細胞工程產(chǎn)酶

關(guān)于細胞工程產(chǎn)酶細胞結(jié)構(gòu)第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天微生物、植物、動物細胞特性比較細胞種類微生物細胞植物細胞動物細胞細胞大小（μm）1～1020～30010～100倍增時間（h）0.3～0.6>12>15培養(yǎng)要求簡單簡單復(fù)雜光照要求不要求大多數(shù)要求不要求對剪切力大多數(shù)不敏感敏感敏感主要產(chǎn)物酒精、酒類、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等色素、藥物、香精、酶等次級代謝產(chǎn)物疫苗、激素、單克隆抗體、酶等功能蛋白質(zhì)第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)4一、植物細胞特點體積大生長和代謝速率低營養(yǎng)要求簡單要求光照對剪切力敏感生產(chǎn)色素、藥物、香精和酶等次生代謝產(chǎn)物第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)5二、植物細胞培養(yǎng)的特點產(chǎn)率高周期短易于培養(yǎng)，減輕勞動強度產(chǎn)品質(zhì)量高第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)6三、植物細胞培養(yǎng)的工藝流程植物細胞培養(yǎng)技術(shù)首先從植物外植體中選育出植物細胞，再經(jīng)過篩選、誘變、原生質(zhì)體融合或DNA重組等技術(shù)而獲得優(yōu)良的植物細胞。然后，在人工控制條件的植物細胞反應(yīng)器中進行植物細胞培養(yǎng)，從而獲得代謝產(chǎn)物。植物細胞培養(yǎng)的一般工藝過程如下

: 細胞株建立——擴大培養(yǎng)——大罐培養(yǎng)第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)7（一）外植體的選擇和處理外植體是指從植株分離出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織和細胞培養(yǎng)的植物組織的小段或小塊。外植體首先要選擇無病蟲害、生長力旺盛、生長有規(guī)則的植株，如果植物細胞是用于生產(chǎn)次級代謝物，則需從產(chǎn)生該次級代謝物的組織部位中切取一部分組織，經(jīng)過清洗，除去表面的污物。將上述外植體切成

0.5～1cm左右的片段或小塊，用

70%～75%乙醇溶液或

5%次氯酸鈉、10%漂自粉、0.1%升汞溶液等進行消毒處理，再用無菌水充分漂洗，以除去殘留的消毒劑。第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)8（二）植物細胞的獲取植物細胞可以通過機械搗碎或酶解的方法直接從外植體中分離得到，也可以通過誘導(dǎo)愈傷組織而獲得，還可以通過分離原生質(zhì)體后再經(jīng)過細胞壁再生而獲取所需的植物細胞。通常采用愈傷組織誘導(dǎo)方法獲得所需的植物細胞。第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)91.直接分離法植物細胞可以直接從外植體中分離得到。從外植體直接分離植物細胞的方法通常有機械法和酶解法兩種。機械搗碎法分離植物細胞是先將葉片等外植體輕輕搗碎，然后通過過濾和離心分離細胞。酶解法分離細胞是用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離出具有代謝活性的細胞。第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)102.愈傷組織的誘導(dǎo)法

愈傷組織是一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細胞團。通過愈傷組織誘導(dǎo)法獲得植物細胞的基本過程如下：將含有一定量的生長素和分裂素的液體培養(yǎng)基中加入

0.7%～0.8%的瓊脂，制成半固體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。滅菌、冷卻后，將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃左右培養(yǎng)一段時間，即從外植體的切口部位長出小細胞團，此細胞團稱之為愈傷組織。一般培養(yǎng)

l～3周后，將愈傷組織分散接種于新的半固體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，以獲取更多的愈傷組織。第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)113.原生質(zhì)體再生法

原生質(zhì)使是除去細胞壁后得到的微球體。植物原生質(zhì)體可從培養(yǎng)的植物單細胞、愈傷組織和植物的組織、器官中獲得。植物原生質(zhì)體的分離方法一般有機械分離法和酶解法兩種，目前一般都采用酶解法分離原生質(zhì)體。第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)12（三）植物細胞培養(yǎng)1.高產(chǎn)細胞系的選擇2.植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3.提高植物細胞產(chǎn)酶量的方法第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)131.高產(chǎn)細胞系的選擇提高產(chǎn)率是植物細胞發(fā)酵生產(chǎn)次生物質(zhì)的主要目的。因此，選擇高產(chǎn)細胞株是培養(yǎng)和生產(chǎn)的前提。目前選擇高產(chǎn)細胞株的途徑主要有以下幾個方面：（1）材料選擇（2）克隆選擇（3）抗性選擇（4）誘導(dǎo)選擇（5）細胞融合和基因工程選擇第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)14（1）材料選擇一般來說，從具有高含量次生物質(zhì)酶的植物組織建立起來的細胞培養(yǎng)物能得到較高的產(chǎn)量，但也有不少相反結(jié)果的報道。Berlin和Sasse(1985)提出最好從不同遺傳來源的材料建立細胞培養(yǎng)物，然后再從中選擇。第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)15（2）克隆選擇在培養(yǎng)過程中，可能大部分的細胞由于生長迅速，酶積累較少，但也有少量的細胞可以積累較多的酶。因此，可以通過單細胞克隆或細胞團克隆技術(shù)將這些可以積累較多酶的細胞挑選出來培養(yǎng)成細胞系。這種選擇方法己在提高細胞系物質(zhì)含量的研究中得到廣泛的應(yīng)用。第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)16（3）抗性選擇選擇壓力篩選法是通過添加某些對不同的細胞有不同作用效果的物質(zhì)，淘汰部分敏感細胞，而選擇得到所需的細胞的選育方法。可以分為正選擇和負選擇兩種。正選擇就是把受選擇的細胞群體置于一定的選擇壓力之下，部分細胞在選擇壓力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗選擇壓力的細胞可以生長，從而選擇得到所需的細胞。正選擇適用于對抗性突變體的選擇。負選擇法也叫富集選擇法。在負選擇實驗中，選擇的對象是在一定選擇壓的作用下不能生長的那些細胞，而能夠生長的細胞受到淘汰。負選擇適用于對營養(yǎng)缺陷型突變體的選擇。第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)17（4）誘導(dǎo)選擇通過化學(xué)或物理誘變可以明顯提高突變率，篩選出高產(chǎn)細胞株。第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)18（5）細胞融合和基因工程選擇通過細胞融合方法以及基因工程的方法提高酶的含量。第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)19（6）高產(chǎn)系的選擇方法①目測法對于含色素的株系篩選具有通用性。②放射免疫法儀器貴、合成放射性標記抗原困難、安全性差等，應(yīng)用較少。③酶聯(lián)免疫法方便、快捷、靈敏，在大規(guī)模篩選中前景廣闊。④流動細胞熒光測定法局限于被測定細胞中目的酶在激光處理后能發(fā)出熒光。⑤流動細胞測定法限于測定能產(chǎn)生抑菌作用的次生產(chǎn)物的高產(chǎn)細胞系的篩選，需要選擇一種特異敏感菌。第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)202.植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基

用于培養(yǎng)植物細胞的培養(yǎng)基已發(fā)展了幾十年，尤其是最近30年才取得巨大進展。用于植物細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求，根據(jù)特定的植物種類和培養(yǎng)系統(tǒng)，基本營養(yǎng)成分可作適當?shù)母倪M。植物細胞的培養(yǎng)基組分比較復(fù)雜，但是培養(yǎng)基一般都含有碳源、氮源、無機鹽和生長因子等幾大類組分。第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)213.提高植物細胞產(chǎn)酶量的方法

在生產(chǎn)過程中為了獲得較高的產(chǎn)酶量，首先要選擇高產(chǎn)的培養(yǎng)材料，這在前面已經(jīng)提到。與微生物產(chǎn)酶類似，植物細胞培養(yǎng)中也可以采用調(diào)節(jié)溫度，調(diào)節(jié)pH，調(diào)節(jié)溶氧，調(diào)節(jié)光照，調(diào)節(jié)代謝途徑，控制細胞的生長和分化的程度，加入誘導(dǎo)物或前體等方法，根據(jù)植物細胞的特點，還可以采用毛狀根培養(yǎng)等技術(shù)提高產(chǎn)酶量。第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)22（1）溫度的控制植物細胞培養(yǎng)的溫度一般控制在室溫范圍(25℃左右)。溫度高，對植物細胞的生長有利，溫度低，則對次級代謝物的積累有利。但是通常不能低于20℃，也不要高于32℃。有些植物細胞的最適生長溫度和最適產(chǎn)酶溫度有所不同，要在不同的階段控制不同的溫度。第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)23（2）pH的控制植物細胞的pH一般控制在微酸性范圍，即pH5～6。培養(yǎng)基配制時，pH一般控制在pH5.5～5.8范圍。在植物細胞培養(yǎng)過程中，一般pH變化不大。第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)24（3）溶解氧的調(diào)節(jié)控制植物細胞的生長和產(chǎn)酶需要吸收一定的溶解氧。溶解氧一般通過通風(fēng)和攪拌來供給。適當?shù)耐L(fēng)氣攪拌還可以使植物細胞不至于凝集成較大的細胞團，以使細胞分散，分布均勻，有利于細胞的生長和新陳代謝。然而，由于植物細胞代謝較慢，需氧量不多，過量的氧反而會帶來不良影響，加上植物細胞體積大、較脆弱、對剪切力敏感，所以通風(fēng)和攪拌不能太強烈，以免破壞細胞。這在植物細胞反應(yīng)器的設(shè)計和實際操作中，都要予以充分注意。第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)25（4）光照的控制光照對植物細胞培養(yǎng)有重要影響。大多數(shù)植物細胞的生長以及酶的生產(chǎn)要一定波長光的照射，并對光照強度和光照時間有一定的要求。因此在植物細胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)當根據(jù)植物細胞的特性以及目的次級代謝物的種類不同去進行光照的調(diào)節(jié)控制。尤其是在植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)過程中，如何滿足植物細胞對光照的要求，是反應(yīng)器設(shè)計和實際操作中要認真考慮并有待研究解決的問題。第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（5）飼喂前體次級代謝產(chǎn)物的形成依賴于莽草酸、氨基酸和乙酸等3種主要原料的供應(yīng)。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天（6）誘導(dǎo)子應(yīng)用觸發(fā)形成植物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)子，加入誘導(dǎo)子可提高植物細胞次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量并可促進產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)28（7）毛狀根培養(yǎng)技術(shù)毛狀根是雙子葉植物受發(fā)根農(nóng)桿菌感染后產(chǎn)生的。感染過程中，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T－DNA轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，在不添加外源激素的條件下，不僅生長迅速，而且毛狀根具有器官化的特性，遺傳性、生理、生化特性穩(wěn)定，具有比懸浮細胞培養(yǎng)更強的酶合成能力。目前為止，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根的種類已達百種以上，其中，大多數(shù)都能檢測到接近于甚至高于原植株或其他培養(yǎng)物的酶產(chǎn)量。第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天4.植物細胞培養(yǎng)方法分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)30第九節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細胞的特性動物細胞培養(yǎng)的特點動物細胞的培養(yǎng)方式培養(yǎng)的工藝條件及其控制第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)31一、動物細胞的特性 沒有細胞壁，十分脆弱體積較大，略小于植物細胞具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性以及功能全能性營養(yǎng)要求復(fù)雜第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)32二、動物細胞培養(yǎng)的特點用于各種功能蛋白的生產(chǎn)細胞生長較慢需要添加抗生素體積大，無細胞壁，對剪切力敏感多數(shù)適宜帖壁培養(yǎng)，部分可以懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基成分復(fù)雜50代后即會退化死亡第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)33三、動物細胞的培養(yǎng)方式（一）貼壁培養(yǎng)（二）懸浮培養(yǎng)（三）微載體培養(yǎng)系統(tǒng)（四）包理培養(yǎng)（五）微囊化培養(yǎng)第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)34（一）貼壁培養(yǎng)分散的細胞總?cè)芤涸谂囵B(yǎng)器中往往要貼附于壁上，這叫細胞貼壁。原來是圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細胞就開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層，叫做單層細胞，這種培養(yǎng)的方法又叫單層細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)中有一個非常有趣的現(xiàn)象是細胞的接觸抑制。當貼壁生長的細胞生長到表面相互接觸時，就停止分裂增殖。長成單層的細胞經(jīng)過一段時間，一定須在重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，也就是傳代。第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)35（二）懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程，主要用于懸浮生長的細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。動物細胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于動物細胞的特點，如沒有細胞壁保護，不能耐受劇烈的攪拌和通氣。因此，在許多方面又與經(jīng)典的發(fā)酵有所不同。對于小規(guī)模培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細胞培養(yǎng)反應(yīng)器。有許多動物細胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)36（三）微載體培養(yǎng)系統(tǒng)滾瓶系統(tǒng)勞動強度大，單位體積提供細胞生長的表面積小，占用空間大，按體積計算細胞產(chǎn)率低，監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制。為了克服這些不利因素，1967年，vanWezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細胞。微載體是直徑為60～250μm的微珠。采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)動物細胞，細胞貼壁于微載體上，微載體(和細胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細胞逐漸生長成單層。這種模式，把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點。第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)37（四）包理培養(yǎng)包埋是一種固定化方式，包埋培養(yǎng)，對懸浮生長和貼壁依賴生長的細胞都適用，細胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強。對懸浮生長的細胞用海藻酸鈣包埋，對貼壁依賴生長細胞用膠原包埋。細胞固定化培養(yǎng)首先是用于微生物如酵母和細菌，由于其具有保護性強、能重復(fù)使用，易于連續(xù)操作，生長速率快，產(chǎn)品較純等優(yōu)點，而引起人們極大興趣。動物細胞和微生物細胞相比，生長較慢，成本高，因此，需要重復(fù)使用。動物細胞對機械剪切力敏感，固定化對細胞的保護促進了其應(yīng)用。第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)38（五）微囊化培養(yǎng)微囊化曾是一種酶的固定化技術(shù)。1987年Lim等發(fā)展了一種微囊化方法，實現(xiàn)了動物細胞的微囊化，它是在液體狀態(tài)和生理條件下制備的，基本上對細胞的生長條件改變不大，因此使包埋的細胞能夠成活，亦能培養(yǎng)生長。動物細胞微囊化后，與游離細胞比較，降低了培養(yǎng)時對細胞的剪切力。實際上微囊里面也是一種微小的培養(yǎng)環(huán)境與液體培養(yǎng)差不多，因而細胞生長良好，在培養(yǎng)過程中，微囊化也能提供很高的細胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。

第38頁,共44頁，2024年2月25日，星期天四、動物細胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基第39頁,共44頁，2024年2月25日，星期天酶發(fā)酵動力學(xué)40四、細胞培養(yǎng)1.原代細胞培養(yǎng)2.傳代細胞培養(yǎng)第40頁,共44頁，20