課件速覽-抗HER2單克隆抗體純化

項(xiàng)目四抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)任務(wù)二抗HER2單克隆抗體純化細(xì)胞培養(yǎng)組將合格的豐收液送入中間庫，與純化組完成豐收液交接工作，接下來純化組立即嚴(yán)格按照豐收液處理及層析等相關(guān)操作規(guī)程，對豐收液進(jìn)行澄清、濃縮處理，并開展層析等純化工作，獲得符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的高純度抗HER2單克隆抗體原液。規(guī)范填寫生產(chǎn)記錄。任務(wù)學(xué)習(xí)路徑見思維導(dǎo)圖。任務(wù)描述抗HER2單克隆抗體純化2任務(wù)支撐（一）豐收液澄清技術(shù)

1.自然沉降與離心技術(shù)

豐收液靜止即可依靠重力發(fā)生沉降，再采用虹吸法，即可被去除顆粒物。其沉降耗時(shí)較長，一般需數(shù)小時(shí)；沉降不能徹底去除顆粒物，可用于預(yù)處理豐收液，使后續(xù)使用其他澄清技術(shù)的效果更佳。

操作者可通過離心機(jī)的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離。3抗HER2單克隆抗體純化（一）豐收液澄清技術(shù)4

微孔過濾技術(shù)是膜分離技術(shù)中開發(fā)最早，應(yīng)用廣泛的一種膜過濾分離技術(shù)。微孔過濾可用來從氣相和液相中截留微粒、細(xì)菌、污染物等，是現(xiàn)代工業(yè)中確保產(chǎn)品質(zhì)量的必要手段，能有效去除料液中的固相物質(zhì)。2.微孔過濾技術(shù)（一）豐收液澄清技術(shù)5

深層過濾器利用具有一定厚度的特定介質(zhì)，去除顆粒、亞微顆粒、膠質(zhì)物以及可溶的物質(zhì)，從而高效地去除污染物。流體必須通過彎曲的路徑才能到達(dá)另一側(cè)。在此過程中深層過濾介質(zhì)通過尺寸排阻、吸附、電荷作用等多種功能，很好地實(shí)現(xiàn)澄清豐收液目的。與離心技術(shù)和微孔過濾技術(shù)相比更具優(yōu)勢。3.深層過濾技術(shù)（二）親和層析技術(shù)6

親和層析（親和色譜）具有較高選擇性，甚至能使分離純化在一步中完成。親和色譜分離蛋白的純化基礎(chǔ)是一個(gè)蛋白（或者一組蛋白）與特異性配基配對到色譜基質(zhì)上，并且蛋白質(zhì)與配基之間具有可逆的相互作用。

目標(biāo)蛋白質(zhì)與配基之間的生物學(xué)相互作用可以是由于靜電相互作用或者疏水性的相互作用，范德華力和/或氫鍵結(jié)合力等產(chǎn)生的。可以從親和介質(zhì)中將目標(biāo)分子洗脫，或者用一個(gè)特異性競爭的配基，或者用非特異性洗脫，如改變pH、離子強(qiáng)度或者極性。在一個(gè)單一的步驟中，使用親和純化能節(jié)省大量的純化時(shí)間，使用更少的純化步驟，達(dá)到更高的純度。1.了解親和層析（二）親和層析技術(shù)7

親和層析不僅局限于蛋白質(zhì)分離，一些具有典型的相互作用的生物分子，經(jīng)常被用于親和色譜純化，如下所述：酶與底物類似物，抑制劑，輔助因子；抗體與抗原，病毒，細(xì)胞；凝集素與多糖類，糖蛋白，細(xì)胞表面受體，細(xì)胞；核酸與互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，核酸結(jié)合蛋白；激素，維生素與受體、載體蛋白；谷胱甘肽與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶或者GST融合蛋白；金屬離子與聚組氨酸（His）融合蛋白，具有組氨酸的天然蛋白質(zhì)，表面有半胱氨酸和/或色氨酸殘基的蛋白質(zhì)。2.親和層析常見配對配基（二）親和層析技術(shù)8

親和層析一般由平衡、上樣、清洗（洗滌）和洗脫等步驟。3.親和層析工藝親和層析過程示意圖（二）親和層析技術(shù)9（1）介質(zhì)和平衡緩沖液的準(zhǔn)備。新的親和介質(zhì)在使用前，溶劑應(yīng)該被徹底清洗掉。以凍干粉末形式購買的市售介質(zhì)，需要按說明書使用經(jīng)0.45μm的濾膜過濾的高質(zhì)量水和化學(xué)試劑進(jìn)行溶脹。用過的親和介質(zhì)在重復(fù)使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)僅應(yīng)用于同一種目標(biāo)蛋白的純化，避免樣品間的交叉污染。3.親和層析工藝（2）上樣。樣品中的任何污染物在親和介質(zhì)中要能被去除，不殘留，并且不損壞配基。每一種親和介質(zhì)，結(jié)合和洗脫緩沖液是專一性的，因?yàn)榫彌_液可以影響目標(biāo)分子和配基間的相互作用。在懸浮介質(zhì)時(shí)，應(yīng)使用溫和的轉(zhuǎn)動(dòng)混合或者上下顛倒混合；避免使用攪拌器，否則會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)損壞。（二）親和層析技術(shù)10（2）上樣。

在樣品應(yīng)用過程中，控制適當(dāng)流速使樣品與配基能充分結(jié)合，流速這一參數(shù)可以根據(jù)目標(biāo)蛋白和配基之間專一性的相互作用和它們的濃度的不同而變化。（3）洗脫。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)與親和介質(zhì)的結(jié)合非常緊密時(shí)，在開始進(jìn)行洗脫后，停止流動(dòng)一段時(shí)間（經(jīng)常在10min到2h），將會(huì)有更多的時(shí)間使目標(biāo)蛋白與配基之間解吸附，然后繼續(xù)進(jìn)行洗脫，可能提高結(jié)合物質(zhì)的回收率。

洗脫方法分為選擇性洗脫和非選擇性洗脫。選擇性洗脫方法適用于特異性基團(tuán)配基的解吸附。非選擇性洗脫方法要關(guān)注維持復(fù)合物存在的靜電相互作用、疏水性相互作用和氫鍵等，能夠減弱這些力的相互作用的因子可以被用作有效的洗脫因子。3.親和層析工藝（二）親和層析技術(shù)11（3）洗脫。

洗脫方法主要有以下五種：

①pH洗脫。

②離子強(qiáng)度洗脫。

③競爭性洗脫。

④降低洗脫液的極性。

⑤促溶洗脫。3.親和層析工藝（三）濃縮技術(shù)12

超濾是利用半透膜的微孔結(jié)構(gòu)，以一定的外界壓力（0.1～0.3MPa）為推動(dòng)力，實(shí)現(xiàn)對物質(zhì)選擇性地分離、回收的膜分離方法。此法是利用微孔纖維素膜能通過高壓將水分濾出，蛋白質(zhì)遠(yuǎn)大于膜的截留孔徑，不能通過膜而被截留，達(dá)到濃縮目的。

超濾濃縮有直板超濾和切向流超濾兩種，直板超濾由于液流方向與超濾膜垂直，易發(fā)生濾膜堵塞；切向流超濾的液流方向與超濾膜方向平行，阻塞物會(huì)被液流及時(shí)沖走，極大延緩了濾膜阻塞，是目前工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的濃縮方法之一。超濾蛋白時(shí)要求蛋白質(zhì)分子量要大于膜截留分子量的5倍以上。1.超濾濃縮技術(shù)（三）濃縮技術(shù)131.超濾濃縮技術(shù)超濾膜包小型超濾系統(tǒng)（三）濃縮技術(shù)14

可用陰離子介質(zhì)或陽離子介質(zhì)最大限度地吸附蛋白，后用含高濃度氯化鈉（一般低于1mol/L）洗脫液進(jìn)行洗脫可得到高度濃縮的蛋白。此法蛋白濃縮程度受介質(zhì)載量限制，濃縮后蛋白質(zhì)需要進(jìn)行脫鹽處理。2.離子交換濃縮技術(shù)

利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液，濃縮時(shí)間長，濃縮初始體積小，多用于實(shí)驗(yàn)室。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋，扎緊，把高分子（6000～12000）聚合物，如聚乙二醇、聚乙烯、吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可；也可將吸水劑配成30％～40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可干燥重復(fù)使用。3.透析袋濃縮技術(shù)（三）濃縮技術(shù)15

冷凍干燥濃縮使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分，是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。其具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如CaCl2和硅膠等），密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。常采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。4.冷凍干燥濃縮技術(shù)

選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過離心被除去。5.凝膠濃縮技術(shù)（三）濃縮技術(shù)16

濃縮膠是一種高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物，具有很強(qiáng)的吸水性能。每克干膠可吸水120～150mL。它能吸收低分子量的物質(zhì)，如水、葡萄糖、蔗糖、無機(jī)鹽等。濃縮后，蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)80％～90％。濃縮膠應(yīng)用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽離子交換，影響濃縮物質(zhì)的回收率。6.濃縮膠濃縮技術(shù)（三）濃縮技術(shù)17（1）三氯醋酸沉淀法。要求的儀器簡單，但是常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。（2）免疫沉淀法。要求有特異性抗體。（3）硫酸銨沉淀法。利用高濃度鹽將蛋白質(zhì)析出。（4）（低溫）有機(jī)溶劑沉淀法。需要低溫（4℃以下）下進(jìn)行，因?yàn)?0℃時(shí)蛋白會(huì)在有機(jī)溶劑中變性。可用乙醇，丙酮等，需要關(guān)注Mg2+離子和溶液pH。（5）聚乙二醇沉淀法（PEG）。聚乙二醇具有良好的生物相容性，只在個(gè)別濃度下才使蛋白質(zhì)稍有變性。PEG溶解時(shí)散熱低，形成沉淀的平衡時(shí)間短，通常達(dá)到30%時(shí)蛋白質(zhì)就會(huì)達(dá)到最大量的沉淀。7.沉淀法生產(chǎn)前準(zhǔn)備豐收液的處理親和層析病毒滅活離子交換層析任務(wù)實(shí)施18疏水層析置換緩沖液清場12345678抗HER2單克隆抗體純化

確認(rèn)是否有前批清場合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具符合要求；填寫抗HER2單克隆抗體純化產(chǎn)前檢查記錄；領(lǐng)用原輔料和耗材，領(lǐng)用或配制生產(chǎn)用溶液。（一）生產(chǎn)前準(zhǔn)備19（1）離心。條件為4800rpm，大于20min，4℃。（2）過濾。采用0.22μm除菌微孔濾芯，控制過濾壓力小于濾芯最大允許壓力的80%。（3）超濾。膜包截留孔徑為50kD，進(jìn)口端壓力小于1.3bar，出口端壓力小于0.4bar，每平方英尺膜超濾體積小于50L，濃縮倍數(shù)為6倍。（二）豐收液的處理201.層析介質(zhì)

ProteinA。2.上樣液預(yù)處理

濃縮后上清液用2mol/LTris母液調(diào)pH為7.0～7.5。3.層析緩沖液（1）平衡液。40mmol/LTris-HCl，pH7.2。（2）沖洗液。40mmol/LTris-HCl，0.8mol/LNaClpH7.2。（3）洗脫液。60mmol/LHAc-NaAc，pH3.5。（4）再生液。0.5mol/LNaCl，0.1mol/LNaOH。（三）親和層析214.層析操作流程

用平衡液預(yù)平衡約4倍柱床體積，至流出pH為7.2后上樣。

上樣完畢后，用平衡液平衡5倍柱床體積，再用3倍柱床體積沖洗液沖洗。再用平衡液平衡3倍柱床體積。用洗脫液洗脫。洗脫時(shí)收集A280＞300mAU的樣品峰。洗脫完畢用再生液沖洗3倍柱床體積，再用平衡液平衡5倍柱床體積直至流出液pH為中性為止。如長時(shí)間不用，以20%乙醇浸泡柱床。

樣品上樣和洗脫的線性流速控制在60cm/h，其他操作線性流速控制不低于120cm/h。5.洗脫液標(biāo)準(zhǔn)

測量收集液的OD280、OD260值，計(jì)算比值應(yīng)大于1.55，外觀澄清。（三）親和層析22

調(diào)節(jié)pH至3.2，室溫孵育2h。孵育結(jié)束后將pH調(diào)回7.0。其原理是利用病毒表面抗原在低pH值的條件下，電荷會(huì)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生不可逆的改變，從而使病毒喪失侵染細(xì)胞的能力。

該方法對于無脂包膜類病毒作用微弱（僅部分非脂包膜病毒有效），但在工藝中的低pH（如pH4）處理能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果可能受pH值、時(shí)間和溫度、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素影響。（四）病毒滅活231.層析介質(zhì)CM-FF。2.上樣液處理用2mol/LTris母液調(diào)節(jié)親和洗脫樣品至pH4.4±0.1。3.層析緩沖液（1）平衡液。20mmol/LHAc-NaAc，pH4.4。（2）預(yù)洗液。20mmol/LHAc-NaAc、120mmol/LNaCl、pH4.4。（3）洗脫液。20mmol/LHAc-NaAc、380mmol/LNaCl、pH4.4。（4）清洗液。2.0mol/LNaCl。（5）再生液。1.0mol/LNaOH。（五）離子交換層析244.層析操作流程

清洗液清洗30min，再生液沖洗0.5h，流速均為30cm/h。用無菌水沖洗層析柱，用平衡液再平衡10倍柱床體積，至流出液pH為4.4，流速為120cm/h。上樣結(jié)束后用平衡液平衡5倍柱床體積，預(yù)洗液沖洗5倍柱床體積，以洗脫液洗脫。洗脫收集A280＞300mAU洗脫峰。預(yù)洗、洗脫流速為60cm/h。以再生液再生6倍柱床體積，流速30cm/h，用無菌水沖洗層析柱，至流出液pH為中性。如長時(shí)間不用，以20%乙醇浸泡柱床。5.洗脫液標(biāo)準(zhǔn)

測量收集液的OD280、OD260值，計(jì)算比值應(yīng)大于1.65，外觀澄清透明。（五）離子交換層析251.層析介質(zhì)

Phenyl-HP。2.上樣液處理

CM洗脫液加入3mol/L硫酸銨母液至硫酸銨終濃度為1.2mol/L。調(diào)節(jié)pH至4.8。3.層析緩沖液（1）平衡液。20mmol/LHAc-NaAc、1.2mol/L硫酸銨、pH4.8。（2）洗脫液。40mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4、pH6.2。（3）再生液。1.0mol/LNaOH。（六）疏水層析264.層析操作流程再生液沖洗8倍柱床體積，流速30cm/h，用注射用水將其沖洗至中性，平衡液平衡6倍柱床體積，至流出液pH與平衡液一致。上樣流速60cm/h。上樣后用平衡液平衡6倍柱床體積，流速120cm/h。用洗脫液洗脫，流速60cm/h。收集A280＞300mAU的樣品峰。用再生液再生6倍柱床體積，流速30cm/h，用無菌水沖洗層析柱，至流出液pH為中性，長時(shí)間不用應(yīng)用20%乙醇浸泡。5.洗脫液標(biāo)準(zhǔn)測量收集液的OD280、OD260值，計(jì)算比值應(yīng)大于1.70，外觀澄清透明。（六）疏水層析27

將疏水層析洗脫峰收集液采用超濾方法進(jìn)行緩沖液置換，超濾條件為：膜包截留孔徑50kD，控制為進(jìn)口端壓力＜1.3bar，出口端壓力＜0.4bar，用置換緩沖液等體積稀釋8次，將疏水層析洗脫峰收集液濃縮至規(guī)定濃度以上，用0.22μm除菌濾器過濾后保存，保存條件為4℃。（七）置換緩沖液28

完成以上各個(gè)崗位的操作后，檢查、整理各項(xiàng)記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺(tái)和潔凈室。最后，填寫清場合格證。（八）清場29注意：請?jiān)谌蝿?wù)實(shí)施過程中規(guī)范填寫《抗HER2單克隆抗體純化操作記錄》，不可補(bǔ)填和篡改！知識(shí)學(xué)習(xí)反思與反饋學(xué)習(xí)成果實(shí)踐操作考核與評價(jià)30拓展任務(wù)白蛋白溶液透析法濃縮31課前查閱資料，了解白蛋白及其性質(zhì)。查閱設(shè)計(jì)《白蛋白溶液透析法濃縮操作記錄》，在任務(wù)實(shí)施過程中同步填寫。使用透析濃縮技術(shù)，將白蛋白溶液進(jìn)行10倍體積濃縮。設(shè)計(jì)實(shí)操設(shè)計(jì)（一）任務(wù)描述32（二）實(shí)訓(xùn)材料1.材料、試劑白蛋白溶液（采用紫外法測定蛋白濃度）、聚乙二醇（PEG）6000、透析袋（500～1000）2.儀器設(shè)備分析天平（感量0.01g）、磁力攪拌器、移液槍等33（三）實(shí)訓(xùn)操作34步驟一配制透析液配制35％濃度的聚乙二醇（PEG）6000溶液。步驟二制備濃縮蛋白液（1）透析袋的前處理。戴好P