2.1基因工程的基本操作程序課件-高二下學期生物人教版選擇性必修3

問題：你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉3.2基因工程的基本操作程序蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定【從社會中來】

基因工程的基本操作程序（四個步驟）目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。前提核心關(guān)鍵保證

在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。目的基因的篩選與獲取第一步目的基因

根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因篩選合適的目的基因

從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對比工具（如BLAST）等的應(yīng)用，更多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為科學家找到合適的目的基因提供更多機會和可能。實例：篩選

Bt基因作為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因。

明確了目的基因后，該如何獲得目的基因呢？思考：1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響目的基因的獲取方法3、利用PCR技術(shù)獲取和擴增cDNA文庫基因組文庫逆轉(zhuǎn)錄法化學合成法1、從基因文庫中獲取2、人工合成《金》P94基因比較小、核苷酸序列已知DNA合成儀PCR含義在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)PCR原理DNA⑦____________要求模板⑧________________原料酶耐高溫的⑨____________引物一段短單鏈核酸，能與目的基因的堿基序列互補配對PCR反應(yīng)過程變性當溫度上升到?______以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性當溫度下降到?______左右時，兩種引物通過堿基互補配對方式與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸當溫度上升到

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左右時，耐高溫的DNA聚合酶從引物

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端開始進行互補鏈的合成上′</結(jié)果：短時間內(nèi)大量擴增目的基因，在PCR擴增儀中自動完成的。完成后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定產(chǎn)物。半保留復(fù)制目的基因兩條鏈DNA聚合酶

dNTP脫下兩個磷酸基團即為脫氧核苷酸，為DNA復(fù)制提供原料，也能為形成磷酸二酯鍵提供能量。

Mg2+的緩沖溶液（激活DNA聚合酶、調(diào)節(jié)pH）用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA目的基因的獲取方法3、利用PCR技術(shù)獲取和擴增cDNA文庫基因組文庫逆轉(zhuǎn)錄法化學合成法1、從基因文庫中獲取2、人工合成反轉(zhuǎn)錄法：它是以目的基因的mRNA為模板，借助_______酶合成堿基互補的單鏈DNA，然后在________酶的作用下合成雙鏈DNA（cDNA）?；瘜W合成法：即依照某一蛋白質(zhì)的_______序列，推測出mRNA序列，然后按堿基互補配對原則，推測DNA的__________序列。逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合氨基酸脫氧核苷酸《金》P94基因比較小、核苷酸序列已知利用PCR獲取和擴增目的基因聚合酶鏈式反應(yīng)(

PolymeraseChainReaction)的縮寫。DNA半保留復(fù)制是一項在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分和反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。PCR

原理（PCR擴增儀/PCR儀）利用PCR獲取和擴增目的基因1.DNA分子復(fù)制發(fā)生在什么時間？2.DNA分子復(fù)制過程需要哪些條件?3.DNA分子復(fù)制過程有何特點?4.DNA分子復(fù)制的結(jié)果是什么？5.DNA分子準確復(fù)制的原因是什么？溫故知新：細胞內(nèi)DNA復(fù)制模板、原料、能量、酶等模板：DNA的兩條鏈間期原料：游離的脫氧核苷酸（A、T、G、C）能量：ATP酶：解旋酶、DNA聚合酶等半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制堿基互補配對原則DNA復(fù)制的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶（體外-高溫）打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種游離的脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸引物的實質(zhì)：dNTP（體外用耐高溫的DNA聚合酶）氫鍵用于PCR的引物是DNA單鏈；體內(nèi)DNA復(fù)制的引物是RNA單鏈DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA單鏈，只能將游離的脫氧核苷酸連接在一條核苷酸鏈的3’端。DNA合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸為什么需要引物?目的基因兩端的

短單鏈

核苷酸序列為什么需要2種引物?目的基因兩端的核苷酸序列不一樣確保DNA的兩條鏈同時被擴增3’5’5’5’5’3’3’①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補配對③引物長度不宜過短，防止引物隨機結(jié)合一.目的基因的篩選與獲取1．PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學本質(zhì)上是否相同？思考討論：2．PCR過程中需要加入兩種引物，原因是？3．兩種引物的要求？DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補配對③引物長度不宜過短，防止引物隨機結(jié)合PCR的條件：（1）DNA（目的基因）模板。（2）分別與兩條模板鏈相結(jié)合的2種引物。（3）四種脫氧核苷酸。（4）耐高溫的DNA聚合酶。（5）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）。調(diào)節(jié)PHdNTPdNTP既能為PCR提供原料,也能為形成磷酸二酯鍵提供能量。TaqDNA聚合酶P77相關(guān)信息

真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。PCR的反應(yīng)過程A．變性當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。待擴增的DNA片段高溫使氫鍵打開，不需要解旋酶。思考：變性的溫度與堿基種類有關(guān)嗎？GC含量越高，需要的溫度越高B．復(fù)性

溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。C．延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。如此重復(fù)循環(huán)多次。此后

延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板

變性、復(fù)性和延伸三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就復(fù)制成了2個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。結(jié)果共需要引物數(shù)量為

個。2n＋1－2思考3、獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離出目的基因？至少要三次循環(huán)。

完成后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定產(chǎn)物。反應(yīng)場所在PCR擴增儀中自動完成的。鑒定方法用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNAPCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項目細胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制DNA在高溫下變性解旋全部解旋后再復(fù)制場所主要在細胞核內(nèi)細胞外(主要在PCR擴