轉(zhuǎn)基因植物的遺傳特性與表達(dá)調(diào)控

關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的遺傳特性與表達(dá)調(diào)控一、轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA的整合特性1、外源DNA的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)（1）整合位點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛?xì)胞后，通過細(xì)胞分裂時(shí)遺傳物質(zhì)的復(fù)制過程整合到核基因組中，目前普遍認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因在寄主染色體內(nèi)的整合位點(diǎn)是隨機(jī)的,外源DNA可以插入植物基因組的任何一條染色體，也可以插入一條染色體的任何位點(diǎn)或沒有固定的插入位點(diǎn)，但往往對轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域具有優(yōu)先插入特性。（2）整合拷貝數(shù)：許多研究表明，外源DNA的插入拷貝數(shù)有以下幾種：單拷貝單位點(diǎn)插入；串聯(lián)多拷貝單位點(diǎn)插入；多拷貝多位點(diǎn)插入，多數(shù)情況是以單拷貝在單位點(diǎn)整合，但在同一位點(diǎn)，也存在較多的多個(gè)拷貝串聯(lián)整合的情況。形式為頭對尾式串聯(lián)和頭對頭式串聯(lián)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因直接轉(zhuǎn)化整合拷貝數(shù)存在差異，前者拷貝數(shù)少，整合位點(diǎn)特異性強(qiáng)。第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2、外源DNA結(jié)構(gòu)對整合的影響

外源DNA結(jié)構(gòu)分為四種類型：單鏈線形DNA、單鏈環(huán)形DNA、雙鏈線性DNA及雙鏈環(huán)形DNA。四種結(jié)構(gòu)中單鏈線狀DNA研究較多，一般認(rèn)為單鏈DNA可以通過有效的不正常整合參與同源染色體序列的重組，研究認(rèn)為單鏈DNA在單鏈完全變成雙鏈之前已發(fā)生重組。此外Bilang等（1992）研究了導(dǎo)入煙草的DNA結(jié)構(gòu)（線形和環(huán)形）的重組效率，結(jié)果表明線性單鏈DNA同環(huán)形單鏈DNA相比，其抗性愈傷組織數(shù)目要高于后者，說明線性DNA的整合效率要高于環(huán)形DNA。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3、轉(zhuǎn)化后整合位點(diǎn)的DNA結(jié)構(gòu)變化

保持整合外源基因的完整性是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因功能表達(dá)的基本條件，外源基因整合后的完整性與其結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，現(xiàn)已明確，外源基因作為侵入者的整合，會引起不同程度的基因重排，涉及缺失、異位、倒位及重復(fù)等一系列現(xiàn)象。這主要與細(xì)胞本身的重復(fù)和修復(fù)功能有關(guān)。

Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）對15個(gè)獨(dú)立的T-DNA插入進(jìn)行了研究，提出了外源DNA整合模型，他們認(rèn)為：（1）T-DNA的插入不會引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的兩側(cè)各出現(xiàn)了一個(gè)158bp的正向重復(fù)序列，且多數(shù)插入會導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小的缺失，最多79個(gè)核苷酸；（2）在T-DNA和植物DNA連接處常有幾個(gè)至33個(gè)核苷酸的填充DNA，這些填充序列與靠近連接處的植物DNA序列相似；（3）在靶位點(diǎn)處不要求有特異的序列，但若T-DNA兩端與植物靶位點(diǎn)之間有一段短序列（5-10bp）同源，則可能對T-DNA整合進(jìn)植物基因組其作用。

此外，插入植物染色體的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源DNA為5-6Kb，煙草中最大可達(dá)9Kb，但頻率較低。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4、轉(zhuǎn)化方法對整合外源基因結(jié)構(gòu)的影響

盡管轉(zhuǎn)化方法較多，但外源DNA以兩種分子形式轉(zhuǎn)化，一種是外源DNA插入T-DNA質(zhì)粒載體中導(dǎo)入；另一種是裸露的DNA分子直接導(dǎo)入，由于轉(zhuǎn)化原理不同，因此與整合后的外源DNA結(jié)構(gòu)必然存在直接關(guān)系。（1）T-DNA轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)變化農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中T-DNA結(jié)構(gòu)完整，整合位點(diǎn)穩(wěn)定，多數(shù)情況下在25bp處與植物DNA連接，整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異少，但外源DNA也會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，表現(xiàn)為T-DNA的串聯(lián)和截短現(xiàn)象。

T-DNA串聯(lián)：通常有5-20個(gè)拷貝的T-DNA的首尾相聯(lián)，在大多數(shù)整合事件中，T-DNA可以在無選擇壓的情況下串聯(lián)起來。

T-DNA截短：也是T-DNA轉(zhuǎn)化時(shí)較多發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化，可能是由于T-DNA兩側(cè)各有一個(gè)25bp的邊界類似序列。截短是在轉(zhuǎn)移和整合過程中產(chǎn)生，由于T-DNA區(qū)內(nèi)‘框類似’序列的存在，被用作引導(dǎo)T-DNA轉(zhuǎn)移和整合的次級識別位點(diǎn)，從而代替正常情況下的25bp右邊界序列，所以正常的有邊界序列被截短。截短在共整合載體中比二元載體系統(tǒng)更易發(fā)生。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）裸露DNA直接轉(zhuǎn)化的外源DNA結(jié)構(gòu)變化

采用裸露DNA直接轉(zhuǎn)化時(shí)，整合的外源DNA往往出現(xiàn)復(fù)雜的雜交圖譜，在轉(zhuǎn)化當(dāng)代及子代中常出現(xiàn)DNA環(huán)化、甲基化、片段分離和丟失等現(xiàn)象。在DNA直接轉(zhuǎn)化中供體DNA容易在整合過程中發(fā)生各種結(jié)構(gòu)變化和修飾，而且植物靶DNA序列也可在供體DNA整合過程中發(fā)生重排。第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天5、位點(diǎn)特異重組（1）位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)

遺傳重組分為3類：同源重組，轉(zhuǎn)座和位點(diǎn)特異性重組，也稱定位重組。同源重組發(fā)生在兩個(gè)具有一定程度同源性的DNA分子之間或同一分子的兩個(gè)同源性區(qū)域，它們相互重組。轉(zhuǎn)座和位點(diǎn)特異重組的共同點(diǎn)是重組只發(fā)生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶來識別某一種DNA序列，而造成重排。二者的區(qū)別在于轉(zhuǎn)座重組中，識別位點(diǎn)之間的DNA片段被轉(zhuǎn)位插入到另外的位點(diǎn)，是DNA合成過程中伴隨而發(fā)生的DNA斷裂、轉(zhuǎn)移和插入。而定位重組并不涉及DNA的凈合成，在兩個(gè)識別位點(diǎn)之間的DNA片段并不轉(zhuǎn)移到基因組中的另一地方，這段DNA是在重組酶所識別的位點(diǎn)上進(jìn)行重組、交換而被切除或發(fā)生倒置，該定位系統(tǒng)越來越多地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，以改造基因重排，去除不需要的篩選基因、激活或缺失某一表達(dá)基因。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

目前發(fā)現(xiàn)的有4個(gè)定位重組系統(tǒng)，Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix。（2）位點(diǎn)特異性重組的作用機(jī)制

以Cre/lox為例加以說明，Cre來源于噬菌體P1，P1基因組中有1029bp的一段DNA，編碼343氨基酸的38.5kDa的蛋白質(zhì)，即一種重組酶。該酶在離體系統(tǒng)中以含loxP基因座的DNA序列為底物，高效地使線狀、環(huán)狀甚至超螺旋DNA發(fā)生重組反應(yīng)，而產(chǎn)生功能。當(dāng)兩個(gè)loxP基因座方向相同，Cre介導(dǎo)的反應(yīng)造成loxP基因座之間的DNA被刪除，loxP基因座方向相反，Cre介導(dǎo)使兩端攜帶loxP的片段發(fā)生倒位，如果loxP不在同一DNA分子，如一個(gè)在質(zhì)粒上，另一個(gè)在染色體上，那么Cre酶可使質(zhì)粒DNA整合到染色體loxP所在位置，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)重組。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天四類定位重組系統(tǒng)的分子重組程序分以下幾步：A重組酶識別并結(jié)合重組位點(diǎn)的反向重復(fù)序列，每一反向重復(fù)序列結(jié)合一個(gè)重組酶；B在重組酶作用下，兩個(gè)重組位點(diǎn)發(fā)生通向聯(lián)會；C聯(lián)會后兩個(gè)重組位點(diǎn)的DNA一條鏈在重組酶的作用下斷裂，并通過3′-PO4與重組酶的Tyr（酪氨酸）的游離-OH相連，保存了DNA斷裂時(shí)的能量；D重組酶的斷裂鏈與另一位點(diǎn)處斷裂的5′-OH端相連，此時(shí)兩DNA鏈的一條分別與對方交叉相連；E交叉相連的DNA鏈經(jīng)旋轉(zhuǎn)形成Holliday中間體；FHolliday中間體分枝遷移數(shù)個(gè)堿基后，另一條鏈再斷裂并與對方的斷裂鏈重組，這時(shí)就完成重組，實(shí)現(xiàn)了交換。第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（3）位點(diǎn)特異性重組在轉(zhuǎn)基因整合遺傳特性研究中的應(yīng)用

A控制轉(zhuǎn)基因整合的拷貝數(shù)；

B可導(dǎo)入多個(gè)基因進(jìn)入植物基因組；

C使目標(biāo)基因重排；

D激活目標(biāo)基因；

E定點(diǎn)轉(zhuǎn)化植物；

F基因克隆第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天二、轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng)1、位置效應(yīng)：在同一實(shí)驗(yàn)中獲得的不同轉(zhuǎn)化植株，外源基因的表達(dá)水平存在很大差異，這主要是由于外源基因在染色體上插入的位點(diǎn)不同而造成，這種現(xiàn)象稱為位置效應(yīng)。外源基因插入位點(diǎn)的位置效應(yīng)也可引起轉(zhuǎn)基因的失活，其原因可能是插入位點(diǎn)周圍的DNA序列組成起重要作用。位置效應(yīng)的明顯表現(xiàn)是外源基因的整合位置對表達(dá)頻率的影響。目前的轉(zhuǎn)化方法通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中隨機(jī)整合，因此位置效應(yīng)是轉(zhuǎn)基因表達(dá)不一致的主要原因之一。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2、重組效應(yīng)：

轉(zhuǎn)基因容易被植物基因組存在的重組和修復(fù)系統(tǒng)識別，致使轉(zhuǎn)基因不同程度的重排，轉(zhuǎn)基因同源和非同源重組必然引起DNA的易位，缺失、重復(fù)等一系列結(jié)構(gòu)變化。外源基因結(jié)構(gòu)變化甚至不同位點(diǎn)堿基序列的變化對其表達(dá)的影響不同，表現(xiàn)為DNA重組的多樣性：正效應(yīng)、負(fù)效應(yīng)及無影響等狀態(tài)。第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3、轉(zhuǎn)基因沉默

外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)基因沉默，轉(zhuǎn)基因沉默是遺傳工程走向應(yīng)用的潛在障礙，成為基因工程中的重要問題。（1）轉(zhuǎn)基因沉默的機(jī)理概述

20世紀(jì)80年代后期，基因沉默主要涉及到轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因之間或轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因之間的互作，認(rèn)為沉默的來源于多拷貝的同源DNA序列，這些序列指蛋白質(zhì)編碼區(qū)，啟動子或兩者皆有。已提出三種基因沉默模型：順式失活；即多拷貝，串聯(lián)基因的導(dǎo)入常常導(dǎo)致倒位或直接重復(fù)引起失活；反式失活；可以看作順式失活的副產(chǎn)品，指因順式作用失活的轉(zhuǎn)基因可以作為一種沉默子，使獨(dú)立DNA分子上的同源靶基因引起相似水平的甲基化和失活；共抑制或有義抑制，涉及到一個(gè)轉(zhuǎn)基因與一個(gè)同源的內(nèi)源基因或兩個(gè)同源的轉(zhuǎn)基因之間的協(xié)同沉默。三種模型均涉及核酸互作而引起的變化，如DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。轉(zhuǎn)基因沉默主要發(fā)生在兩個(gè)階段，一是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；二是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默

A轉(zhuǎn)基因及其啟動子甲基化；B多拷貝重復(fù)基因序列引起的轉(zhuǎn)錄水平基因沉默；

C同源基因間的反式失活；

D轉(zhuǎn)基因位置效應(yīng)引起的轉(zhuǎn)基因沉默；

E染色體包裝對轉(zhuǎn)基因沉默的影響；

F后成修飾作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默。第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（3）轉(zhuǎn)錄后水平的轉(zhuǎn)基因沉默A生化開關(guān)模型；B異常RNA模型；C反義RNA模型；DRNA介導(dǎo)的病毒抗性模型；（4）從頭甲基化與沉默機(jī)制

A植物對外源DNA的基因免疫誘導(dǎo)反應(yīng)；

BDNA-DNA配對誘導(dǎo)；

CDNA-DNA互作誘導(dǎo)。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4.克服轉(zhuǎn)基因沉默的策略

(1)轉(zhuǎn)基因的選擇：（2）啟動子的選擇；（3）利用組織和發(fā)育特異性作用的增強(qiáng)子（4）利用MAR序列；（5）利用位置特異性重組系統(tǒng)；（6）選擇單拷貝的轉(zhuǎn)化體。第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天三、轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的遺傳特性

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入受體細(xì)胞的外源基因（transgene）進(jìn)入受體細(xì)胞后，其整合、表達(dá)和傳遞規(guī)律通常利用表性傳遞、標(biāo)記基因及分子雜交分析等方法進(jìn)行研究。1.外源基因在轉(zhuǎn)化植物中的遺傳傳遞規(guī)律（1）孟德爾式分離:1984年David報(bào)道，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胡蘿卜、煙草和牽?；ㄞD(zhuǎn)基因植株表型分析和Southern雜交證明，后代中顯性位點(diǎn)的遺傳為真實(shí)的孟德爾式遺傳。

第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天單位點(diǎn)插入外源基因：大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株中，轉(zhuǎn)基因呈單基因顯性的孟德爾式分離。轉(zhuǎn)基因有可能作為一個(gè)單個(gè)顯性基因在轉(zhuǎn)基因植株中遺傳，相對于轉(zhuǎn)基因來說，植物同源染色體中沒有其相對的等位基因位點(diǎn)，因此轉(zhuǎn)基因一般呈顯性遺傳。單位點(diǎn)插入無論是單拷貝還是多拷貝串聯(lián)，在不超過一定長度時(shí)，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因能夠穩(wěn)定遺傳并顯示孟德爾單基因分離規(guī)律。

B.多位點(diǎn)插入外源基因：

Akama等（1992）在擬南芥中發(fā)現(xiàn)R1代植株中有10株抗性分離比為3R:1S，3株為15R：1S，1個(gè)株系為63R：1S。表明多數(shù)情況下外源基因?yàn)閱挝稽c(diǎn)插入，但也存在二、三個(gè)位點(diǎn)插入。進(jìn)一步對124個(gè)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分子雜交，分析T-DNA的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)為1、2、3個(gè)T-DNA者分別為44%、28%和10%，即90%插入拷貝數(shù)在4個(gè)一下，也有10個(gè)拷貝的個(gè)體。在44個(gè)轉(zhuǎn)KM抗性基因的煙草中，通過轉(zhuǎn)基因植株自交、轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化雜交、轉(zhuǎn)化株雜交進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)35個(gè)無性系包含一個(gè)單位點(diǎn)插入KM抗性基因，其余5個(gè)為兩位點(diǎn)插入，且觀察到雙位點(diǎn)插入導(dǎo)致自交后代中出現(xiàn)隱形致死突變。多基因轉(zhuǎn)化植株后代分離規(guī)律與其整合特性密切相關(guān)，多基因連鎖形式整合到一個(gè)位點(diǎn)，其符合單基因的孟德爾式分離規(guī)律；如分別整合到不同位點(diǎn)，那么每個(gè)基因的分離符合孟德爾式規(guī)律，各個(gè)基因間不影響。第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（2）非孟德爾遺傳現(xiàn)象：轉(zhuǎn)基因植株后代分離中，普遍存在顯性個(gè)體明顯不符合孟德爾比例的現(xiàn)象，成為非孟德爾遺傳現(xiàn)象。后代顯性個(gè)體比例明顯低于3：1，此外在自交二代中，由于轉(zhuǎn)基因的失活、純合致死等未知原因而未出現(xiàn)純合體。轉(zhuǎn)基因丟失：如小麥轉(zhuǎn)化株系中，自交一代能表達(dá)，自交二代僅能檢測到，自交三代中發(fā)生了丟失。B.轉(zhuǎn)基因沉默：轉(zhuǎn)化體仍保留完好的轉(zhuǎn)基因但不表達(dá)或表達(dá)活性低，或發(fā)生重排而不表達(dá)，導(dǎo)致后代分離規(guī)律的異常。C.轉(zhuǎn)基因逃逸：采用酶活性檢測得到的3：1的分離中，部分轉(zhuǎn)化體中僅有20%含目標(biāo)基因片段，因此需采用標(biāo)記選擇、表達(dá)分析及分子檢測相結(jié)合的方法檢測轉(zhuǎn)話體。D.花粉致死：當(dāng)以轉(zhuǎn)化體為父本與非轉(zhuǎn)化體回交時(shí)，只產(chǎn)生非轉(zhuǎn)化體，而非1：1的分離，其原因可能是花粉致死。E.誘導(dǎo)