異構(gòu)酶第53頁,共71頁，2024年2月25日，星期天四、分子伴侶（chaperone）

許多蛋白質(zhì)的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學(xué)功能的聚合體，但在體內(nèi)絕大多數(shù)新生肽三維結(jié)構(gòu)的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在。分子伴侶是能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)鹊囊活惖鞍?。在?dòng)物、植物、細(xì)菌內(nèi)廣泛分布和存在，其功能是介導(dǎo)其它蛋白質(zhì)的折疊和裝配，而本身卻不是最終功能蛋白質(zhì)分子的組成部分。第54頁,共71頁，2024年2月25日，星期天定義一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時(shí)的組份.第55頁,共71頁，2024年2月25日，星期天分子伴侶的特征

從參與促進(jìn)一個(gè)反應(yīng)而本身不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點(diǎn)來看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下三方面來看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對(duì)靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進(jìn)多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都不相關(guān)的蛋白質(zhì)。2、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構(gòu)象，釋放底物，進(jìn)行再循環(huán)。3、它和肽鏈折疊的關(guān)系，是阻止錯(cuò)誤折疊，而不是促進(jìn)正確折疊。4.多能性（脅迫保護(hù)防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細(xì)胞骨架）5.進(jìn)化保守性第56頁,共71頁，2024年2月25日，星期天分子伴侶的分類伴侶素家族(Charperonin,Cpn)GroE(Hsp60)家族和Tric家族熱休克蛋白70家族(Hsp70)熱休克蛋白90家族(Hsp90)其它種類的分子伴侶應(yīng)激蛋白第57頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共71頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共71頁，2024年2月25日，星期天五、蛋白質(zhì)折疊/去折疊的實(shí)驗(yàn)研究方法Fast/Ultrafastmixing

Stopped-flow,quenchflow,continuousflow,..

T-jump

electrical-discharge-inducedT-jump

Laser-inducedT-j