新編免疫組化課件

第一局部免疫細(xì)胞化學(xué)的理論根底

免疫細(xì)胞化學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科，以免疫學(xué)的抗原抗體反響為其理論根底。第一節(jié)抗原〔antigen〕一、抗原的概念是一類在適宜的條件下，能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)和/或體外發(fā)生特異性結(jié)合反響的物質(zhì)?？乖男阅埽好庖咴援a(chǎn)生免疫應(yīng)答反響原性產(chǎn)生特異性反響二、抗原決定簇是與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識別受體相結(jié)合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學(xué)基團。類型：功能性抗原決定簇隱蔽性抗原決定簇免疫優(yōu)勢決定簇線性或連續(xù)性決定簇構(gòu)象決定簇或不連續(xù)性決定簇B細(xì)胞所識別的是半抗原決定簇；T細(xì)胞所識別的是免疫原性決定簇或連續(xù)性決定簇。三、抗原的性質(zhì)與種類〔一〕抗原的性質(zhì)1、抗原的異物性機體能對進入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。該物質(zhì)與機體的種系關(guān)系愈遠(yuǎn)，其免疫原性愈強，機體的免疫反響也更強。自身抗原；自身抗體2、大分子膠體作為抗原，分子愈大，其免疫原性愈強3、抗原的特異性各種抗原物質(zhì)各有其特異的抗原決定簇，即一種抗體只能與相應(yīng)的抗原起反響而不能與其它抗原反響?！捕晨乖姆N類方法分類依據(jù)種類單獨存在時是否有免疫原性半抗原和完全抗原抗原來源外源性抗原和內(nèi)源性抗原抗原與宿主關(guān)系異種抗原，同種異體抗原，自身抗原B細(xì)胞產(chǎn)生抗體時是否需要T細(xì)胞輔助胸腺依賴抗原，胸腺非依賴抗原化學(xué)物質(zhì)蛋白質(zhì)，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，核酸等物理狀態(tài)顆粒性抗原，可溶性抗原產(chǎn)生方式天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原抗原特異性程度特異性抗原，共同抗原完全抗原：同時具有免疫原性和反響原性的物質(zhì)。不完全抗原或半抗原：無免疫原性。第二節(jié)抗體〔antibody〕一、抗體的概念機體受到抗原刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反響的球蛋白。二、抗體的性質(zhì)和種類〔一〕抗體的一般性質(zhì)免疫球蛋白約等于抗體，分五類：IgG,IgM,IgA,IgD,IgE〔二〕免疫原性和分類特性免疫球蛋白都是大分子蛋白質(zhì)，具有免疫原性，課作為抗原。由于存在著輕鏈和重鏈，可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)，因此，分子結(jié)構(gòu)差異較大，免疫原性比較復(fù)雜?！踩晨贵w的種類1、根據(jù)抗體的途徑或來源不同分為免疫抗體；天然抗體；自身抗體2、根據(jù)抗原抗體在試管內(nèi)是否出現(xiàn)肉眼反響分為完全抗體；不完全抗體三、抗原與抗體反響稱為免疫學(xué)反響。在體內(nèi)進行稱為免疫反響；在體外稱為血清學(xué)反響四、抗體形成的機制〔一〕免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1、感應(yīng)階段〔識別及加工處理抗原階段〕2、反響階段〔淋巴細(xì)胞增殖分化階段〕3、效應(yīng)階段〔發(fā)生免疫反響階段〕〔二〕影響抗體產(chǎn)生的因素1、抗原的質(zhì)和量2、機體方面3、佐劑的增強免疫作用單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較特性多克隆單克隆組成多種類抗體的混合物單一種類的抗體特異性低高針對多個抗原決定族針對單一的抗原決定族親和力平均親和力較高不定，較低交叉反響高低〔二〕抗體的配制方法1、抗體貯存2、抗體使用液的配制二、組織材料的處理盡量保存好抗原性不喪失、不擴散、不被破壞三、免疫染色1、增強特異性染色方法蛋白酶消化法；適宜的抗體稀釋度；溫育時間2、減少或消除非特異性染色方法3、顯色反響的控制4、復(fù)染四、對照陽性對照；陰性對照五、結(jié)果的判斷〔一〕陽性細(xì)胞的染色特性1、分胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜外表陽性2、灶狀和彌漫性3、非特異性的認(rèn)知4、切片質(zhì)量不佳出現(xiàn)的陽性要排除〔二〕染色失敗的幾種原因二、熒光素1、熒光色素能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為－－－－。特性：必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光；具有吸收一定頻率光能的生色團和能產(chǎn)生一定光亮子的熒光團。2、用于標(biāo)記抗體的熒光素必須具備以下條件：1〕應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基因，結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易排除。2〕熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合熒光效率下降不多。3〕結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。4〕與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便而快速。5〕熒光素容易溶解，溶解后不會與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反響。6〕熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色比照鮮明，能清晰判斷結(jié)果。3、熒光素的類型1〕異硫氰酸熒光素〔fluorescienisothocyanate,FITC)2〕四甲基異硫氰酸羅達(dá)明〔tetraethylrhodamineisothocyanate,TRITC)3〕四乙基羅達(dá)明〔tetraethylrhodamine,RB200)4〕其它三、免疫熒光染色方法1、直接法：用特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細(xì)胞和組織抗原的檢查。優(yōu)點：特異性高缺點：一種熒光抗體只能檢測一種抗原。2、間接法：用特異性的抗體〔1抗〕與細(xì)胞或組織標(biāo)本反響，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體〔2抗〕與結(jié)合再抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原→抗體→熒光抗體的復(fù)合物。優(yōu)點：熒光亮度增強，提高了敏感度四、非特異性染色的消除方法1、非特異性染色的主要因素1〕局部熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2〕抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。3〕組織內(nèi)類屬抗原的存在。4〕從組織中難以提純抗原性物質(zhì)。5〕抗體分子上標(biāo)記的熒光素太多。6〕熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)。7〕細(xì)胞和組織內(nèi)某些物質(zhì)自發(fā)熒光。8〕染色時間過長，溫度過高，沖洗不夠或標(biāo)本枯燥。2、消除的方法1〕襯染法〔可抑制自發(fā)熒光〕2〕胰蛋白酶消化〔可抑制非特異性熒光〕3〕吸收〔用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色〕4〕用正?！卜敲庖摺逞濉踩コ园l(fā)熒光和非特異性熒光〕5〕提高抗體和熒光抗體的質(zhì)量五、熒光顯微鏡及檢測方法略六、染色標(biāo)本的保存原那么上應(yīng)立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，此時熒光最強。用緩沖甘油封片，保存在4℃中，過夜后特異性熒光強度減弱25％，保存1周后減弱60％。Nikon熒光顯微鏡腎活檢〔直接法〕腎活檢〔直接法〕腎活檢〔直接法〕低倍視野腎活檢〔直接法〕，表達(dá)弱腎活檢〔直接法〕腎活檢〔直接法〕左圖：表達(dá)在細(xì)胞核〔FITC〕右圖：表達(dá)在胞膜左圖：DAPI染色〔染核〕右圖：胃粘膜上皮細(xì)胞，胞漿胞膜陽性血管內(nèi)彈力膜陽性胃腺癌二、固定原那么是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為1～12h。1.常用的固定劑〔1〕甲醛緩沖液廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時間不直超過24h?！?〕4％多聚甲醛磷酸緩沖液廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究?！?〕戊二醛～多聚甲醛緩沖液適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究?！?〕其它如PLP液〔過碘酸~賴AA~多聚甲醛固定液〕、丙酮及醇類、鋨酸等。2.固定本卷須知〔1〕固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：A.組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好。B.最大限度保存抗原的抗原性?！?〕組織塊的大小：1.5cm×1.5cm×0.5cm為宜?！?〕固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。〔4〕溫度：一般在室溫下進行，電鏡標(biāo)本和固定時間較長時可放置在4℃冰箱?！?〕固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。三、包埋1.石蠟包埋2.冷凍包埋3.環(huán)氧樹脂包理四、切片1.載玻片的處理〔1〕清洗〔2〕涂膠〔防止脫片〕。常用粘附劑：①明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠。②樹脂膠：也稱白膠。③多聚賴氨酸〔PLL〕。④商品化粘附劑。2.切片類型〔l〕石蠟切片厚約3～5μm，放置37℃溫箱烘烤過夜，以減少脫片?！?〕冷凍切片：2μm?！?〕振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。神經(jīng)組織應(yīng)用較多。3.非特異染色的控制非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反響所出現(xiàn)的染色。〔1〕原因分析組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等.試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過量等。〔2〕消除方法加1抗前加正常血清10～30min，以封閉組織中帶電荷的基因，防止與1抗的非特異性結(jié)合。減少非特異性染色：a.免疫酶組化染色時，在加1抗前，用0.3%的H2O2甲醇溶液將組織切片處理30min〔3%的H2O2甲醇溶液處理5～10min〕。b.免疫熒光染色時，可用0.01～0.05％伊文思藍(lán)稀釋熒光抗體。二、對照陽性對照片：用抗原為陽性的標(biāo)本作對照陰性對照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對照三、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存1.抗體的分裝不能用完的抗體分裝在小的EP管內(nèi)，保存在-20～-40℃的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。2.抗體稀釋常用0.01MPBS〔磷酸緩沖溶液〕或BSA〔牛血清白蛋白〕3.滴加滴加抗體要充分覆蓋組織切片，一般加30～50μL,最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈,以防溶液的擴散。4.保存未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存?！?〕間接法原理：先用標(biāo)記的特異性1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體〔2抗〕孵育，然后再加酶的底物，顯示抗原～抗體～抗原抗體復(fù)合物存在的部位，以對抗原進行檢測。如：1抗是由兔產(chǎn)生的多克隆抗體,那么2抗常用羊抗兔IgG；1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體,那么2抗常用羊或馬抗鼠IgG。以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法〔3〕非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進行標(biāo)記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。常用的有PAP、sABC、LsAB法〔附圖表說明〕〔酶標(biāo)識特異抗體］〔酶標(biāo)識二次抗體］生物素

HRPALP第三節(jié)免疫組化的實際操作1.實驗準(zhǔn)備〔必須器材〕〔1〕實驗臺：光線充足，方便操作?！?〕濕潤盒：放置抗原抗體反響過程中反響，防止枯燥?！?〕微量移液器：1～20μl,20～200μl,100～1000μl?！?〕其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。2.試劑藥品〔1〕緩沖液：PBS,0.01M磷酸緩沖液〔pH7.2〕TBS,0.05MTris鹽酸緩沖液〔pH7.6〕〔2〕抗體稀釋液:1％BSA或0.01MPBS〔3〕10％2抗免疫動物的正常血清〔4〕DBA～H2O2顯色液〔5〕核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠3.sABC法的操作過程根本原理：sABC〔strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex〕鏈球菌～抗生物素〔卵白蛋〕～生物素～過氧化物酶復(fù)合物生物素(biotin):是一種分子量為244da的小分子的維生素?？股锼?avidin):是一種糖蛋白，分子量為68KDa。生物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素---抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。附根本操作步驟第四節(jié)本卷須知及結(jié)果判定要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。1.取材固定標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要新鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。2.切片切片不宜過厚，一般4μm左右。切片不宜過大，載玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放37℃溫箱保存。3.脫蠟脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯5min×3。4.蛋白酶消化由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反響前常用蛋白酶處理組織切片〔根據(jù)1抗要求〕，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強特異性染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化5～30min。5.抗原修復(fù)一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐，85～95℃，10min左右。6.抗體的選擇選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，由此來選擇2抗；還有抗體的稀度〔在實驗前根據(jù)預(yù)實驗選擇最正確濃度］。7.特異性確實定陰性對照〔不加1抗，用PBS或TBS代替〕陽性對照〔確定陽性的組織〕或買陽性對照片顯色：注意H2O2的濃度，必須在顯示前參加H2O2均勻攪拌，最正確顯色時間在3～5min，過短或過長都不會出現(xiàn)滿意的效果。9.復(fù)染一般用蘇木素30s～1min，過長復(fù)染將掩蓋免疫組化的染色效果。10.結(jié)果判定判斷是否陽性或陰性，要排除假陽性或假陰性結(jié)果。也要學(xué)會判斷特異性染色和非特異性染色。呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。有關(guān)陽性結(jié)果的定量判斷，常規(guī)的方法是根據(jù)呈色深淺和陽性細(xì)胞數(shù)量分類計算，以〔-〕,+,++,+++等分級和計數(shù)統(tǒng)計。以下用圖片說明胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移cerbB-2癌基因表達(dá)sABC法胃癌，P53抑癌基因表達(dá)，sABC法胃癌CerbB-2的表達(dá)，sABC法胃癌cerbB-2的淋巴管侵襲，sABC法胃淋巴組織反響性增生，CD20/CD43檢測sABC法胃組織中的反響性增生的淋巴組織，CD43表達(dá)，sABC法IgAN，TGFs2表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)，sABC法IgAN,TGFs2的表達(dá)，sABC法IgAN，bFGF的表達(dá)，sABC法IgAN,PDGF的表達(dá)，sABC法骨骼肌營養(yǎng)不良，myosin蛋白表達(dá)，sABC法第五節(jié)免疫組織化學(xué)在病理診斷中的應(yīng)用范圍1.腫瘤診斷未分化惡性腫瘤性質(zhì)判定；圓形、梭形、多形性腫瘤細(xì)胞鑒別；轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位確實定。2.淋巴瘤的診斷鑒定反響性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。3.內(nèi)分泌腫瘤的診斷〔檢測腫瘤分泌的激素)4.軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤5.小活檢組織病理檢查〔能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否)6.微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶〔淋巴結(jié)和骨髓)7.細(xì)針穿刺〔細(xì)胞學(xué)診斷)8.局部腫瘤來源分類9.乳腺癌激素受體檢測〔ER，PR)10.腫瘤基因產(chǎn)物〔p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖細(xì)胞核抗原〔Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預(yù)后12.病因診斷〔HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等)〔2〕固定固定液的選擇：既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液〔PG固定液〕B.過碘酸鹽～賴氨酸～多聚甲醛混合固定液〔PLP固定液〕C.苦味酸～多聚甲醛～戊二醛固定液〔PAPG固定液)固定方法與時間：A.血管灌注固定〔最好方法〕B.浸泡固定C.微波固定包埋前與包埋后的比較包埋前包埋后優(yōu)點缺點修正未經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，標(biāo)記的陽性率高，提高電鏡的檢出率。免疫染色完畢后用戊二醛與鋨酸作后固定，可使抗原抗體結(jié)合的更加牢固，并有利于膜結(jié)構(gòu)的保存。標(biāo)記前細(xì)胞內(nèi)抗原受到標(biāo)記抗體的穿透性限制（因是組織塊）制作厚切片；增加細(xì)胞膜的通透性具有陽性結(jié)果重復(fù)性高、方法簡便可靠的優(yōu)點，可對同一組織塊的連續(xù)切片作各種對照染色，能十分準(zhǔn)確的解釋染色結(jié)果，而且還能在同一張切片上進行多重免疫染色?？乖诿撍⒔讣皹渲襁^程中可能被破壞，使免疫染色的陽性率下降。細(xì)胞膜保存差（鋨酸作用）固定液選擇苦味酸(保護細(xì)胞膜)包埋劑協(xié)作低溫樹脂肝細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，可見G-6-P酶陽性反響產(chǎn)物。(×32000)肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽性反響顆粒〔×36000〕。IgAN,TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法IgAN,TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機聯(lián)合的免疫電鏡法〔實驗結(jié)果介紹〕一、紫外線低溫包埋機〔SPI#17020〕

SPI#17020是美國特殊研制的低溫包埋機，它最主要的特點是采用數(shù)字化溫度控制，通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在-10℃～-37℃之間。通過溫度控制風(fēng)扇可以使機內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長達(dá)36小時，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時間。它占地面范圍小，但機內(nèi)空間較大，可以同時放入72個包埋膠囊。而且機箱上方有兩個封閉起來的波長為360nm的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機中進行?？傊?，紫外線低溫包埋機是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機器。

二、LowicrylsK4M低溫包埋劑

LowicrylsK4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，其特點是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關(guān)，而且LowicrylsK4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。三、方法1.包埋劑的配制商品提供的LowicrysK4M包埋劑由三個局部組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：〔1〕LowicrylsK4M：單體17.30g；交聯(lián)劑2.70g；引發(fā)劑0.10g?？闪咳『螅⑷胱厣牟Ａ萜鞅芄?，用玻璃棒輕攪3～5分鐘。勿過分?jǐn)嚢瑁苑揽諝獾臍馀葸M入包埋劑中?！?〕LowicrylsK4M的貯存：應(yīng)保存在暗處室溫下，該物質(zhì)有刺激性，在配制時應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部。2.組織和細(xì)胞的取材、固定、處理〔1〕組織的取材與固定：用銳刀將新鮮組織切成1～3mm3的小塊,迅速置于3%多聚甲醛-1%戊二醛固定液中,2～3h?！?〕