凝膠色譜分離技術(shù)-操作與應(yīng)用

凝膠色譜分離技術(shù)

——操作與應(yīng)用凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法1凝膠過濾色譜法的應(yīng)用2（一）凝膠的選擇凝膠的選擇依據(jù)：1.分離范圍；2.分辨率；3.穩(wěn)定性。如制備分離中的脫鹽，大多采用硬膠，既容易操作，又可得到滿意的流速，常用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25、G-50。對于小肽和低分子量物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可采用交聯(lián)葡聚糖凝膠G-10、G-15及生物凝膠P-2、P-4。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

1.葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠

以干品出售的，所以使用前必須溶脹。溶脹必須徹底，若溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果，甚至有使柱破裂的危險(xiǎn)。

溶脹方法：在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（二）凝膠的預(yù)處理

2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以濃懸浮液的形式出售的，因此不須溶脹。瓊脂糖凝膠的正常操作溫度是0-30℃，高于36℃時(shí)，這種凝膠就要軟化解體。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。

分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)。層析柱越長，分辨率越高。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（三）層析柱的選擇從大分子（M.W.>20000）中分離小分子，如無機(jī)鹽或代謝中間物（M.W.<1500）時(shí)，柱床體積應(yīng)是上樣體積的4-10倍，柱高：柱直徑應(yīng)為5:1-15:1。這類柱叫除鹽柱。

分離大分子時(shí)，柱床體積應(yīng)為上樣體積的25-100倍，柱高：柱直徑應(yīng)為20:1-100:1。直徑小于1cm的柱，在濕潤的玻璃柱壁上有“壁效應(yīng)”，能嚴(yán)重降低柱的分辨率。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（四）凝膠柱的裝填1.空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。2.所用凝膠必須是經(jīng)過充分溶漲的。3.開始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對分離不利。4.進(jìn)膠過程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。為此，層析柱要始終保持垂直。5.凝膠懸液濃度也需控制，過稀和過濃都會產(chǎn)生不利影響。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（五）樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10％，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。(1)直接將樣品加到層析床表面；(2)利用兩種液體相對密度不同而分層。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（六）洗脫與收集當(dāng)樣品液恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，由不致使凝膠床面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫。為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過程中始終保持一定的操作壓，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過濾色譜法的操作方法（七）凝膠的再生和保養(yǎng)因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，所以一次分離后無須再生處理就可以進(jìn)行下一次分離。一般的層析床可反復(fù)使用數(shù)十次。

交聯(lián)葡聚糖凝膠柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液處理，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用0.5mol/LNaCl處理。凝膠色譜分離技術(shù)——操作與應(yīng)用凝膠過