色譜分析概論

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色譜法是一種重要的分離分析方法，它是根據(jù)組分在兩相中作用能力不同而達(dá)到分離目的。

第2頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.1色譜法發(fā)展簡史

茨維特的實(shí)驗(yàn)茨維特（M.S.Tswett)：俄國植物學(xué)家，主要從事植物色素的研究工作

1903年3月21日：華沙自然科學(xué)會(huì)議生物學(xué)會(huì)議上宣讀論文：“Onanewcategoryofabsorptionphenomenaandtheirapplicationtobiochemicalanalysis”第3頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

“一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用”。在1906

年發(fā)表的文章中，首次提出了色譜的概念。第4頁,共62頁，2024年2月25日，星期天茨維特的實(shí)驗(yàn)-分離植物色素第5頁,共62頁，2024年2月25日，星期天ts第6頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動(dòng)的一相（固體或液體）稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相

；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱

。第7頁,共62頁，2024年2月25日，星期天色譜法是一種分離方法。它的特點(diǎn)是：有兩相，一是固定相，一是流動(dòng)相，兩相作相向運(yùn)動(dòng)。

將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。第8頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

1941年：英國人馬丁與辛格首次突出液-液色譜法（經(jīng)典液相色譜發(fā)）；1952年：英國人馬丁與辛格建立氣液色譜法（脂肪酸混合物的分離），發(fā)展了氣相色譜；1956

VanDeemter提出速率理論；1957年美國Golay首先應(yīng)用小口徑毛細(xì)管進(jìn)行色譜分離；1959年P(guān)orath和Flodin空間排阻色譜法（固定相：多孔凝膠)1967

Kirkland等研制高效液相色譜儀；1970以后逐漸發(fā)展了高效液相色譜；第9頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

1975年H.Small研究組建立了離子色譜法；1979年氣相色譜應(yīng)用的飛躍：彈性石英毛細(xì)管色譜柱的商品化；20世紀(jì)50年代：毛細(xì)管電泳技術(shù)的建立和發(fā)展。其迅速發(fā)展在20世紀(jì)80年代毛細(xì)管區(qū)帶電泳的建立，之后發(fā)展了膠束電動(dòng)色譜、毛細(xì)管凝膠色譜、毛細(xì)管電色譜（主要應(yīng)用于：蛋白質(zhì)分離、糖分析、DNA測(cè)試、手性分離、單細(xì)胞分析）我國色譜研究工作起步于1954年，有中科院大連化物所進(jìn)行早期的理論和技術(shù)研究（盧佩章、張玉奎）第10頁,共62頁，2024年2月25日，星期天色譜分析法的重要貢獻(xiàn)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：1948年，瑞典Tiselins，電泳和吸附分析；1952年，英國馬丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色譜。應(yīng)用的科學(xué)領(lǐng)域：化學(xué)、化工、輕工、石油、環(huán)保、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等幾乎所有學(xué)科領(lǐng)域。為信息科學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)。第11頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.2色譜法的分類按流動(dòng)相分氣相色譜（GC）液相色譜（LC）超臨界流體色譜（SFC）按機(jī)理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜第12頁,共62頁，2024年2月25日，星期天按固定相在支持體中的形狀分柱色譜平板色譜紙色譜薄層色譜按分離效率分經(jīng)典液相色譜高效液相色譜第13頁,共62頁，2024年2月25日，星期天毛細(xì)管電色譜法

（CEC）色譜法GSC液相色譜法（LC）柱色譜法平面色譜法毛細(xì)管電泳法

（CE）LLCLSCSECIECBPC紙色譜法薄層色譜法

（TLC）LLCLLCLSC氣相色譜法（GC）柱色譜法GLC超臨界流體色譜法（SFC）第14頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.3色譜法的特點(diǎn)與局限性1.特點(diǎn)1）選擇性好2）效率高、速度快3）靈敏度高、樣品用量少4）應(yīng)用范圍廣2.局限性1）定性能力相對(duì)弱；2）定量時(shí)必須有標(biāo)準(zhǔn)品；3）有些物質(zhì)如異構(gòu)體、固體物質(zhì)的分析能力較差。第15頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.4色譜圖和相關(guān)術(shù)語色譜過程

實(shí)現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相，固定相(stationaryphase)和流動(dòng)相(mobilephase)。

色譜過程是組分的分子在流動(dòng)相和固定相間多次“分配”的過程。第16頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

第17頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

1.色譜圖（色譜流出曲線）是由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜流出曲線。第18頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

峰峰高基線峰寬半峰寬峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差σ第19頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.基線在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。3.峰高色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示。第20頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

色譜流出曲線和色譜峰基線（a）峰高（h）信號(hào)進(jìn)樣空氣峰ha色譜流出曲線色譜峰第21頁,共62頁，2024年2月25日，星期天（四）保留值

1.死時(shí)間tM

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。信號(hào)進(jìn)樣tM第22頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相流動(dòng)速度相近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速ū時(shí)，可用柱長L與tM的比值計(jì)算，即

ū=L/tM第23頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.保留時(shí)間tR試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如下圖。信號(hào)進(jìn)樣tR第24頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3.調(diào)整保留時(shí)間tR′某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保留時(shí)間，即tR′=tR

tM

由于組分在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組分隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留所須的時(shí)間，所以tR實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。第25頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積來表示保留值。第26頁,共62頁，2024年2月25日，星期天4.死體積V0

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和。當(dāng)后兩項(xiàng)很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速Fco（cm3·min-1）計(jì)算。

第27頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

V0=tMFco

式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。第28頁,共62頁，2024年2月25日，星期天5.保留體積VR指從進(jìn)樣開始到被測(cè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間與保留體積關(guān)系：

VR=tRFco

第29頁,共62頁，2024年2月25日，星期天6.調(diào)整保留體積VR

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

VR

=VR

V0=tR

Fco

第30頁,共62頁，2024年2月25日，星期天7.相對(duì)保留值r2,1

某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值。

r2,1=tR2

/tR1′=VR2

/VR1

由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。第31頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值，此時(shí)可用符號(hào)

表示，即

=tR(i)/tR

(s)

式中tR(i)為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以

總是大于1的。相對(duì)保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。第32頁,共62頁，2024年2月25日，星期天(五)區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。第33頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.標(biāo)準(zhǔn)偏差

---即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬Y1/2---即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為

Y1/2=2.354

3.峰底寬度Y---即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差

的關(guān)系是Y=4

第34頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共62頁，2024年2月25日，星期天從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i)根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；(ii)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(iii)根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(iv)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；(v)色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)。第36頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。

第37頁,共62頁，2024年2月25日，星期天關(guān)于保留值死時(shí)間(tM):無保留組分出峰時(shí)間保留時(shí)間(tR):調(diào)整保留時(shí)間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):

調(diào)整保留體積(V’R):第38頁,共62頁，2024年2月25日，星期天1.5色譜現(xiàn)代發(fā)展及相關(guān)聯(lián)用技術(shù)1.理論方面色譜理論的本質(zhì)是研究色譜熱力學(xué)、色譜動(dòng)力學(xué)以及熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)有機(jī)結(jié)合來尋求色譜分離的最佳化途徑。平衡理論、塔板理論、縱向擴(kuò)散理論、速率理論；塊狀液膜模型、分子頂替模型、各種保留值預(yù)測(cè)理論，等等。第39頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.新型固定相和檢測(cè)器的研究（1）固定相手性固定相—手性化合物的分離分析固定相載體的研究：粒徑均勻、高強(qiáng)度的高分子多孔微球制備技術(shù)一般儀器所用填料3~5m；超高液相色譜儀中所用填料1.7m；整體柱技術(shù)（棒柱）：將填料單體、引發(fā)劑、制孔劑混合后通過原位聚合或固化在柱管中形成的多孔結(jié)構(gòu)的棒狀整體式柱體。目的：提高柱效和重現(xiàn)性，實(shí)現(xiàn)快速分離分析。第40頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

（2）檢測(cè)器紫外檢測(cè)器；熒光檢測(cè)器；電化學(xué)檢測(cè)器；示差折光檢測(cè)器等。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器——可用于不吸收紫外光的物質(zhì)（糖類等）的檢測(cè)；適合于測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相得物質(zhì)。

半導(dǎo)體熒光檢測(cè)器——具有高靈敏度，檢測(cè)限可優(yōu)于紫外分光光度法2個(gè)數(shù)量級(jí)。第41頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2.技術(shù)方面1）超臨界流體色譜（SFC）超臨界流體：物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上，既不是液體，又不是氣體，是一種單一相態(tài)的流體。但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴(kuò)散系數(shù)等特性。第42頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

第43頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

2）多維色譜多維技術(shù)有GC-GC、LC-GC、LC-LC等多種組合。3）毛細(xì)管電動(dòng)色譜（CEC）可以看成是高效液相色譜和毛細(xì)管區(qū)帶電泳相結(jié)合的產(chǎn)物。第44頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

生物芯片GC-MS—MS(或LC-MS-MS)LC-GC-MS3.儀器方面全微機(jī)化控制和數(shù)據(jù)處理的多功能色譜儀器已成為主流產(chǎn)品。4.色譜專家系統(tǒng)第45頁,共62頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜第46頁,共62頁，2024年2月25日，星期天氣相色譜儀第47頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

1.6中文工具書及國內(nèi)外期刊1.中文工具書分析化學(xué)手冊(cè)，分析儀器手冊(cè)2.主要色譜期刊《色譜》；《分析化學(xué)》第48頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

《JournalofChromatography》（荷蘭）2.777（B）《JournalofChromatographicScience》（美國）《Chromatographia》（德國）1.398《JournalofLiquidChromatography&RelatedTechniques》（美國）《JournalofSeparationScience》第49頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

《BiomedicalChromatography》（英國）1.639《AnalyticalChemistry》（美國）5.2《Electrophoresis》3.7《JournalofCapillaryElectrophoresis》《JournalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis》2.453

等等第50頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

3.在互聯(lián)網(wǎng)上查閱色譜文獻(xiàn)第51頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共62頁，2024年2月25日，星期天色譜法分離理論