凝血酶響應(yīng)性改性表面涂層的制備及性能研究分析 材料學(xué)專業(yè)

目錄摘要 1Abstract 2第一章前言 41.1生物材料表面誘導(dǎo)的血栓形成 41.1.1材料表面誘發(fā)血栓 41.1.2纖溶過程 41.2表面改性策略 51.2.1生物惰性表面 51.2.2生物活性表面 61.2.3促內(nèi)皮化表面 71.2.4血栓應(yīng)激性抗血栓策略 81.3課題提出 91.3.1研究目的及意義 91.3.2研究?jī)?nèi)容及方案 10第二章實(shí)驗(yàn)部分 112.1實(shí)驗(yàn)材料 112.1.1試劑與藥品 112.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備 122.2實(shí)驗(yàn)過程 122.2.1肝素-聚賴氨酸納米顆粒的制備與表征 122.2.2硅片表面涂覆多巴胺 132.2.3表面負(fù)載兩種納米顆粒 142.2.4混合納米顆粒改性表面的表征 142.2.5硅改性表面的溶栓測(cè)試 152.2.6改性表面內(nèi)皮細(xì)胞增殖與黏附實(shí)驗(yàn) 15第三章結(jié)論與分析 163.1肝素-聚賴氨酸納米顆粒（HPs）的制備及兩種納米顆粒的粒徑測(cè)試 163.2納米顆粒改性表面的表征 163.2.1納米顆粒改性表面浸潤(rùn)性 163.2.2凝血時(shí)間測(cè)試 173.3凝血酶響應(yīng)性酶活性測(cè)試 183.4材料表面內(nèi)皮化實(shí)驗(yàn) 19結(jié)論 21參考文獻(xiàn) 22致謝 24摘要血液接觸材料，在臨床醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，如冠狀動(dòng)脈支架，心臟瓣膜，血液透析器，心肺旁路系統(tǒng)等。異體材料的植入會(huì)不可避免地導(dǎo)致血栓的形成，這是血液接觸裝置植入失敗的主要原因，因此提高生物材料的血液相容性顯得極其重要。目前已經(jīng)開發(fā)了一系列用于提高血液相容性的生物材料改性表面技術(shù)，包括生物惰性表面、生物活性表面和促內(nèi)皮化表面。在材料表面引入具有抗凝/抗血栓活性物質(zhì)是最常用的抗血栓改性策略，然而，在復(fù)雜的血液環(huán)境中，抗凝/抗血栓物質(zhì)的活性往往無法有效維持，而且在正常的血液環(huán)境中持續(xù)激活抗凝/抗血栓機(jī)制，則存在導(dǎo)致凝血功能紊亂的潛在風(fēng)險(xiǎn)。血管內(nèi)皮層是已知的唯一真正意義上的抗凝血表面，但促進(jìn)材料表面的內(nèi)皮化往往需要較長(zhǎng)時(shí)間。一種理想的抗血栓材料表面，應(yīng)該能夠在應(yīng)用早期的正常血液環(huán)境中維持一定的生物惰性，抵御血液物質(zhì)與表面的非特異性相互作用，而在凝血反應(yīng)發(fā)生時(shí)，及時(shí)啟動(dòng)抗凝血/抗血栓活性功能，阻斷血栓形成的途徑。最后，在材料應(yīng)用的過程中，表面不斷形成內(nèi)皮，從而滿足長(zhǎng)期應(yīng)用中的血液相容性需求。為了在材料表面實(shí)現(xiàn)上述理想的抗血栓過程，本論文的研究?jī)?nèi)容主要是將具有血栓應(yīng)激性纖溶功能的t-PA納米膠囊和與具備抗凝血與促內(nèi)皮化性質(zhì)的肝素-聚賴氨酸納米膠囊相結(jié)合，共同接枝到被多巴胺包被的材料表面上，制備基于凝血酶響應(yīng)性的多功能改性表面涂層。如此修飾的表面除了具備上述凝血酶響應(yīng)性纖溶活性以外，在肝素組分的作用下，還能夠有效延長(zhǎng)血栓形成時(shí)間，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)。該涂層有望在實(shí)際應(yīng)用中滿足材料與血液接觸不同階段的不同抗血栓需求。關(guān)鍵詞：抗血栓，纖溶，促內(nèi)皮化，t-PA，肝素作者：譚勇指導(dǎo)教師：李丹副教授AbstractBloodcontactmaterialshavebeenwidelyusedinclinicalmedicineandbiotechnology,suchascoronarystents,heartvalves,hemodialyzers,cardiopulmonarybypasssystemsandsoon.Implantationofforeignmaterialswillinevitablyleadtotheformationofthrombus,whichisthemainreasonforthefailureofbloodcontactdeviceimplantation.Therefore,itisextremelyimportanttoimprovethebloodcompatibilityofbiomaterials.Aseriesofbiomaterialmodifiedsurfacetechnologiesforimprovingbloodcompatibilityhavebeendeveloped,includingbio-inertsurfaces,bioactivesurfacesandEndothelializedsurface.Theintroductionofanticoagulant/antithromboticactivesonthesurfaceofthematerialisthemostcommonlyusedantithromboticmodificationstrategy,However,inacomplexbloodenvironment,theanticoagulant/antithromboticactivityisoftennotmaintainedeffectively,andthecontinuousactivationofanticoagulant/antithromboticmechanismsinthenormalbloodenvironmentpresentsthepotentialriskofcoagulationdisorders.Thevascularendotheliallayeristheonlytrulyknownanticoagulantsurface,butitoftentakesalongtimetopromotetheendothelializationofthematerialsurface.Anidealanti-thromboticmaterialsurfaceshouldbeabletomaintainacertaindegreeofbiologicalinertiaintheapplicationofearlynormalbloodconditionstoresistnon-specificinteractionsbetweenbloodsubstancesandsurfaces.Whenthecoagulationreactionoccurs,theanticoagulant/antithromboticactivityisactivatedintimetoblockthethrombosispathway.Finally,theendotheliumiscontinuouslyformedduringtheapplicationofthematerialtomeetthebloodcompatibilityrequirementsinlong-termapplications.Inordertorealizetheabove-mentionedidealantithromboticprocessonthesurfaceofthematerial,Themaincontentofthispaperistocombinet-PAnanocapsuleswiththrombusresponsivenessandfibrinolyticfunctionandheparin-polylysinenanocapsuleswithanticoagulantandendothelializationproperties.Theyareco-graftedontothesurfaceofthedopamine-coatedmaterialtoprepareamultifunctionalmodifiedsurfacecoatingbasedonthrombinresponsiveness.Themodifiedsurfacenotonlypossessestheabove-mentionedthrombin-responsivefibrinolyticactivity,butalsocaneffectivelyprolongthethrombusformationtimeandpromotetheadhesionandgrowthofendothelialcellsundertheactionoftheheparincomponent.Thecoatingisexpectedtomeetdifferentanti-thromboticrequirementsatdifferentstagesofcontactbetweenthematerialandbloodinpracticalapplications.Keywords:Antithrombotic,Fibrinolysis,Endothelialization,t-PA,HeparinWrittenbyYongTanSupervisedbyViceprof.DanLi第一章前言1.1生物材料表面誘導(dǎo)的血栓形成1.1.1材料表面誘發(fā)血栓與血液直接接觸的合成材料表面的凝血和血栓的形成引起了一系列嚴(yán)重的問題，包括人造器官、心血管系統(tǒng)植入體和體外血液接觸醫(yī)療器械的失敗[1]。例如，血栓問題往往會(huì)導(dǎo)致直徑小于6毫米血管接枝的堵塞[2]、靜脈導(dǎo)管的封閉[3]以及心臟輔助器件功能的喪失[4]等。而且，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，異體植入材料表面引發(fā)的血栓是無法完全避免的，所以，材料抗血栓改性表面一直是血液接觸材料領(lǐng)域備受關(guān)注的課題。了解血栓，首先要了解凝血過程。即血液凝固，是流動(dòng)狀血液變?yōu)槟z狀血液的過程，它是止血過程中的重要部分。凝血過程指的是一系列凝血因子經(jīng)過階梯性酶促反應(yīng)，生成凝血酶，最終形成纖維蛋白凝塊的過程。此過程通常包括兩種凝血途徑：一種為內(nèi)源性凝血途徑，主要由接觸相凝血因子XII在材料表面的吸附及激活引發(fā)；另一種為外源性凝血途徑，主要由受損組織釋放的因子誘發(fā)。兩者的主要區(qū)別在于啟動(dòng)方式和參與的凝血因子的不同。但這兩種方式并不對(duì)立，而是相互聯(lián)系的。這兩種途徑在凝血因子X激活后，會(huì)進(jìn)入共同的凝血途徑，最終導(dǎo)致凝血酶的生成以及纖維蛋白的形成[5]。凝血和抗凝是機(jī)體凝血系統(tǒng)的兩個(gè)方面，兩者保持動(dòng)態(tài)平衡，使得機(jī)體的血流系統(tǒng)得以正常運(yùn)作。抗凝系統(tǒng)的主要方式是體液抗凝和細(xì)胞抗凝，其中，體液抗凝是指體液中的抗凝因子對(duì)凝血因子活性的調(diào)控和抑制，包含抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）[6]、蛋白C系統(tǒng)[7]、肝素等。1.1.2纖溶過程此外，與凝血過程一樣，纖溶也是機(jī)體的一種重要的保護(hù)性生理反應(yīng)。正常的纖溶過程中涉及到纖維蛋白形成（凝血）和降解（纖溶），凝血過程是血液系統(tǒng)對(duì)血管損傷的生理響應(yīng)，纖溶過程則是以降解蛋白的方式來移除纖維蛋白，保證血管的通暢。其中，降解過程涉及到一系列蛋白質(zhì)，主要包括血纖維蛋白溶酶原（Plg）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、血纖維蛋白溶酶（plasmin，pl）等。纖溶過程中的核心蛋白質(zhì)是Plg，五個(gè)名為“kringle”的線圈形三級(jí)結(jié)構(gòu)包含在它的結(jié)構(gòu)中。其中K1和K4的內(nèi)環(huán)中都存在一個(gè)賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)（LBS），對(duì)于羧基端賴氨酸具有特異性親和力[8]。而研究發(fā)現(xiàn)，在t-PA的分子結(jié)構(gòu)中也具有兩個(gè)kringle片段，其K2也包含LBS，同樣可以和暴露在降解的纖維蛋白表面的賴氨酸殘基相結(jié)合。纖溶過程的降解機(jī)理是：Plg通過與纖維蛋白的賴氨酸殘基作用，與同樣與纖維蛋白賴氨酸殘基結(jié)合的t-PA形成三元復(fù)合物。在t-PA激活劑的作用下，Plg位于Arg561-Val562處的肽鍵會(huì)斷裂，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閜l。pl裂解纖維蛋白凝塊，使其暴露出更多的賴氨酸殘基，進(jìn)而聚集更多纖維蛋白溶酶原（Plg），加速纖溶過程[9]。生物血液接觸材料植入機(jī)體體內(nèi)時(shí)，最先引發(fā)的反應(yīng)是血漿蛋白質(zhì)在其表面的快速吸附[10]，隨后所形成的蛋白質(zhì)吸附層進(jìn)一步誘導(dǎo)血小板的粘附和激活、補(bǔ)體激活和白細(xì)胞的反應(yīng)等，最終導(dǎo)致血栓的形成。1.2表面改性策略1.2.1生物惰性表面血漿蛋白質(zhì)在材料表面的吸附是血栓形成過程的最初反應(yīng)。因此，可以通過在材料表面修飾生物惰性聚合物來提高材料的血液相容性。當(dāng)前常用的生物惰性材料大致包含兩類：親水性聚合物與兩性離子聚合物。接枝親水性聚合物的方法，相對(duì)來說比較靈活、易于調(diào)控而且不會(huì)損傷本體的機(jī)械性能，故而應(yīng)用廣泛。其中，最常用的親水性聚合物是聚乙二醇（PEG）[11]，材料表面修飾PEG的方式主要包括物理吸附法、自組裝單分子層法（SAM）[12]、共價(jià)接枝法（graftingto）[13]以及表面引發(fā)聚合（SI-graftingfrom）等[14]。此外，其它親水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯（PHEMA）等也被廣泛應(yīng)用。接枝兩性離子聚合物的方法，相對(duì)于接枝親水性聚合物來說，在生理?xiàng)l件下不易被氧化，抗蛋白質(zhì)吸附的能力不會(huì)降低，且有更好的生物相容性[15]，故而也被廣泛關(guān)注。其中磷酰膽堿（PC）類聚合物是最早被用于材料排斥蛋白質(zhì)吸附性能研究的兩性離子聚合物。1.2.2生物活性表面雖然生物惰性表面有很多優(yōu)點(diǎn)，但是缺陷也十分明顯。研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際的生理?xiàng)l件下，即使它們的表面只有7ng/cm2的纖維蛋白原（Fg）吸附也可能誘發(fā)大范圍內(nèi)的血小板粘附[16]，從而導(dǎo)致血栓的形成。所以進(jìn)一步提出了在材料表面接枝具有特定功能的生物活性物質(zhì)的方法，以期能干擾或是阻斷凝血反應(yīng)的進(jìn)程。1.2.2.1凝血酶抑制劑修飾表面研究發(fā)現(xiàn)，一些凝血酶抑制劑可以通過與凝血酶形成不可逆的復(fù)合物來抑制凝血酶的活性。常用的凝血酶抑制劑是水蛭素類抑制劑，如水蛭素、比伐盧定等。此外，一些人工合成的凝血酶抑制劑如3-三氟甲基-苯磺酰-精氨酸以及阿加曲班修飾的表面均表現(xiàn)出凝血酶抑制活性，同時(shí)降低了血小板的粘附與激活。肝素是凝血酶類抑制劑修飾表面最常用的。肝素是由兩種多糖交替連接而成的多聚體，是最常用的抗凝血藥物之一。它能夠通過激活血液中的抗凝血酶III（ATIII）來間接抑制如XIa，IXa，Xa以及凝血酶等凝血因子（其中Xa與凝血酶是凝血反應(yīng)中最重要的因子），從而阻斷凝血進(jìn)程。此外，肝素還具有抗病毒、抗癌活性、調(diào)控血管生長(zhǎng)以及抑制補(bǔ)體激活的功能[17]。所以說，材料表面肝素化是制備抗凝血材料表面應(yīng)用最廣泛的方法。1.2.2.2抗血小板聚集表面由于血小板是凝血過程中主要的凝血因子，所以可以通過一些血小板抑制劑來對(duì)材料表面進(jìn)行改性來達(dá)到抗血栓形成的功能。其中，應(yīng)用廣泛的血小板抑制劑是雙嘧啶莫，它可以通過滅活制磷酸二酯酶來抑制血小板的活性。Aldenhoff等將雙嘧達(dá)莫共價(jià)修飾在聚氨酯表面，不僅極大降低了血小板的粘附而且有利于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在表面的形成[18]。1.2.2.3纖溶分子改性表面在纖溶機(jī)理的基礎(chǔ)上，提出了一種纖溶改性表面，它使得纖維蛋白在材料表面形成時(shí)就能被立刻溶解掉。是故，為了模擬纖溶過程，首先材料表面需要具備吸附Plg的能力。其次，Plg在激活劑t-PA的作用下才能發(fā)揮功能，故需要t-PA的存在。研究發(fā)現(xiàn)，Plg的K1和K4的內(nèi)環(huán)中各含有一個(gè)對(duì)羧基端賴氨酸具有特異性親和力的位點(diǎn)，稱為賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)（LBS），而t-PA的K2結(jié)構(gòu)也含有一個(gè)LBS。所以賴氨酸修飾的表面理應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)纖溶過程[19]。1.2.3促內(nèi)皮化表面盡管前文所述的表面在溶解凝塊方面十分有效，但它們?cè)诳寡ǖ男纬缮喜⒉皇掷硐?。而?nèi)皮化表面是唯一已知的在各個(gè)方面與血液相容的表面[20]，所以表面內(nèi)皮化已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于制作血液相容性改性表面。目前材料表面內(nèi)皮化的方法主要分兩類：體外接種內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)原位內(nèi)皮化。體外接種內(nèi)皮細(xì)胞是指將內(nèi)皮細(xì)胞在體外擴(kuò)增后種植在植入的材料表面上，但是此方法材料表面內(nèi)皮細(xì)胞的覆蓋率較低，而且存在生理穩(wěn)定性差等問題，所以應(yīng)用有限。體內(nèi)原位內(nèi)皮化是指將與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的黏附因子和生長(zhǎng)因子等植入在材料表面上的方法。Yuan等將促內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子REDV共價(jià)固定到兩性離子聚合物材料表面，將兩性離子聚合物抗污性質(zhì)與REDV對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合在一起，在排斥蛋白非特異性吸附的同時(shí)促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞在表面的粘附，還檢測(cè)了到此表面對(duì)平滑肌細(xì)胞的抑制能力[21]。1.2.4血栓應(yīng)激性抗血栓策略血栓形成的過程伴隨著一系列凝血因子和抗凝因子的激活，導(dǎo)致局部血液環(huán)境中的各項(xiàng)生理指標(biāo)均不同于正常血液中。隨著凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)，各項(xiàng)凝血途徑協(xié)同作用，由于最終匯入同一凝血因子凝血酶中[22]。凝血酶在體內(nèi)的產(chǎn)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，在血栓形成過程中局部凝血酶濃度會(huì)發(fā)生快速的改變。在體內(nèi)，凝血過程涉及到細(xì)胞表面性質(zhì)的改變以及可溶酶原的連鎖反應(yīng)。在凝血初期，組織因子的激活會(huì)誘發(fā)少量凝血酶的產(chǎn)生，而當(dāng)活化血小板表面暴露出磷脂酰絲氨酸和促凝血酶結(jié)合位點(diǎn)后，活化血小板會(huì)在短時(shí)間內(nèi)釋放出大量凝血酶，進(jìn)而催化纖維蛋白原激活和聚集，形成穩(wěn)定的栓塊。在整個(gè)凝血系統(tǒng)激活的過程中，局部凝血酶的含量可以從1nM上升到500nM以上。因此，凝血酶含量的快速上升可以被認(rèn)為是血栓形成的標(biāo)志性事件之一。在凝血酶響應(yīng)性體系中，作為信號(hào)因子的凝血酶可以調(diào)控體系的抗凝-溶栓功能的開啟和關(guān)閉。當(dāng)機(jī)體微環(huán)境中存在大量凝血酶時(shí)，體系中對(duì)凝血酶特異性響應(yīng)的元件會(huì)感受信號(hào)刺激，促使體系發(fā)生相應(yīng)變化，釋放抗凝溶栓藥物，進(jìn)而開始溶解初生血栓。此過程中，機(jī)體微環(huán)境中凝血酶的活性受到抑制，其含量持續(xù)減少，體系中的信號(hào)刺激也相應(yīng)減弱，抗凝溶栓藥物的釋放量受控于體系根據(jù)上游信號(hào)強(qiáng)度的自動(dòng)調(diào)節(jié)，直至使微環(huán)境中的凝血酶水平回到正常生理水平。體系接受到機(jī)體的這一信息反饋后，能及時(shí)關(guān)閉生物功能，停止釋放抗血栓藥物。隨后未釋放的抗血栓藥物貯存在在機(jī)體中并保持安全穩(wěn)定存在，并且當(dāng)微環(huán)境中凝血酶水平亢進(jìn)時(shí)又能重新釋放，以此來為機(jī)體提供長(zhǎng)期的、持久的、可控的抗凝保護(hù)，直至體系被完全降解。1.3課題提出1.3.1研究目的及意義雖然惰性抗血栓、活性抗血栓和促內(nèi)皮化表面改性方面都各自有些研究進(jìn)展，甚至也有些表面多功能結(jié)合的研究，但到目前為止，尚未有研究在表面涂層中考慮到血栓應(yīng)激性的設(shè)計(jì)。這一設(shè)計(jì)取決于對(duì)血栓微環(huán)境變化的有效利用。凝血反應(yīng)過程中伴隨著多種特征性凝血因子的生成，其中凝血酶作為外源性和內(nèi)源性凝血途徑的共同產(chǎn)物以及產(chǎn)生纖維蛋白的直接作用酶而備受關(guān)注。一些研究利用凝血酶底物多肽或凝血酶的核酸適配體所為交聯(lián)劑構(gòu)建藥物載體，實(shí)現(xiàn)藥物在血栓部位的定點(diǎn)釋放。組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）是負(fù)責(zé)纖維蛋白降解的纖維蛋白溶解系統(tǒng)的生理激活劑，被用作抗血栓形成劑。由Li等人制備了一種以t-PA為核心的納米膠囊，使用凝血酶降解性水凝膠作為殼體，水凝膠殼層可被凝血酶降解并釋放出具有完全活性的t-PA。用聚多巴胺（PDA）層作為粘合劑將t-PANCs固定在材料表面上。所得表面用防垢劑谷胱甘肽（GSH）處理，以防止與血液/血漿組分的進(jìn)一步相互作用。t-PANCs/GSH包被的表面在正常的血漿環(huán)境中是穩(wěn)定的并保持惰性，同時(shí)在凝血酶存在時(shí)釋放t-PA和促進(jìn)纖維蛋白溶解。而作為一種理想的抗血栓材料，在正常血液環(huán)境中應(yīng)維持一定的生物惰性，阻止血液與材料表面的非特異性相互作用，當(dāng)凝血反應(yīng)發(fā)生時(shí)，又能及時(shí)啟動(dòng)抗凝血/抗血栓活性功能，阻斷血栓形成。最后，在材料應(yīng)用的過程中，表面不斷形成內(nèi)皮，從而實(shí)現(xiàn)材料表面的長(zhǎng)期內(nèi)皮化。受這些應(yīng)用的啟發(fā)，本論文將凝血酶響應(yīng)性藥物遞送基元用于構(gòu)建表面涂層，從而實(shí)現(xiàn)血栓應(yīng)激性涂層的構(gòu)建。再通過在涂層中進(jìn)一步引入惰性、抗凝血和促內(nèi)皮化等組分，期望通過仿生血管內(nèi)皮功能，使材料在實(shí)際應(yīng)用中滿足其與血液接觸不同階段的不同抗血栓需求。1.3.2研究?jī)?nèi)容及方案本文主要內(nèi)容為在多巴胺包被的生物材料表面上固定肝素和基于凝血酶降解組織纖溶酶原激活物（t-PA）納米膠囊，通過肝素實(shí)現(xiàn)抗凝和內(nèi)皮化與納米膠囊的凝血酶響應(yīng)性釋放t-PA來溶解血栓。第二章實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1試劑與藥品本實(shí)驗(yàn)所使用的主要化學(xué)及生物試劑見表1-1。實(shí)驗(yàn)用水都經(jīng)過Millipore系統(tǒng)純化，實(shí)驗(yàn)過程所用到的的氮?dú)鉃楦呒兊?9.999%）。所用到的其他常用藥品溶劑均為分析純。表1-1實(shí)驗(yàn)試劑與藥品藥品名稱及其縮寫生產(chǎn)廠家纖維蛋白溶酶原（Plg）吉爾生化（上海）有限公司組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）Genentech,SanFrancisco,CAt-PA發(fā)色底物S-2288吉爾生化（上海）有限公司凝血酶Sigma-Aldrich氯化鈉(NaCl)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉(NaOH)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司氯化鈣（CaCl2）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司碳酸氫鈉（NaHCO3）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司多巴胺鹽酸鹽Sigma-Aldrich聚賴氨酸上海吉爾生化有限公司磷酸二氫鈉(NaH2PO4)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司磷酸氫二鈉(Na2HPO4)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司四甲基乙二胺（TEMED）上海生工生物工程股份有限公司水蛭素Sigma-Aldrich肝素鈉Biosharp實(shí)驗(yàn)中涉及到的相關(guān)溶液配制：（1）磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）的配制：將0.39g磷酸二氫鈉（NaH2PO4），3.33g十二水和磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）以及8.5g氯化鈉（NaCl）溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)溶液pH至7.4，用1L的容量瓶定容，于4oC存儲(chǔ)備用。（2）碳酸氫鈉溶液的配制：將0.84g的碳酸氫鈉固體溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)溶液pH至8.5，用1L的容量瓶定容，配制成10mM的碳酸氫鈉溶液，于4oC存儲(chǔ)備用。2.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備本實(shí)驗(yàn)所采用的主要實(shí)驗(yàn)儀器及其生產(chǎn)廠家見表1-2。表1-2本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備儀器與材料生產(chǎn)廠家電子分析天平上海恒平科學(xué)儀器有限公司超純水儀美國Millipore公司透射電子顯微鏡（TEM）上海索萊寶生物科技公司微量移液器Calbiochem恒溫加熱磁力攪拌器武漢科爾儀器設(shè)備有限公司pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司多功能酶標(biāo)儀賽默飛世爾科技有限公司水接觸角儀美國科諾工業(yè)有限公司冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司紫外-可見分光光度計(jì)上海欣茂儀器有限公司透析卡ThermoFisherScientific2.2實(shí)驗(yàn)過程2.2.1肝素-聚賴氨酸納米顆粒的制備與表征2.2.1.1肝素-聚賴氨酸納米顆粒的制備配制濃度為0.5mg/mL的聚賴氨酸溶液和7mg/mL的肝素溶液。在室溫超聲條件下，將濃度為7mg/mL的肝素溶液等體積逐滴加入到0.5mg/mL的聚賴氨酸溶液中，超聲5min，將上述納米顆粒溶液加入EP管中，15000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，吸出上清液，用PBS清洗離心產(chǎn)物兩次后加入PBS重懸，超聲混勻。2.2.1.2肝素-聚賴氨酸納米顆粒與t-PA納米膠囊的粒徑分布測(cè)試將制備的肝素納米顆粒溶液通過0.2μm的微孔濾膜以除去雜質(zhì)顆粒，隨后將樣品放置于動(dòng)態(tài)光散射儀中，在25oC下進(jìn)行粒徑測(cè)試。每次測(cè)量重復(fù)三次。通過DigitalMicrograph3.7軟件對(duì)透射電子顯微鏡（TEM）中的t-PA納米膠囊尺寸進(jìn)行測(cè)量并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。2.2.2硅片表面涂覆多巴胺2.2.2.1硅片清洗將硅片浸入含有氨水和雙氧水的水溶液中（去離子水/氨水/雙氧水=5/1/1），于75oC下浸泡10分鐘，最后用大量去離子水和乙醇清洗并用氮?dú)獯蹈伞?.2.2.2涂覆多巴胺用pH為8.5的10mMTris-HCl配制濃度為2mg/mL的多巴胺溶液，將硅片垂直浸沒于其中，室溫下靜置反應(yīng)6小時(shí)。用超純水反復(fù)潤(rùn)洗聚多巴胺改性表面并用微小氮?dú)饬鞔蹈伞?.2.3表面負(fù)載兩種納米顆粒將t-PA納米膠囊與肝素納米膠囊HPs等體積混合，將涂有多巴胺的硅片浸沒到上述混合粒溶液中，室溫下反應(yīng)12h。使用PBS清洗三次，每次10min。再用氮?dú)獯蹈伞?.2.4混合納米顆粒改性表面的表征2.2.4.1水接觸角測(cè)試表面親水性通過測(cè)量材料表面的水接觸角（WCA）進(jìn)行表征，采用接觸角測(cè)量?jī)x，測(cè)量材料表面的水接觸角采用懸滴法，采用θ/2法分析接觸角，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，每個(gè)樣品都測(cè)試其中心部位。對(duì)于同種樣品分別測(cè)量三個(gè)平行樣品，最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.2.4.2凝血時(shí)間測(cè)試由于凝血過程是一系列凝血因子激活反應(yīng)的復(fù)雜過程，肝素作為臨床常用的抗凝劑，可以間接抑制凝血酶活性，從而延緩纖維蛋白凝塊的形成速度，達(dá)到抗凝的目的，因此采用血漿復(fù)鈣化方法測(cè)試肝素/聚賴氨酸納米顆粒（HPs）改性表面的抗凝血性質(zhì)。其原理是在浸泡有改性材料的血漿中加入適量鈣離子引發(fā)凝血，檢測(cè)從鈣離子加入到血漿凝固所需的時(shí)間。具體操作步驟如下：在37oC下緩慢解凍血漿，將各樣品垂直放置在96孔板中，向每孔加入150μL成人血漿（PPP），孵育到37oC后迅速加入100μL0.025M的氯化鈣溶液，405nm下掃描，通過達(dá)到平臺(tái)所需的時(shí)間來計(jì)算其血漿復(fù)鈣化時(shí)間。2.2.5硅改性表面的溶栓測(cè)試通過纖維蛋白原-凝血酶法在體外模擬血栓生成，對(duì)改性表面的凝血酶響應(yīng)性纖溶活性進(jìn)行測(cè)試。具體步驟如下：將改性硅表面浸沒在含有纖維蛋白溶酶原（plg）的10U/mL凝血酶溶液中降解5小時(shí)后，向上述降解液中加入100μL纖維蛋白原溶液（10mg/mL），用多功能酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)405nm下溶液吸光度的變化，實(shí)驗(yàn)在37°C下進(jìn)行120分鐘，每30秒讀取一次吸光值。2.2.6改性表面內(nèi)皮細(xì)胞增殖與黏附實(shí)驗(yàn)將酒精消毒后的各樣品放入48孔板中，以15000cells/cm2的密度在其表面種植ECs，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48h后，樣品用PBS清洗2遍，在室溫條件下用4%多聚甲醛溶液對(duì)其表面的細(xì)胞固定10min，無菌PBS清洗表面后加入0.1%TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜處理（5min）。加入Phalloidin-FITC對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色（避光反應(yīng)35min），再加入DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色（避光反應(yīng)10min）。利用倒置熒光顯微鏡觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并隨機(jī)挑選10張圖片，每個(gè)樣品表面的細(xì)胞數(shù)量利用Image-Pro軟件對(duì)其進(jìn)行計(jì)算。第三章結(jié)論與分析3.1肝素-聚賴氨酸納米顆粒（HPs）的制備及兩種納米顆粒的粒徑測(cè)試通過DLS對(duì)不同投料比下制備的肝素/聚賴氨酸納米顆粒粒徑進(jìn)行了測(cè)試。其結(jié)果如圖3-1所示，t-PA納米膠囊粒徑主要分布在200nm到300nm左右。為了最大限度減小兩種納米顆粒之間的競(jìng)爭(zhēng)吸附和相對(duì)數(shù)量難以控制的問題，我們選擇粒徑約與t-PA納米膠囊一致，即粒徑為300nm的肝素-聚賴氨酸納米膠囊。圖3-1（a）t-PA納米膠囊（t-PANCs）粒徑分布；（b）肝素-賴氨酸納米粒子(HPs)的粒徑3.2納米顆粒改性表面的表征3.2.1納米顆粒改性表面浸潤(rùn)性材料表面親水性的差異直接影響著蛋白質(zhì)和細(xì)胞在表面的黏附行為，進(jìn)而影響材料的生物相容性。生物分子在材料表面的固定通常會(huì)引起材料表面親疏水性的變化。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了固定納米顆粒的一系列樣品表面的水接觸角，可以通過接觸角的變化來反映表面親水性的變化。測(cè)試結(jié)果如圖3-2-1所示。水接觸角測(cè)試結(jié)果顯示，聚多巴胺在硅片表面的沉積使得材料表面水接觸角有較大的增加，這主要是因?yàn)槎喟桶贩肿又械谋江h(huán)結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的疏水性，該表面易在血液中引發(fā)蛋白質(zhì)和血細(xì)胞的黏附，不利于生物材料的使用。t-PA納米膠囊聚多巴胺表面負(fù)載后使親水性有所提高，可能是由于納米膠囊表面具有親水性的丙烯酰胺基聚合物鏈。由于肝素和多聚賴氨酸分子中均含有大量的親水基團(tuán)，使得HPs沉積表面也具有一定親水性。兩種親水行納米顆粒的共混沉積使得混合納米顆粒改性表面的水接觸角有了進(jìn)一步的降低。以上結(jié)果表明本工作中的納米粒子共混表面對(duì)于提高材料生物相容性具有一定幫助。圖3-2-1樣品改性前后水接觸角變化3.2.2凝血時(shí)間測(cè)試由于在凝血酶響應(yīng)性纖溶表面的基礎(chǔ)上引入了肝素分子，因而有望使材料達(dá)到通過抑制凝血酶活性延長(zhǎng)凝血時(shí)間的效果。血漿復(fù)鈣化時(shí)間（PRT）實(shí)驗(yàn)被用于在體外評(píng)價(jià)內(nèi)源性凝血途徑激活作用，PRT是在含有檸檬酸鹽抗凝血?jiǎng)┑难獫{中加入鈣離子使其形成血栓所需要的時(shí)間。當(dāng)材料接觸到血漿后，會(huì)激活內(nèi)源性凝血途徑，較長(zhǎng)的PRT材料表面具有較好的血液相容性。如圖3-2-2所示，Si-PDA-HPs表面由于肝素分子的存在，抑制了凝血因子活性，使血漿復(fù)鈣化時(shí)間相較于Si-PDA表面延長(zhǎng)了約一倍，而混合納米顆粒改性表面Si-PDA-NCs/HPs，由于兩種納米顆粒之間不可避免的競(jìng)爭(zhēng)作用，使得表面肝素含量略有減少，從而影響了凝血時(shí)間的延長(zhǎng)，但改性表面相較于多巴胺表面凝血時(shí)間仍延長(zhǎng)了20s以上。從上述結(jié)果可以看出HPs可以成功負(fù)載于聚多巴胺層，并且表面肝素分子仍然能發(fā)揮出抗凝血活性。圖3-2-2不同改性表面的血漿復(fù)鈣化時(shí)間3.3凝血酶響應(yīng)性酶活性測(cè)試采用t-PA的顯色底物S-2288測(cè)定Si-PDA-NCs/HPs表面在凝血酶作用下的的t-PA活性隨時(shí)間的變化情況，測(cè)試結(jié)果如圖3-3所示。結(jié)果顯示當(dāng)材料樣品浸泡在含有凝血酶的血漿中時(shí)，降解液中t-PA的酶活性（溶液吸光度變化率）隨著時(shí)間的推移呈線性增長(zhǎng)。而在無凝血酶存在的條件下，5小時(shí)后表面并未表現(xiàn)出活性。以上結(jié)果證明該表面上的t-PA納米膠囊可在凝血酶的作用下降解并使t-PA恢復(fù)活性，而在正常環(huán)境中保持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)也證明HPs的加入并未影響表面t-PANCs的功能發(fā)揮。圖3-3有凝血酶存在和無凝血酶存在條件下的Si-PDA-NCs/HPs表面t-PA活性3.4材料表面內(nèi)皮化實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮化表面是真正意義上的抗血栓表面，最接近于血管內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)，因此通過促進(jìn)材料表面內(nèi)皮化達(dá)到抗血栓效果，已經(jīng)成為目前血液接觸材料表面改性研究領(lǐng)域的熱門話題，也是解決血液接觸器件引發(fā)血栓行之有效的手段。而肝素分子結(jié)構(gòu)中具有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的結(jié)合位點(diǎn)，我們對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在肝素-聚賴氨酸納米顆粒（HPs）改性表面上的黏附和增殖情況進(jìn)行了考察。結(jié)果如圖3-4-1和圖3-4-2所示，由于聚多巴胺表面對(duì)細(xì)胞和蛋白均具有良好的黏附效果，因此該表面在培養(yǎng)48h后，表面細(xì)胞數(shù)量較多，鋪展情況良好。而t-PA納米膠囊因具有一定的排斥蛋白質(zhì)吸附作用，表面細(xì)胞黏附量較少，48h后的細(xì)胞密度較低。而肝素-聚賴氨酸納米顆粒的引入（Si-PDA-HPs、Si-PDA-NCs/HPs）賦予了材料表面良好的促內(nèi)皮化效果，兩種表面在48h后均達(dá)到了較高的細(xì)胞密度和良好的細(xì)胞鋪展形態(tài)，這也說明混合納米顆粒表面上的t-PA納米膠囊并未對(duì)肝素分子的促內(nèi)皮化功能發(fā)揮產(chǎn)生太大影響。圖3-4-1ECs在不同表面培養(yǎng)48h后的細(xì)胞形貌圖3-4-2ECs在不同表面培養(yǎng)48h后的細(xì)胞密度結(jié)論血液接觸材料表面引入生物活性分子抗血栓是近年來的熱點(diǎn)問題，而且單功能改性表面已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)向多功能改性表面的研究。本文將凝血酶響應(yīng)性t-PA納米膠囊與肝素-聚賴氨酸納米顆粒（HPs）結(jié)合，分別測(cè)定了兩種納米顆粒的粒徑分布，結(jié)果表面表明通過調(diào)節(jié)制備條件，可以得到兩種粒徑相似的納米顆粒并將其負(fù)載于聚多巴胺表面。首先，水接觸角測(cè)試證明了兩種納米顆粒在硅片表面的成功修飾。酶活性測(cè)試結(jié)果顯示表面t-PA納米膠囊具有凝血酶響應(yīng)性酶活性。最后，凝血時(shí)間測(cè)試，材料表面內(nèi)皮化實(shí)驗(yàn)以及凝血酶響應(yīng)性酶活性測(cè)試表明了兩種生物活性分子的引入，并沒有干擾彼此執(zhí)行各自的功能。綜上所訴，本文提出的凝血酶響應(yīng)性多功能改性表面涂層兼有纖溶，抗凝和促內(nèi)皮化的特性，并且通過連續(xù)固定的策略避免了生物分子間的競(jìng)爭(zhēng)和相對(duì)數(shù)量不可控制的問題。參考文獻(xiàn)【1】M.B.Gorbet,M.V.Sefton,Biomaterials2004,25,5681.【2】KlinkertP,PostPN,BreslauPJ,vanBockeJH.EurJVascEndovascSurg,2004,27:357-262.【3】ChopraV,AnandS,KreinSL,ChenowethC,SaintS.AmJmed,2012,125:733-741.【4】LuscherTF,SteffelJ,EberliFR,JonerM,NakazawaG,TannerFC,VirmaniR.Circulation,2007,115:1051-1058.【5】GorbetMB,SeftonMV.Biomaterial-associatedthrombosis:rolesofcoagulationfactors,complement,plateletsandleukocytes[J].Biomaterials,2004,25(26):5681-5703.【6】HirshJ.Oralanticoagulantdrugs[J].NewEngl.J.Med.,1991,324(26):1865.【7】CookeE,LloydM,BowcockS,etal.Intravenouslignocaineinpreventionofdeepvenousthrombosisafterelectivehipsurgery[J].Lancet,1977,310(8042):797-799.【8】LiD,WangS,WuZ,etal.Anewt-PAreleasingconceptbasedonprotein-proteindisplacement[J].SoftMatter,2013,9(7):2321.【9】FischerB.Comparisonoffibrin-mediatedstimulationofplasminogenactivationbytissue-typeplasminogenactivator(t-PA)andfibrin-dependentenhancementofamidolyticactivityoft-PA[J].BloodCoagul.Fibrin.,1992,3(2):203-204.【10】VromanL,AdamsAL.Identificationofadsorbedproteinfilmsbyexposuretoantiseraandwatervapor[J].JournalofBiomedicalMaterialsResearch,1969,3(4):669-671.【11】Llanos,G.R.;Sefton,M.V.,ReviewDoespolyethyleneoxidepossessalowthrombogenicityJournalofBiomaterialsScience,PolymerEdition1993,4(4),381-400.【12】RoachP,FarrarD,PerryCC.Interpretationofproteinadsorption:surface-inducedconformationalchanges[J].J.Am.Chem.Soc.,2005,127(22):8168-8173.【13】Hamilton-BrownP,GengenbachT,GriesserHJ,etal.Endterminal,poly(et