細(xì)胞生物學(xué)課件

張岸平教授細(xì)胞生物學(xué)MedicaimolecularbiologyCELLCYCLE第十二章細(xì)胞增殖是生命的基本特征，種族繁衍、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體修復(fù)等都離不開細(xì)胞增殖。初生嬰兒有1012個(gè)細(xì)胞，成人1014個(gè)，約200種類型。成人體內(nèi)每秒鐘有數(shù)百萬新細(xì)胞產(chǎn)生，以補(bǔ)償衰老和死亡的細(xì)胞。一個(gè)大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過地球的重量。細(xì)胞分裂的類型：無絲分裂(amitosis)又稱直接分裂，由Remark（1841）發(fā)現(xiàn)于雞胚血細(xì)胞，不涉及紡錘體形成及染色體變化。有絲分裂(mitosis)又稱為間接分裂，由Fleming(1882)年首次發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物，Strasburger(1880)發(fā)現(xiàn)于植物。減數(shù)分裂(meiosis）染色體復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次。一、無絲分裂的過程較簡(jiǎn)單又稱（直接分裂）直接進(jìn)行細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的分裂方式。分裂過程中既無染色體、紡錘體的形成，也無核膜、核仁的解體。為了便于描述人為的劃分為六個(gè)時(shí)期：前期(prophase)；前中期(premetaphase)；中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。⑥胞質(zhì)分裂（）二、有絲分裂（mitosis）是高等真核生物細(xì)胞分裂的主要方式（一）前期①染色質(zhì)凝縮，②分裂極確立，③核仁縮小并解體，④核膜消失。中心粒星體微管中心體紡錘體微管極微管（連續(xù)絲）橫橋染色體微管著絲點(diǎn)極微管染色體微管區(qū)間微管①極體微管（polarmt）、分子馬達(dá)。②著絲點(diǎn)微管（kinetochoremt）；③星體微管（astralmt植物沒有中心粒和星體，其紡錘體稱無星紡錘體。（三）中期高度凝聚的染色體排列到細(xì)胞的赤道面上。有絲分裂器：染色體、星體、中心粒和紡錘體。（四）后期指姊妹染色體單體分開并移向兩極的時(shí)期。分為后期A、后期B兩個(gè)過程。AnaphaseA:separationofthesisterchromatids.MicrotubulesandMotorsinthespindle從子染色體到達(dá)兩極，至形成兩個(gè)新細(xì)胞核為止的時(shí)期。大體經(jīng)歷了與前期相反的過程，即染色體解聚縮，核仁出現(xiàn)和核膜重新形成。核纖層蛋白B去磷酸化，介導(dǎo)核膜重新裝配。（五）末期子細(xì)胞核又重新組裝（六）在收縮環(huán)作用下胞質(zhì)發(fā)生（cytokinesis）分裂子核的形成與胞質(zhì)分裂是相繼發(fā)生的，屬于兩個(gè)分離的過程。

如：大多數(shù)昆蟲的卵，核可進(jìn)行多次分裂而無胞質(zhì)分裂，某些藻類的多核細(xì)胞可長(zhǎng)達(dá)數(shù)尺，以后胞質(zhì)才分裂形成單核細(xì)胞。胞質(zhì)分裂通過胞質(zhì)收縮環(huán)的收縮實(shí)現(xiàn)，是由大量平行排列的肌動(dòng)蛋白組成。有絲分裂過程間期核膜核仁染色質(zhì)中心粒前期中期后期末期赤道板收縮環(huán)造成的分裂溝動(dòng)物細(xì)胞的有絲分裂植物細(xì)胞末期近兩極處紡錘絲消失，中間微管保留，并數(shù)量增加，形成成膜體。來自高爾基體囊泡沿微管轉(zhuǎn)運(yùn)到成膜體中間。融合形成細(xì)胞板(cellplate)，囊泡的內(nèi)含物形成初生壁和中膠層，囊泡膜形成質(zhì)膜，融合留下的管道形成胞間連絲。三、減數(shù)分裂（Meiosis）是一種特殊的有絲分裂由連續(xù)兩次分裂構(gòu)成：通常減數(shù)分裂I分離的是同源染色體，所以稱為異型分裂（heterotypicdivision）或減數(shù)分裂（reductionaldivision）。減數(shù)分裂II分離的是姊妹染色體，類似于有絲分裂，所以稱為同型分裂（homotypicdivision）或均等分裂（equationaldivision）。MeiosisConcepts:GameticmeiosisSporicmeiosisZygoticmeiosis（一）第一次減數(shù)分裂過程中細(xì)胞變化復(fù)雜1、前期I減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在前期I，通常分為5個(gè)時(shí)期：①細(xì)線期（leptotene），②合線期（zygotene），③粗線期（pachytene），④雙線期（diplotene），⑤終變期（diakinesis）。1）細(xì)線期：染色體呈細(xì)線狀，具有念珠狀的染色粒。2）合線期：亦稱偶線期，是同源染色體配對(duì)的時(shí)期。概念：聯(lián)會(huì)復(fù)合體(synaptonemalcomplex，SC）二價(jià)體（bivalent）四分體（tetrad）。這一時(shí)期合成約0.3%左右的DNA，稱為Z-DNA。Chromosomerecombination13）粗線期：同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生交換的時(shí)期。同源染色體5）終變期：二階體顯著變短。由于交叉端化過程的進(jìn)一步發(fā)展，故交叉數(shù)目減少，通常只有一至二個(gè)交叉。核仁此時(shí)開始消失，核被膜解體。前期I(雙線期)前期I(終變期)2.中期I:兩個(gè)動(dòng)粒、單側(cè)動(dòng)粒微管、染色體排列于赤道面3.后期I:①二價(jià)體的兩條同源染色體分開，分別向兩極移動(dòng);②同源染色體隨機(jī)分向兩極，染色體重組，人類染色體重組概率有223個(gè)。4.末期I:①染色體去凝縮，②核膜、核仁重新出現(xiàn)，③胞質(zhì)分裂，兩個(gè)子細(xì)胞形成，④遺傳物質(zhì)減半（2n→n）。5.減數(shù)分裂的間期:兩次分裂之間的短暫休整時(shí)期（二）減數(shù)分裂II可分為前、中、后、末四個(gè)四期，與有絲分裂相似。一個(gè)精母細(xì)胞形成4個(gè)精子；一個(gè)卵母細(xì)胞形成一個(gè)卵子及2-3個(gè)極體。Minimumnumberofgametetypes=2n,Inhumans,n=23Chromosomerecombination2（二）減數(shù)分裂II與有絲分裂過程相似?？煞譃榍?、中、后、末四個(gè)四期，一個(gè)精母細(xì)胞形成4個(gè)精子；一個(gè)卵母細(xì)胞形成一個(gè)卵子及2-3個(gè)極體。SC由兩條同源染色體沿縱軸形成，外觀呈梯子狀。SC幫助交換的完成，SC上有重組節(jié)(recombinationnodules)，是交換發(fā)生的部位。SC主要由堿性蛋白質(zhì)和RNA組成，并含有少量DNA。SC形成合線期，成熟于粗線期，消失于雙線期。在細(xì)線期或合線期加入DNA合成抑制劑，則抑制SC的形成。三、聯(lián)會(huì)復(fù)合體SC聯(lián)會(huì)復(fù)合體（SC）側(cè)生成分：電子密度較高，寬約10nm的纖維組成，主要成分為DNA，還有RNA和組蛋白。中央組分：電子密度較低，主要成分為非組蛋白。synaptonemalcomplex2.減數(shù)分裂II前期II中期II后期II1.姐妹染色單體分離（二分體單分體）2.非姐妹染色單體隨機(jī)組合。末期II中期I后期I1.同源染色體分離（四分體二分體）2.非同源染色體隨機(jī)組合末期I間期間期前期I(細(xì)線期)前期I(偶線期)前期I(粗線期)前期I(雙線期)前期I(終變期)中期I后期I末期I間期前期II中期II后期II末期IIEucaryoticCellCycle

Atypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間。指DNA復(fù)制的時(shí)期。DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間。第二節(jié)細(xì)胞周期及其進(jìn)程

一、定義：…。包括兩個(gè)階段，分為4個(gè)期：

細(xì)胞分裂開始到分裂結(jié)束。從增殖的角度來看，可將高等動(dòng)物的細(xì)胞分為三類：①連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞。②休眠細(xì)胞暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は驴芍匦逻M(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。③不分裂細(xì)胞，指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等。二、細(xì)胞周期各期主要的動(dòng)態(tài)變化（一）G1期(gap1)是DNA復(fù)制的準(zhǔn)備期

G1期：-主要合成RNA和蛋白質(zhì)、脂類和糖類；

-細(xì)胞迅速增長(zhǎng)，體積顯著增大；

-觸發(fā)蛋白（不穩(wěn)定蛋白、unstableprotein,簡(jiǎn)稱U蛋白）；

-多種蛋白質(zhì)的磷酸化（H1…Ser…-COOH）；

-細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用加強(qiáng)

-膽固醇合成顯著增加（二）S期(synthesisphase)是DNA復(fù)制時(shí)期

S期：-主要進(jìn)行DNA的復(fù)制，早復(fù)制GC含量高的

DNA序列，晚復(fù)制AT含量高的DNA序列，常染色質(zhì)復(fù)制在先，異染色質(zhì)復(fù)制在后；

-組蛋白的合成以及組蛋白的持續(xù)磷酸化；

-中心粒的復(fù)制；（三）G2期(gap2)是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期

-G2期：主要合成RNA、

ATP、蛋白質(zhì)等。

（四）-M期又稱D期(mitosisordivision)：核分裂和胞質(zhì)分裂（前、中、后、末等時(shí)期）細(xì)胞周期的時(shí)間長(zhǎng)短與物種的細(xì)胞類型有關(guān)。通常G1期持續(xù)時(shí)間差異較大，M期最短約0.5～4.5小時(shí)。標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測(cè)定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TDR。三、細(xì)胞周期時(shí)間的測(cè)定MG2G1SM期細(xì)胞所占的%50100TG20TMTsTcTG2+1/2TMTPLM標(biāo)記有絲分裂百分率法（常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM）細(xì)胞同步化(synchronization)是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步化。（一）自然同步化1.多核體：如：粘菌、瘧原蟲。2.某些水生動(dòng)物的受精卵：如海膽、海參、兩棲類。3.增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。四、細(xì)胞同步化1.選擇同步化1）有絲分裂選擇法：M期細(xì)胞與培養(yǎng)皿的附著性低，振蕩脫離器壁收集。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。缺點(diǎn)：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少（分裂細(xì)胞約占1%～2%）。（二）人工同步化2）細(xì)胞沉降分離法：M期細(xì)胞體積大，可用離心分離。優(yōu)點(diǎn)：可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。缺點(diǎn)：同步化程度較低。2.誘導(dǎo)同步化1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成。常用TDR雙阻斷法：在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)基中加入過量TDR（Hela2mol/L；CHO7.5mol/L）。S期細(xì)胞被抑制，停在G1/S交界處。移去TDR，釋放時(shí)間大于TS時(shí)，再次加入過量TDR。優(yōu)點(diǎn)：同步化程度高缺點(diǎn)：產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。2）中期阻斷法：用秋水仙素等細(xì)胞分裂抑制劑將細(xì)胞阻斷在中期。優(yōu)點(diǎn)是無非均衡生長(zhǎng)現(xiàn)象，缺點(diǎn)是可逆性較差。第三節(jié)

細(xì)胞周期的調(diào)控一、研究背景1970sRao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。甚至不同類的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子(maturationpromotingfactor，MPF)。PCCG1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。1960sLeland

Hartwell,1970sPaulNurse以裂殖酵母和芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene,CDC)。如：cdc2和cdc28都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行，wee1和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)CDC2的活性。Cdc25&Wee1mutant裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂；wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂；Fissionyeast

buddingyeast

1980sTimothyHunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclinA和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動(dòng)物來源的細(xì)胞周期蛋白的mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=CDC2蛋白+clyclinBLelandH.Hartwell

R.Timothy(Tim)Hunt

SirPaulM.Nurse

2001年10月8日美國(guó)人Leland

Hartwell、英國(guó)人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。（一）細(xì)胞周期蛋白出現(xiàn)于細(xì)胞周期進(jìn)程中共同特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。均含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。二、細(xì)胞周期蛋白cyclin不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。已知30余種。酵母中是:Cln、Clb、Cig。在脊椎動(dòng)物中為:A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。作用：激活CDK，引導(dǎo)CDK作用于不同底物。cellcycleregulation在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活后期促進(jìn)因子APC，將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體(proteasome)降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒(destructionbox)。泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，cyclinB被蛋白酶體(proteasome)降解，完成一個(gè)細(xì)胞周期。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。DestructionBoxinCyclinsE1SH+Ub+ATPE1SCO=UbAMP，PPiE2E1-SHE3+靶蛋白Lys-NH2+E2SCO=UbSCO=Ub靶蛋白Lys-UbUbUbE3E2SCO=Ub靶蛋白Lys-UbUbUbE3E2-SHE3+UbUbUbUb+26S蛋白酶體降解的靶蛋白泛素分子APC（后期促進(jìn)因子）

cyclosome有八種成分組成Cdc16、Cdc23、Cdc27、BimE；APC2、APC4、APC5和APC8。作用：通過泛素化途徑降解周期蛋白B/A（二）細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）CDC2蛋白與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)P322表12-3。在動(dòng)物中已知7種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。CDC2蛋白（CDC2）又被稱為CDK1，CDC2蛋白與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合成MPF可將特定蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行，又稱作細(xì)胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮，啟動(dòng)Ｍ期；使降解周期蛋白的酶磷酸化，周期蛋白濃度降低。M期CDK的激活Myt細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）CDKinhibitor,CKI對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：①Ink4(Inhibitorofcdk4):P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特異性抑制cdk4·cyclinD1,cdk6·cyclinD1。②Kip(Kinaseinhibitionprotein)：P21cip1(cyclininhibitionprotein1）P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成。CDKactivating1.G1期，在生長(zhǎng)因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。2.G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期。3.在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體。（三）cyclin-CDK對(duì)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的全面調(diào)控G1/S調(diào)控點(diǎn)M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclinB的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。4.M期cyclin–CDK復(fù)合物的作用M期CDK的激活Myt組成：感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器。主要檢驗(yàn)點(diǎn)：G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)，細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restrictionpoint)；S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成；G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：未復(fù)制DNA檢測(cè)點(diǎn)；M(中-后)期檢驗(yàn)點(diǎn)：紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)