第3章基因工程章末總結(jié)課件-高二下學期生物人教版選擇性必修3

第3章基因工程章末總結(jié)構(gòu)建·知識網(wǎng)絡基因工程基因工程基因工程歸納·專題小結(jié)1．三辨分辨限制酶的種類、識別序列和切割位點。選擇限制酶時，不能破壞目的基因的結(jié)構(gòu)。在切割目的基因和載體時，為了便于目的基因和載體連接，一般用同一種限制酶進行切割。但是為了防止目的基因與載體的自連接和隨意連接，也可用不同的限制酶進行切割。2．三找找出標記基因、目的基因及目的基因插入位點。一般來說，質(zhì)粒中至少要有一個標記基因，如抗生素抗性基因。明確目的基因的插入位點是在標記基因內(nèi)部還是在標記基因之外?；蚬こ袒静僮黝愒囶}解題技巧3．一析分析目的基因插入質(zhì)粒后是否會破壞標記基因。如果質(zhì)粒中僅有一個標記基因，則目的基因插入后不能破壞標記基因；如果質(zhì)粒中有兩個至多個標記基因，則至少應保留一個完整的標記基因。4．判斷目的基因是否導入受體細胞的方法對細菌來說，一般用含有某種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，如果質(zhì)粒上有兩種抗生素抗性基因，還需判斷用哪一種抗生素來檢測。某質(zhì)粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三種限制酶切割位點，同時還含有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素基因。利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如下圖所示，請回答下列問題。(1)將抗鹽基因?qū)霟煵菁毎麅?nèi)，使煙草植株產(chǎn)生抗鹽性狀，這種新性狀(變異性狀)的來源屬于__________。(2)如果將抗鹽基因直接導入煙草細胞，一般情況下，煙草不會具有抗鹽特性，原因是抗鹽基因在煙草細胞中不能__________，也不能____________。(3)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，應選用________和________兩種酶對________和____________________進行切割，以保證重組DNA序列的唯一性。(4)基因工程中的檢測篩選是一個重要的步驟。為篩選出導入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，下圖表示運用影印培養(yǎng)法(使一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)檢測基因表達載體是否導入了農(nóng)桿菌。除了含有細菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有__________、________。從檢測篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是________菌落中的細菌。為了確定抗鹽煙草是否培育成功，既要用______技術(shù)作探針進行分子雜交檢測，又要用____________________________的方法從個體水平鑒定煙草植株的耐鹽性。(5)將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細胞培育成完整的植株需要用__________技術(shù)，

愈傷組織經(jīng)__________進而形成完整植株，此過程除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加________。【答案】(1)基因重組(2)復制表達(合成抗鹽基因的mRNA)(3)SalⅠ

HindⅢ質(zhì)粒含抗鹽基因的DNA(4)氨芐青霉素四環(huán)素4和6

PCR一定濃度的鹽水澆灌煙草植株(將煙草植株移栽到鹽堿地中)(5)植物組織培養(yǎng)細胞增殖和分化(再分化)植物激素(生長素和細胞分裂素)【解析】(1)基因工程的原理是基因重組。(2)將抗鹽基因直接導入煙草細胞，一般情況下，煙草不會具有抗鹽特性，原因是抗鹽基因在煙草細胞中不能復制，也不能表達，即不能轉(zhuǎn)錄和翻譯成相應的蛋白質(zhì)。(3)用SalⅠ和HindⅢ兩種限制酶對質(zhì)粒和抗鹽基因進行切割時，可保證重組DNA序列的唯一性，并且不會破壞抗鹽基因。(4)用SalⅠ和HindⅢ兩種限制酶對質(zhì)粒進行切割時，會破壞抗四環(huán)素基因，但不會破壞抗氨芐青霉素基因，因此導入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生存，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存，所以培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有氨芐青霉素、四環(huán)素，含目的基因的是4和6菌落中的細菌?？梢杂肞CR技術(shù)檢測目的基因是否插入了煙草細胞染色體的DNA上。除了從分子水平上進行檢測，還可以從個體水平上進行檢測，即用一定濃度的鹽水澆灌煙草植株來檢測煙草的耐鹽性。(5)將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細胞培育成完整的植株需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，愈傷組織經(jīng)再分化進而形成完整植株，此過程除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加相應的植物激素。1．構(gòu)建基因表達載體不可缺少的工具酶是限制酶和DNA連接酶。2．選擇何種限制酶取決于目的基因內(nèi)部是否含有限制酶的識別序列，以及目的基因兩端和載體上的限制酶的識別序列和切割位點。解決此類問題時要遵循以下原則：①目的基因內(nèi)部含有某種限制酶的識別序列，不能選用此種限制酶；②要在目的基因的兩端和載體上切出相同的黏性末端或平末端，以保證目的基因與載體的連接；③至少保證載體上有一個標記基因不被破壞，以便篩選；④要確保目的基因能插入載體的啟動子與終止子之間。基因表達載體的構(gòu)建與限制酶切割片段的判斷3．E.coli

DNA連接酶只能連接雙鏈DNA的黏性末端，而T4DNA連接酶既可連接雙鏈DNA的黏性末端，又可連接平末端。因此，在構(gòu)建基因表達載體時要根據(jù)限制酶切割的結(jié)果來加以選擇。4．限制酶切割DNA或載體后產(chǎn)生的片段數(shù)或片段長度：解答此類問題，首先要認真、仔細審題，明確每一種限制酶的切割位點，確定不同限制酶切割位點間的距離，然后再得出結(jié)論。

2015年，屠呦呦因發(fā)現(xiàn)青蒿素而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。工業(yè)上一般從黃花蒿植株中提取青蒿素，產(chǎn)量低，價格高?；蚬こ碳凹毎こ痰葹榕嘤龈咔噍锼睾康狞S花蒿提供了思路?？茖W家用紫外線處理大量黃花蒿幼苗后，偶然發(fā)現(xiàn)一株高產(chǎn)植株。通過基因測序發(fā)現(xiàn)與該高產(chǎn)植株控制青蒿素合成的一種關(guān)鍵酶的基因發(fā)生了突變。(1)提取了高產(chǎn)植株的全部DNA后，要想快速大量獲得該突變基因可以采用PCR技術(shù)，該技術(shù)的原理是____________________。(2)將獲得的突變基因?qū)肫胀S花蒿之前，先構(gòu)建基因表達載體，圖1、2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題。用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ限制酶切割，原因是_____________________________________，為了便于目的基因與載體的連接，可以選用_____________限制酶進行切割；為了防止目的基因與載體的自連接和隨意連接，可以選用_____________________________________兩種限制酶進行切割。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒在其目的基因前要加上特殊的啟動子，啟動子是____________識別并結(jié)合的位點。(3)檢測目的基因是否表達出相應蛋白質(zhì)，應采取__________技術(shù)?！敬鸢浮?1)DNA半保留復制(2)SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因EcoRⅠ

EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶(或EcoRⅠ限制酶和HindⅢ限制酶，BamHⅠ限制酶和HindⅢ限制酶)

RNA聚合酶(3)抗原－抗體雜交【解析】(1)PCR技術(shù)擴增目的基因的原理為DNA半保留復制，是一項體外擴增DNA的技術(shù)。(2)分析圖2可知，目的基因和抗生素抗性基因中含有SmaⅠ限制酶的切割位點，因此若用SmaⅠ切割圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因。目的基因的兩端和載體上都有EcoRⅠ限制酶的識別序列，為了便于目的基因和載體的連接，可以用EcoRⅠ限制酶進行切割；目的基因兩端和載體上還有BamHⅠ限制酶和HindⅢ限制酶的識別序列，為了防止目的基因和載體的自連接和隨意連接，可以用EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶，或EcoRⅠ限制酶和HindⅢ限制酶，或BamHⅠ限制酶和HindⅢ限制酶任一組合進行切割。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒在其目的基因前要加上特殊的啟動子，啟動子是RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點。(3)根據(jù)抗原與抗體能特異性并結(jié)合的特點，檢測目的基因是否表達出相應蛋白質(zhì)，應采取抗原—抗體雜交技術(shù)。名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA分子切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端與DNA有關(guān)的幾種酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果DNA酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端為有效地控制瘧疾的傳播，研究人員對一種特異性地感染蚊子的真菌——平沙綠僵菌進行基因改造，讓它產(chǎn)生一種更快地殺死攜帶瘧原蟲的蚊子的毒素。基因改造過程如圖1。回答下列有關(guān)問題。(1)下列對于圖1中基因工程操作有關(guān)的工具及目的對應正確的是________(多選)。選項序號工具或操作目的A①限制酶獲取毒素基因B①限制酶、連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒C②其他微生物介入重組質(zhì)粒導入受體細胞D③熒光檢測篩選含有毒素基因的綠僵菌(2)圖2為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化。

圖2中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是______________。其中有磷酸二酯鍵形成的過程是______________。(均填序號)圖2

(3)在實驗室內(nèi)大量繁殖綠僵菌的過程中，保證培養(yǎng)條件無菌的操作有______(多選)。A．按營養(yǎng)所需配制培養(yǎng)基B．將配制好的培養(yǎng)基置于121℃、高壓下15minC．在超凈工作臺上接種D．使用灼燒后的接種環(huán)挑取綠僵菌的孢子(4)該基因工程中使用的平沙綠僵菌，天然具有滅蚊效果。圖3為對照組、野生綠僵菌和轉(zhuǎn)基因綠僵菌環(huán)境下蚊子的存活情況。研究者在導入毒素基因的同時，也轉(zhuǎn)入了控制該基因表達的“開關(guān)”，使毒素基因只有在蚊子體內(nèi)才能被激活。請從防治效果和安全性兩方面對該控蚊策略進行評價：

_____________________________________?！敬鸢浮?1)BCD

(2)①④②③

②④(3)BCD

(4)防治效果：①轉(zhuǎn)基因綠僵菌環(huán)境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②盡管轉(zhuǎn)基因綠僵菌環(huán)境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趨于平緩，接近于野生綠僵菌環(huán)境，防治效果不持久。安全性：①該毒素基因僅在蚊子體內(nèi)表達，避免了對自然界中其他生物產(chǎn)生毒害，提高了安全性；②蚊子的數(shù)量大幅下降，可能對其他生物的生存造成影響【解析】(1)①表示用同一種限制酶切割毒素基因和質(zhì)粒，除了獲取毒素基因外，還用來獲取與毒素基因具有相同黏性末端的質(zhì)粒，A錯誤；①表示用限制酶切割毒素基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接毒素基因和質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒，B正確；②表示利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導入受體細胞，C正確；③表示通過熒光檢測，篩選出含有毒素基因的綠僵菌，D正確。故選BCD。(2)限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的復制，能在單鏈上將一個個脫氧核苷酸連接起來，因此作用于④；DNA連接酶能在具有相同堿基末端的兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，因此作用于②；解旋酶能夠?qū)NA分子的雙螺旋解開，故作用于③；其中DNA連接酶和DNA聚合酶催化形成磷酸二酯鍵，而限制酶催化磷酸二酯鍵斷裂，解旋酶作用于氫鍵。(3)配制好的培養(yǎng)基需要高壓蒸汽滅菌，因此按營養(yǎng)所需配制培養(yǎng)基時，不需要無菌條件，A錯誤；配制好的培養(yǎng)基置于121℃、高壓下15min，必須保證無菌操作，B正確；在超凈工作臺上接種，必須保證無菌操作，C正確；使用灼燒后的接種環(huán)挑取綠僵菌的孢子，必須保證無菌操作，D正確。故選BCD。(4)在導入毒素基因的同時，也轉(zhuǎn)入了控制該基因表達的“開關(guān)”，使毒素基因只有在蚊子體內(nèi)才能被激活。結(jié)合圖3的曲線圖分析可知，從防治效果評價：①轉(zhuǎn)基因綠僵菌環(huán)境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②盡管轉(zhuǎn)基因綠僵菌環(huán)境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趨于平緩，接近于野生綠僵菌環(huán)境，防治效果不持久。從安全性評價：①該毒素基因僅在蚊子體內(nèi)表達，避免了對自然界中其他生物產(chǎn)生毒害，提高了安全性；②蚊子的數(shù)量大幅下降，可能對其他生物的生存造成影響。電泳圖譜1．原理電泳是利用帶電分子或離子所帶電荷或分子量不同，在電場中移動距離(或速度)不同來達到分離分子或離子的方法，如等位基因A與a，經(jīng)限制酶切開后，由于相關(guān)片段分子量等差異，在電場中移動距離不同，從而使兩種基因得以分離。2．實例對下面圖1中1～4號個體進行基因檢測，將含有該遺傳病基因或正?；虻南嚓P(guān)DNA片段各自用電泳法分離。正?；蝻@示一個條帶，致病基因顯示為另一個不同的條帶，結(jié)果如下圖2。請據(jù)圖1、圖2分析圖1中5號及7號個體基因電泳條帶應為何類？圖1

圖2分析如下：(1)先據(jù)圖1推得1～4號個體基因型，4號為aa，則1、2號均為Aa，3號為AA或Aa。(2)將1～4號個體基因型與圖2的電泳圖譜做對照發(fā)現(xiàn)只有c編號的個體基因電泳帶特別，只有條帶2，無條帶1，則c所代表的個體中基因型為“純合子”，即只含一種基因，由此推測c為圖1中1～4號中的4號個體。進一步結(jié)合圖1與圖2可推知a、b、d所代表的個體既含A又含a(由此確定3號不可能為AA)。(3)由5、6號均正常，所生女兒7號為患者可推知，5號基因型為Aa，應含條帶1、條帶2；7號個體基因型為aa，其電泳條帶應與c吻合。

(2021·河北卷)我國科學家利用栽培稻(H)與野生稻(D)為親本，通過雜交育種方法并輔以分子檢測技術(shù)，選育出了L12和L7兩個水稻新品系。L12的12號染色體上帶有D的染色體片段(含有耐缺氮基因TD)，L7的7號染色體上帶有D的染色體片段(含有基因SD)，兩個品系的其他染色體均來自H(圖1)。H的12號和7號染色體相應片段上分別含有基因TH和SH。現(xiàn)將兩個品系分別與H雜交，利用分子檢測技術(shù)對實驗一親本及部分F2的TD/TH基因進行檢測，對實驗二親本及部分F2的SD/SH基因進行檢測，檢測結(jié)果以帶型表示(圖2)?；卮鹣铝袉栴}：(1)為建立水稻基因組數(shù)據(jù)庫，科學家完成了水稻________條染色體的DNA測序。(2)實驗一F2中基因型TDTD對應的是帶型__________。理論上，F(xiàn)2中產(chǎn)生帶型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的個體數(shù)量比為____________。(3)實驗二F2中產(chǎn)生帶型α、β和γ的個體數(shù)量分別為12、120和108，表明F2群體的基因型比例偏離__________定律。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的雌配子均正常，但部分花粉無活性。已知只有一種基因型的花粉異常，推測無活性的花粉帶有__________(填“SD”或“SH”)基因。(4)以L7和L12為材料，選育同時帶有來自D的7號和12號染色體片段的純合品系X(圖3)。主要實驗步驟包括：①__________________；②對最終獲得的所有植株進行分子檢測，同時具有帶型________的植株即為目的植株。(5)利用X和H雜交得到F1，若F1產(chǎn)生的無活性花粉所占比例與實驗二結(jié)果相同，雌配子均有活性，則F2中與X基因型相同的個體所占比例為____________?！敬鸢浮?1)12

(2)Ⅲ

1∶2∶1

(3)基因分離SD

(4)①將L7和L12雜交，獲得F1后自交②α和Ⅲ

(5)1/80【解析】分析題意和條帶可知，L12的12號染色體上含有耐缺氮基因TD，其基因型為TDTD；L7的7號染色體上含有基因SD，基因型為SDSD；H的12號染色體上的基因為TH，7號染色體上的基因為SH，基因型為SHSHTHTH；TD與TH，SD與SH的遺傳遵循基因分離和自由組合定律。(1)水稻為雌雄同株的植物，沒有性染色體和常染色體之分，分析題圖可知，水稻含有12對同源染色體，即有24條染色體，故對水稻基因組測序，需要完成12條染色體的DNA測序。(2)實驗一是將L12(基因型為TDTD)與H(基因型為THTH)雜交，F(xiàn)1的基因型為TDTH，F(xiàn)2的基因型分別為TDTD∶TDTH∶THTH＝1∶2∶1，其中TDTD對應的帶型與親本L12對應的條帶相同，即條帶Ⅲ，理論上，F(xiàn)2中產(chǎn)生帶型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的個體數(shù)量比為1∶2∶1。(3)實驗二是將L7(基因型為SDSD)與H(基因型為SHSH)雜交，F(xiàn)1的基因型為SDSH，理論上F2的基因型分別為SDSD∶SDSH∶SHSH＝1∶2∶1，其中SDSD對應的是帶型與親本L7對應的條帶相同，即條帶α，SDSH對應條帶為β，SHSH對應條帶為γ，理論上，F(xiàn)2中產(chǎn)生帶型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的個體數(shù)量比為1∶2∶1。實際上F2中產(chǎn)生帶型α、β、γ的個體數(shù)量分別為12、120和108，表明F2群體的基因型比例偏離分離定律；進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的雌配子均正常，但部分花粉無活性；已知只有一種基因型的花粉異常，而帶型α，即SDSD的個體數(shù)量很少，可推測無活性的花粉帶有SD基因。(4)已知TD與TH，SD與SH兩對基因分別位于7號和12號染色體上，兩對等位基因遵循自由組合定律，以L7和L12為材料，選育同時帶有來自D的7號和12號染色體片段的純合品系X，基因型為SDSDTDTD；同時考慮兩對等位基因，可知L7的基因型為SDSDTHTH，L12的基因型為SHSHTDTD，①將L7和L12雜交，獲得F1(SDSHTDTH)后自交，②對最終獲得的所有植株進行分子檢測，同時具有帶型α和Ⅲ的植株即為目的植株。典練·素養(yǎng)提升素養(yǎng)解讀：本章主要內(nèi)容是基因工程，通過學習基因工程，認識重組DNA技術(shù)的各種基本工具的特點，探究基因工程的基本操作程序，了解基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應用和蛋白質(zhì)工程的作用原理。常涉及的核心素養(yǎng)有生命觀念(通過闡述DNA重組技術(shù)所需的三種工具的作用，建立結(jié)構(gòu)與功能觀)、科學思維和科學探究(能結(jié)合轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育概述基因工程操作的基本操作程序，嘗試設(shè)計探究某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程；闡述蛋白質(zhì)工程的原理和過程等)、社會責任(關(guān)注基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)的應用改善了人類生活品質(zhì)等問題，關(guān)注蛋白質(zhì)工程的應用，倡導理性客觀的科學態(tài)度，做科學文化知識的傳播者和踐行者)。1．(生命觀念)下列有關(guān)基因工程的敘述，正確的是 (

)A．E.coliDNA連接酶既能連接平末端，又能連接黏性末端B．限制性內(nèi)切核酸酶既能識別、切割DNA，又能識別、切割RNAC．載體上的標記基因有利于篩選含重組DNA的細胞D．細菌的質(zhì)粒、棉花的核DNA、動植物病毒都可作為基因工程中的載體【答案】C【解析】E.coliDNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，A錯誤；限制性內(nèi)切核酸酶不能識別、切割RNA，B錯誤；載體上的標記基因有利于篩選含重組DNA的細胞，C正確；棉花的核DNA位于細胞核內(nèi)的染色體上，不能作為基因工程的載體，D錯誤。2．(科學思維、科學探究)下圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖(ampr為抗氨芐青霉素基因)，其中①④表示相關(guān)的操作步驟，甲、乙表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細胞。請據(jù)圖作答(題中四種限制酶切割產(chǎn)生的末端不相同)：(1)在構(gòu)建基因表達載體時，可用一種或多種限制酶進行切割，為了避免目的基因和載體在酶切后發(fā)生任意連接，在此實驗中應該選用__________分別對含魚抗凍蛋白基因的DNA片段和質(zhì)粒進行切割，含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒被切割后產(chǎn)生的DNA片段分別有________、________個。(2)基因工程的核心步驟是________(填序號)，該步驟的目的是_____________________________________。為了使目的基因正常表達，其首端必須有啟動子，它是________識別和結(jié)合的部位。若限制酶切出了平末端，要選擇__________(填“E．coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)進行連接。(3)圖中將魚抗凍蛋白基因?qū)敕鸭毎姆椒ㄒ话銥開_________。該方法用到的Ti質(zhì)粒中含有________，可以將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞的染色體上。(4)檢測番茄植株細胞中魚抗凍蛋白基因是否成功表達，分子水平上常采用的方法是____________________。【答案】(1)PstⅠ、SmaⅠ

4

2(2)①使目的基因穩(wěn)定存在并能遺傳下去，使目的基因能夠表達及發(fā)揮作用RNA聚合酶T4DNA連接酶(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法T－DNA

(4)抗原－抗體雜交【解析】在構(gòu)建基因表達載體時，如果目的基因和載體用同一種限制酶切割，獲得的末端相同，可能會發(fā)生自連現(xiàn)象。為避免目的基因和載體在酶切后發(fā)生任意連接，應選用兩種不同的限制酶切割，分析圖中4種酶的切割位點可知，應選用PstⅠ和SmaⅠ對含魚抗凍蛋白基因的DNA片段、質(zhì)粒進行切割，含目的基因的DNA片段被切割后產(chǎn)生4個DNA片段，質(zhì)粒被切割后產(chǎn)生2個DNA片段。(2)基因工程的核心步驟是①(基因表達載體的構(gòu)建)，該步驟的目的是使目的基因穩(wěn)定存在并能遺傳下去，使目的基因能夠表達及發(fā)揮作用。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。若限制酶切出了平末端，應選擇T4DNA連接酶進行連接。(3)圖中將魚抗凍蛋白基因?qū)敕鸭毎姆椒ㄒ话銥檗r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。該方法用到的Ti質(zhì)粒中含有T－DNA，可以將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞的染色體上。(4)檢測番茄植株細胞中魚抗凍蛋白基因是否成功表達，分子水平上常采用的方法是抗原－抗體雜交。3．(科學探究)人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，但給心?；颊咦⑸浯髣┝炕蚬こ蘴-PA蛋白會誘發(fā)顱內(nèi)出血。研究證實，將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低其出血副作用。對天然t-PA基因進行改造，并使其在大腸桿菌細胞內(nèi)表達，可制造出改良t-PA蛋白。如圖表示相關(guān)的目的基因、載體及限制酶。pCLY11為質(zhì)粒，新霉素為抗生素。(1)制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白的過程屬于__________工程，是通過__________基因來實現(xiàn)的。(2)據(jù)圖分析，應選擇__________酶切開pCLY11，才能使其與t-PA改良基因高效連接；neor基因的作用是________________________。(3)將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌時，一般先用________處理大腸桿菌，目的是________________。(4)篩選和鑒定含有重組質(zhì)粒的受體細胞，需要在培養(yǎng)液中添加__________，選擇有新霉素抗性的大腸桿菌，同時還可以根據(jù)mlacZ基因的表達情況，選擇______色的大腸桿菌?！敬鸢浮?1)蛋白質(zhì)改造或合成相關(guān)(2)XmaⅠ和BglⅡ篩選成功導入重組pCLY11的細菌(3)Ca2+使大腸桿菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)(4)新霉素白【解析】(1)對天然t-PA基因進行改造，并使其在大腸桿菌細胞內(nèi)表達，可制造出改良t-PA蛋白，

要達到上述目的，需要先對天然的t-PA基因進行改造，再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達該突變基因，可制造出性能優(yōu)異的t-PA突變蛋白，這屬于蛋白質(zhì)工程技術(shù)。(2)由于目的基因的兩端的堿基序列分別是CCGG、CTAG,所以應用XmaⅠ和Bgl

Ⅱ兩種限制酶切開質(zhì)粒pCLY11，才能實現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的高效連接，重組質(zhì)粒中neor基因的作用是作為標記基因，根據(jù)標記基因的作用實現(xiàn)對成功導入重組pCLY11的細菌進行篩選。(3)將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌時，一般先用Ca2+處理大腸桿菌，其目的是使大腸桿菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，提高轉(zhuǎn)化效率。(4)篩選和鑒定含有重組質(zhì)粒的受體細胞，需要在培養(yǎng)液中添加新霉素，因為pCLY11質(zhì)粒中含有新霉素抗性基因，能在其上生長的是具有新霉素抗性的大腸桿菌，對于有新霉素抗性的大腸桿菌，同時還可以根據(jù)mlacZ基因的表達情況，選擇白色菌落的大腸桿菌，這是因為在構(gòu)建基因表達載體時破壞了mlacZ，導致表達產(chǎn)物使細胞呈白色，即在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細胞并非都是目的菌株，需選擇呈白色的菌落，進一步培養(yǎng)、

檢測和鑒定。4．(科學探究、社會責任)糖尿病是危害人類健康的嚴重疾病之一，注射胰島素是目前治療糖尿病最為有效的途徑和手段，如何生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)而不昂貴的人胰島素，是當下醫(yī)療界和制藥界急需攻克的科學難題。下圖為利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人胰島素的操作過程示意圖，請回答：(1)在基因表達載體中，__________的作用是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，并驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2