比率熒光檢測(cè)玉米赤霉烯酮

比率熒光檢測(cè)玉米赤霉烯酮【摘要】目的：基于羅丹明-環(huán)糊精（RhB@β-CDs）復(fù)合物的熒光增強(qiáng)效應(yīng)首次開發(fā)了一種操作簡(jiǎn)便、選擇性高的新型比率熒光探針，用于玉米赤霉烯酮（ZEN）的比率熒光檢測(cè)以及可視化檢測(cè)。方法：通過室溫下的簡(jiǎn)單脫水反應(yīng)使羅丹明B（RhB）與環(huán)糊精（β-CDs）結(jié)合在一起形成復(fù)合物RhB@β-CDs比率熒光探針，用于ZEN的定量檢測(cè)和可視化檢測(cè)。結(jié)果：這種新型RhB@β-CDs比率熒光探針對(duì)ZEN的檢測(cè)具有較高的靈敏度、良好的選擇性和顯著的可視化檢測(cè)效果。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，RhB@β-CDs比率熒光探針的熒光強(qiáng)度比I463/I574與ZEN濃度在0.4934~98.68μmol/L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，檢測(cè)限為147.2nmol/L。結(jié)論：因此，這種新型的RhB@β-CDs比率熒光探針被成功地應(yīng)用于啤酒和玉米中ZEN的檢測(cè)。所有樣品的回收率均在89.17%~101.7%范圍內(nèi)，結(jié)果令人滿意。本文首次提出了這種比率熒光可視化檢測(cè)ZEN的新方法?！娟P(guān)鍵詞】玉米赤霉烯酮；可視化檢測(cè)；羅丹明；比率熒光

DeterminationofZearalenonebyRatioFluorescence[Abstract]Objective:Basedonthefluorescenceenhancementeffectofrhodamine-cyclodextrins(RhB@β-CDs)complex,anovelratiofluorescentprobewithsimpleoperationandhighselectivitywasdevelopedforthefirsttimeforratiofluorescencedetectionandvisualdetectionofzearalenone(ZEN).Methods:RhodamineB(RhB)wascombinedtocyclodextrins(β-CDs)byasimpledehydrationreactionatroomtemperaturetoformacomplexRhB@β-CDsratiofluorescentprobeforquantitativeandvisualdetectionofZEN.Results:Thismethodhashighsensitivity,goodselectivityandsignificantvisualeffectforthedetectionofZEN.Undertheoptimalexperimentalconditions,thefluorescenceintensityoftheRhB@β-CDsratiofluorescentprobewaslinearbetweenI463/I574andZENconcentrationintherangeof0.4934to98.68μmol/L,withadetectionlimitof147.2nmol/L.Conclusion:Therefore,thisnovelRhB@β-CDsratiofluorescentprobewassuccessfullyappliedforthedetectionofZENinbeerandmaize.Therecoveriesofallsampleswereintherangeof89.17%to101.7%,withsatisfactoryresults.Inthispaper,anewratiofluorescencevisualdetectionmethodforZENisproposedforthefirsttime.[Keywords]ZearalenoneVisualdetectionRhodamineRatiofluorescence

目錄1前言 11.1玉米赤霉烯酮的研究現(xiàn)狀 11.1.1玉米赤霉烯酮的概述 11.1.2玉米赤霉烯酮的代謝 21.1.3玉米赤霉烯酮的毒性 21.1.4玉米赤霉烯酮的脫毒 31.2玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法 31.2.1薄層層析法 31.2.2高效液相色譜法 41.2.3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 41.2.4免疫學(xué)檢測(cè)方法 41.2.5其他分析方法 51.3化學(xué)傳感器檢測(cè)法 51.3.1化學(xué)傳感器的概述 51.3.2化學(xué)傳感器檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn) 51.3.3化學(xué)傳感器的選擇 61.4熒光納米材料 61.4.1熒光納米材料的概述 61.4.2熒光納米材料的優(yōu)點(diǎn) 71.4.3熒光納米材料的應(yīng)用 71.5熒光納米材料的合成 71.5.1凝膠-燃燒法 71.5.2溶劑熱法 81.5.3過飽和結(jié)晶法 81.5.4微流控技術(shù)法 81.6RhB@β-CDs探針 91.6.1羅丹明的概述 91.6.2RhB@β-CDs的合成 91.6.3RhB@β-CDs的檢測(cè)機(jī)理 101.7本論文的選題依據(jù)及研究意義 101.7.1本論文的選題依據(jù) 101.7.2本論文的研究意義 102實(shí)驗(yàn) 112.1實(shí)驗(yàn)試劑 112.2實(shí)驗(yàn)儀器 122.3合成RhB@β-CDs 122.4玉米赤霉烯酮的熒光測(cè)定 122.5實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 133結(jié)果與討論 143.1材料表征 143.2RhB@β-CDs的合成條件 143.3檢測(cè)體系pH的考察 153.4反應(yīng)時(shí)間的考察 163.5定量和可視化檢測(cè) 173.6熒光檢測(cè)的機(jī)制 183.7抗干擾能力的考察 193.8穩(wěn)定性和重復(fù)性調(diào)查 203.9實(shí)際樣品檢測(cè) 224結(jié)論 23參考文獻(xiàn) 24致謝 29

1前言真菌毒素是指由真菌，特別是霉菌產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物REF_Ref16142\r\h[1]。同一種真菌可能產(chǎn)生多種真菌毒素，與此同時(shí)，多種不同的真菌也可能產(chǎn)生同一種真菌毒素REF_Ref16204\r\h[2]。真菌毒素?fù)碛胸S富的化學(xué)、生物學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)，均可損傷DNA以及產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而表現(xiàn)出致癌作用、免疫抑制、遺傳毒性、肝腎毒性和生殖紊亂等毒性作用REF_Ref18758\r\h[3]。據(jù)報(bào)道，全世界每年有25%左右的農(nóng)產(chǎn)品受到了真菌毒素的污染，且2%左右的糧食失去食用價(jià)值，給人們帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失REF_Ref13990\r\h[4]。食品及中藥材的生產(chǎn)及儲(chǔ)存等一系列過程中，都有可能產(chǎn)生或者引入真菌毒素，并且這些被污染的食物或中藥材可直接或間接順著食物鏈傳遞給消費(fèi)者，對(duì)人類的身體健康與生命安全造成威脅。因此，消費(fèi)者們?cè)絹碓蕉嗟膶㈥P(guān)注點(diǎn)置于食品安全之上，并且企業(yè)和機(jī)構(gòu)也越來越重視精確檢測(cè)以及減少食品和藥材中的真菌毒素REF_Ref29453\r\h[5]。當(dāng)下，建立科學(xué)、高效、簡(jiǎn)便的真菌毒素檢測(cè)分析技術(shù)對(duì)食品和中藥材中真菌毒素的監(jiān)測(cè)和防控具有重要意義，對(duì)于保障人類生命健康也具有重要意義REF_Ref14686\r\h[6]。隨著國內(nèi)外對(duì)真菌毒素的深入研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)食品及中藥材安全威脅最大的真菌毒素為黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等REF_Ref29453\r\h[5]。在此基礎(chǔ)上，本文以ZEN為研究對(duì)象，開發(fā)了一種新的靈敏高效且簡(jiǎn)便的ZEN檢測(cè)方法。1.1玉米赤霉烯酮的研究現(xiàn)狀1.1.1玉米赤霉烯酮的概述玉米赤霉烯酮（ZEN），又稱為F-2毒素，屬于一種非甾體類雌激素類真菌毒素REF_Ref3260\r\h[7]，由禾谷鐮刀菌、木賊鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等多種鐮刀菌屬通過聚酮途徑生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物REF_Ref2269\r\h[8,REF_Ref16384\r\h9]REF_Ref2269\r\h，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC）列為具有嚴(yán)重生殖毒性的第3類致癌物REF_Ref16384\r\h[9]。ZEN是真菌毒素中造成糧食谷物污染中范圍最廣的毒素之一，廣泛存在于玉米、大麥、水稻、高粱等農(nóng)作物及其制品中REF_Ref17380\r\h[10]。當(dāng)ZEN隨著糧食等進(jìn)入食物鏈并沿著食物鏈流向動(dòng)物或人類時(shí)，會(huì)導(dǎo)致人體生殖功能、免疫功能等受損，嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類的健康。為了確保食品安全，我國糧食及其農(nóng)副產(chǎn)品中ZEN的最大殘留量規(guī)定為60μg/kgREF_Ref17723\r\h[11]。ZEN在根及根莖類、果實(shí)種子類中藥材中也存在較廣泛的污染情況，其中ZEN給富含油脂類的果實(shí)種子類中藥材帶來的污染最嚴(yán)重REF_Ref12953\r\h[12]。因此，開發(fā)一種方便靈敏高效的ZEN檢測(cè)方法對(duì)食品及中藥材安全有重要意義。1.1.2玉米赤霉烯酮的代謝玉米赤霉烯酮（結(jié)構(gòu)式見圖1-1），為取代的2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯REF_Ref2269\r\h[8]，分子式為C18H22O5，純品為白色晶體，具有弱極性，不溶于水、四氯化碳等溶劑，但可溶于堿性水溶液REF_Ref3260\r\h[7]和乙醚、甲醇等有機(jī)溶劑。ZEN在堿性的溶液中，酯鍵可發(fā)生水解反應(yīng)，內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，當(dāng)pH降低時(shí)，又可以發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)，即此反應(yīng)為可逆反應(yīng)。研究表明，ZEN在畜禽體內(nèi)主要發(fā)生兩步代謝反應(yīng)。第一步為羥基化反應(yīng)，發(fā)生在肝臟等器官，生成四種代謝產(chǎn)物，包括α-玉米赤霉醇（α-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）；第二步為結(jié)合反應(yīng)，即第一步中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與尿和膽汁中的葡萄糖醛酸相結(jié)合，結(jié)合產(chǎn)物可隨尿液或糞便排出體外REF_Ref3260\r\h[7]。但研究表明，ZEN及其代謝物在體內(nèi)存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象，因此，它們?cè)谘褐芯哂休^長的半衰期REF_Ref13763\r\h[13]。圖1-1玉米赤霉烯酮的結(jié)構(gòu)式REF_Ref2269\r\h[7]1.1.3玉米赤霉烯酮的毒性研究表明，ZEN及其衍生物具有生殖毒性、肝腎毒性、免疫毒性、遺傳毒性REF_Ref10117\r\h[14]、致腫瘤毒性REF_Ref18980\r\h[15]等。生殖毒性指ZEN及其衍生物通過干擾生殖細(xì)胞的分化及胚胎細(xì)胞的發(fā)育而阻礙排卵、產(chǎn)生精子等正常的生殖功能。肝腎毒性是指ZEN及其衍生物能引起肝腎組織發(fā)生病變。免疫毒性指ZEN及其衍生物能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖，降低機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白（Ig）的含量，從而抑制機(jī)體的免疫功能。遺傳毒性是指ZEN及其衍生物通過破壞脫氧核糖核苷酸（DNA）的結(jié)構(gòu)，阻礙細(xì)胞周期，而影響了細(xì)胞的完整性以及抑制了細(xì)胞的增殖。致腫瘤毒性是指ZEN及其衍生物能刺激某些組織和某些器官細(xì)胞的異常增殖，從而形成腫瘤。1.1.4玉米赤霉烯酮的脫毒ZEN具有毒性較強(qiáng)、危害較大、污染范圍廣、體內(nèi)滯留時(shí)間較長等特點(diǎn)，威脅著動(dòng)物和人類生命健康安全，如何脫除ZEN的污染是研究的熱點(diǎn)REF_Ref12953\r\h[12]。迄今為止，國內(nèi)外的眾多研究學(xué)者們開發(fā)了許多脫除ZEN毒性的方法且已被應(yīng)用于食品中ZEN的清除，我們所熟知的對(duì)ZEN的脫毒技術(shù)主要包括物理法、化學(xué)法、生物技術(shù)法REF_Ref10117\r\h[14,REF_Ref11666\r\h16]REF_Ref12370\r\h。物理法又可進(jìn)一步分為機(jī)械脫除法、熱處理法、吸附法、輻照法，均可有效降低食品中ZEN含量，但具有一定的局限性?；瘜W(xué)法指ZEN與某些特定的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而降低或消除ZEN毒性，但可能引入新的有毒物質(zhì)。生物技術(shù)法，可分為微生物吸附法和微生物降解法REF_Ref11666\r\h[16]。相比于其他方法，微生物降解法具有高效、綠色環(huán)保、不破壞營養(yǎng)成分、對(duì)食品和中藥材造成的損失少等優(yōu)點(diǎn)。1.2玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法迄今為止，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)開發(fā)了多種用于靈敏檢測(cè)ZEN的分析方法，常見的包括高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）REF_Ref11804\r\h[17]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）REF_Ref16074\r\h[18]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）REF_Ref2038\r\h[19]等。雖然這些方法顯示出高靈敏度，但它們需要昂貴的儀器、熟練的人員和復(fù)雜的樣品處理程序。因此，國內(nèi)外研究人員一直都在探索更優(yōu)的檢測(cè)方法的路上，并且不斷的對(duì)這些技術(shù)改進(jìn)和創(chuàng)新。1.2.1薄層層析法薄層層析法（ThinLayerChromatography，TLC）較早便應(yīng)用于分析檢測(cè)ZEN，也是國家標(biāo)準(zhǔn)中用于檢測(cè)飼料中ZEN的方法之一REF_Ref25299\r\h[20]。謝賢慶REF_Ref30063\r\h[21]等利用此分析方法對(duì)引起豬中毒的霉變飼料中的ZEN進(jìn)行了檢測(cè)。他們首先對(duì)樣品進(jìn)行了一系列的預(yù)處理后得到了樣液，然后將此樣液點(diǎn)樣于硅膠板上，展開后于紫外光下（波長為365nm）觀察藍(lán)綠色熒光點(diǎn)并與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較定量，檢測(cè)出了ZEN的含量為2000ug/kg。此分析方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低、可定性定量判斷等優(yōu)點(diǎn)，但需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品預(yù)處理、耗時(shí)較長、易受主觀判斷的影響、準(zhǔn)確度及靈敏度較差。因此，應(yīng)用受到一定限制，現(xiàn)在較少采用此法測(cè)定ZEN。1.2.2高效液相色譜法董梅等REF_Ref11804\r\h[17]發(fā)表了一篇研究報(bào)告，介紹了他們運(yùn)用HPLC測(cè)定了小麥粉、醬油、大豆油和白酒中ZEN的含量。他們采用十八烷基鍵合硅膠（C18）作為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水-甲醇，結(jié)合熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)還分別進(jìn)行了檢出限、定量限、精密度以及回收率的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZEN在5~250ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996，回收率為83.20%~99.09%，同時(shí)具有優(yōu)異的檢測(cè)限和定量限。此分析方法具有靈敏高效、快速準(zhǔn)確、精密度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是此法分析成本較高，溶劑用量大，分析時(shí)間較長。1.2.3液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合起來進(jìn)行含量測(cè)定的分析方法，即為LC-MS法。丁雪瑤等REF_Ref16074\r\h[18]利用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC–MS/MS）測(cè)定了動(dòng)物源性食品中ZEN殘留量，他們以C18為色譜柱，0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，采用質(zhì)譜電噴霧電離源（ESI）進(jìn)行正離子掃描，并利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式監(jiān)測(cè)，最后以外標(biāo)法進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮在1~100ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0ng/g，回收率在76.1%~87.22%之間。此分析方法具有靈敏高效、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是成本高、前處理復(fù)雜且檢測(cè)時(shí)間長。1.2.4免疫學(xué)檢測(cè)方法免疫學(xué)檢測(cè)方法的檢測(cè)原理主要是基于抗原抗體反應(yīng)，主要包括化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、免疫沉淀（IP）、免疫層析方法（LFIA）、膠體金免疫層析法（CGIA）、免疫吸附測(cè)定法等REF_Ref25299\r\h[20]。且免疫吸附測(cè)定法中的酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）REF_Ref302\r\h[22]是當(dāng)下最常用于檢測(cè)ZEN的方法之一，其具有檢測(cè)方便、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點(diǎn)，多被運(yùn)用于批量檢驗(yàn)。此檢測(cè)方法是檢測(cè)真菌毒素的簡(jiǎn)單、快速和有效的方法。但抗體或酶是通過昂貴而繁瑣的過程獲得的，這些過程也容易受到環(huán)境的影響，導(dǎo)致檢測(cè)性能差。1.2.5其他分析方法超高效液相色譜法（UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC）REF_Ref18696\r\h[23]具有專屬性強(qiáng)、樣品處理簡(jiǎn)單、靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，且與高效液相色譜法相比，此分法方法分析效果更佳、分析速度更快、分離度更好、溶劑用量少。氣相色譜法（GasChromatography，GC）REF_Ref18705\r\h[24]可定量定性分析ZEN，具有靈敏準(zhǔn)確、回收率好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但儀器成本高且在分析前需要對(duì)ZEN進(jìn)行衍生化且衍生化難度高，從而限制了此分析方法對(duì)于ZEN的實(shí)際應(yīng)用。膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳（MicellarElectrokineticCapillaryChromatography，MEKC）REF_Ref18712\r\h[25]具有靈敏度高、準(zhǔn)確精密等優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理較復(fù)雜，有待于進(jìn)一步簡(jiǎn)化。1.3化學(xué)傳感器檢測(cè)法1.3.1化學(xué)傳感器的概述化學(xué)傳感器是指能夠通過受體與陽離子、陰離子或分子之間產(chǎn)生的相互作用而將待測(cè)物質(zhì)的濃度信息轉(zhuǎn)換為光學(xué)信號(hào)或電化學(xué)信號(hào)，從而用于分析檢測(cè)的一類化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)裝置，且一般由識(shí)別基團(tuán)和信號(hào)單元兩個(gè)部分通過直接相連或間隔臂相連的方式連接而成REF_Ref12155\r\h[26]。目前，應(yīng)用較廣以及研究較為熱門的化學(xué)傳感器包括熒光化學(xué)傳感器REF_Ref21988\r\h[27]、比色化學(xué)傳感器REF_Ref26200\r\h[28]、光電化學(xué)傳感器REF_Ref21978\r\h[29]、針型化學(xué)傳感器REF_Ref21981\r\h[30]等。其中，熒光化學(xué)傳感器是指利用待檢測(cè)物質(zhì)與某種熒光分子或材料產(chǎn)生特定的相互作用后，改變了待檢測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度或所發(fā)射的熒光波長REF_Ref21988\r\h[27]，而實(shí)現(xiàn)定性定量分析的一種方法。1.3.2化學(xué)傳感器檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)熒光化學(xué)傳感器具有成本低、選擇性高、靈敏度高、分析快速高效，且可用于連續(xù)的在線監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在食品、藥品、環(huán)境監(jiān)測(cè)等眾多研究領(lǐng)域有可觀的應(yīng)用價(jià)值REF_Ref12155\r\h[26]。比色傳感器具有操作簡(jiǎn)單、分析快速、儀器成本低、可視化檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，在金屬離子的現(xiàn)場(chǎng)診斷等研究領(lǐng)域有著可觀的應(yīng)用價(jià)值REF_Ref26200\r\h[28]。光電化學(xué)傳感器具有成本低、靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單且易于小型化等優(yōu)點(diǎn)，在藥物分析等研究領(lǐng)域具有可觀的發(fā)展?jié)摿EF_Ref7530\r\h[31]。針型化學(xué)傳感器具有操作簡(jiǎn)便、輕巧便攜、創(chuàng)口微小、可實(shí)現(xiàn)在體深部實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在中醫(yī)針灸等研究領(lǐng)域具有可觀的發(fā)展?jié)摿EF_Ref21981\r\h[30]。1.3.3化學(xué)傳感器的選擇基于適配體的熒光傳感器是目前用于檢測(cè)ZEN的常用方法REF_Ref24391\r\h[32]，其中核酸適配體具有結(jié)構(gòu)可控、修飾簡(jiǎn)便，且具有可比的結(jié)合親和力和特異性等吸引人的特點(diǎn)，但是核酸適配體價(jià)格也較為昂貴，不適于大規(guī)模生產(chǎn)和普及使用，因此限制了其的實(shí)際應(yīng)用。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)熒光納米探針具有靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間快、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)越特性REF_Ref3851\r\h[33]。且與單波長熒光探針相比，比率熒光探針可以通過自身兩個(gè)發(fā)射波長的自校準(zhǔn)來消除復(fù)雜環(huán)境的干擾。該內(nèi)部基準(zhǔn)可以消除激發(fā)光波動(dòng)的影響REF_Ref3868\r\h[34]，因此，比率熒光納米探針可以提高傳感器的精度，是化學(xué)傳感器中常用的技術(shù)之一。本文便是選擇采用比率熒光納米探針用于檢測(cè)ZEN。1.4熒光納米材料1.4.1熒光納米材料的概述隨著人們對(duì)納米技術(shù)的深入探索以及納米技術(shù)快速的發(fā)展，人們通過一定的技術(shù)便制備出了一系列具有獨(dú)特光學(xué)特性的納米材料，即熒光納米材料。熒光是指熒光物質(zhì)吸收外界高能光輻射后，導(dǎo)致內(nèi)部電子從基態(tài)躍遷到了激發(fā)態(tài)，而后當(dāng)電子從最低單重態(tài)激發(fā)狀態(tài)通過自旋允許的輻射躍遷回到其單重基態(tài)REF_Ref8103\r\h[35]時(shí)，所發(fā)射的光。納米材料，是指以三維中至少有一維結(jié)構(gòu)處于納米數(shù)量級(jí)（1~100nm）的晶態(tài)或非晶態(tài)超微粒為基本結(jié)構(gòu)單元所構(gòu)成的材料REF_Ref8109\r\h[36]。熒光納米材料主要可以分為半導(dǎo)體量子點(diǎn)（Quantumdots，QDs）、貴金屬納米簇、有機(jī)小分子聚合物或者聚集形成的熒光納米粒子和復(fù)合型熒光納米粒子REF_Ref8629\r\h[37]。1.4.2熒光納米材料的優(yōu)點(diǎn)熒光納米材料具有納米材料的優(yōu)點(diǎn)，即納米材料的低毒性以及良好的生物相容性等，又同時(shí)兼具優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，即具有優(yōu)良的發(fā)光和光轉(zhuǎn)化性能。除此之外，熒光納米材料還具有制備方法簡(jiǎn)單且操作可控，原料價(jià)格便宜且易于獲得等優(yōu)點(diǎn)。與其他染料相比，熒光納米材料具有量子產(chǎn)率高、發(fā)光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄等優(yōu)點(diǎn)，可通過組裝和修飾提高其生物相容性、豐富識(shí)別傳感等功能。同時(shí)，熒光納米材料應(yīng)用于分析檢測(cè)時(shí)，具有檢出限好,特異性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)REF_Ref8632\r\h[38]。1.4.3熒光納米材料的應(yīng)用熒光納米材料因其優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)、安全可靠且易于制備，目前被廣泛地應(yīng)用于生物成像、生物傳感、藥物傳遞、臨床診斷等諸多的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?，F(xiàn)有研究表明某些新型熒光納米材料可應(yīng)用于潛在指紋的顯現(xiàn)，因此在法庭科學(xué)領(lǐng)域中也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值REF_Ref8635\r\h[39]。新的研究表明，熒光納米材料可作為生物傳感器進(jìn)行病原微生物的檢測(cè)REF_Ref8638\r\h[40]；可制成具靶向性的量子點(diǎn)納米探針，用于實(shí)際腫瘤靶向檢測(cè)REF_Ref8648\r\h[41]；還可作為功能化熒光納米材料用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記成像、固定與分離、相互作用研究及快速分析檢測(cè)REF_Ref8652\r\h[42]等。本文便是利用其在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，制備了一種羅丹明熒光納米復(fù)合粒子，作為比率熒光探針用于檢測(cè)ZEN。1.5熒光納米材料的合成隨著熒光納米材料的應(yīng)用及所涉及的領(lǐng)域越來越廣，國內(nèi)外已開發(fā)出了化學(xué)氧化法、燃燒法、水熱法、微波法、共沉淀法等一系列熒光納米材料的制備方法，但這些制備方法所得的熒光納米材料可能存在一些缺陷，如產(chǎn)率低、熒光性能差、粒度不均勻等REF_Ref9412\r\h[43]。近年來，人們也不斷創(chuàng)新，提出了許多更為優(yōu)良的制備方法。1.5.1凝膠-燃燒法燃燒法REF_Ref9425\r\h[44]，又稱為燃燒合成法，是指利用物質(zhì)反應(yīng)熱的自傳導(dǎo)作用，在瞬間形成化合物的一種高溫合成法。此法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速，但反應(yīng)劇烈、不易控制、產(chǎn)品收集不便。溶膠-凝膠法REF_Ref9432\r\h[45]是指先經(jīng)過水解、縮聚、膠溶、膠凝、干燥等過程得到前驅(qū)物后，再將前驅(qū)物在較低溫度下進(jìn)行焙燒的一種熒光納米材料制備方法。此法無需高溫、反應(yīng)較緩、速度可控、操作靈活多樣，可以通過適當(dāng)改變反應(yīng)條件而得到粒徑分布均勻且純度高的產(chǎn)品。基于上述觀點(diǎn)，夏國棟等REF_Ref9425\r\h[44]提出了采用溶膠-凝膠法和燃燒法相結(jié)合的熒光納米材料的制備工藝，即凝膠-燃燒法，可使得反應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行，且在短時(shí)間內(nèi)就可以得到高品質(zhì)的熒光納米材料。1.5.2溶劑熱法溶劑熱法（SolventThermography）是在水熱法的基礎(chǔ)上應(yīng)運(yùn)而生的一種制備熒光納米材料的方法，區(qū)別在于溶劑熱法以有機(jī)溶劑或非水溶媒為溶劑，使得此法優(yōu)于水熱法，可用于制備易氧化、遇水不穩(wěn)定的熒光納米材料REF_Ref28166\r\h[46]。黃婷REF_Ref28002\r\h[47]研究團(tuán)隊(duì)就是采用溶劑熱法，在220℃的條件下，以六水硝酸釓的無水乙醇溶液和升華硫?yàn)樵?，分別作為釓源和硫源，乙二胺（Ethanediamine，EDA）為溶劑，制備了納米Gd2O2S∶Eu3+發(fā)光粉。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此合成法可有效地控制產(chǎn)品晶體的形狀與尺寸且產(chǎn)品具有良好的分散度。此外，溶劑熱法制備熒光納米材料還具有操作簡(jiǎn)單、耗能少、綠色環(huán)保、反應(yīng)易控等優(yōu)點(diǎn)。1.5.3過飽和結(jié)晶法丁楊REF_Ref9422\r\h[48]發(fā)表的一篇電子期刊介紹了其采用一種新型的過飽和重結(jié)晶法制備了硫化鎘量子點(diǎn)以及同時(shí)采用此法制備了稀土摻雜納米晶。合成過程中，采用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作為溶劑，以硫化鈉（Na2S）和乙酸鎘（Cd(Ac)2）為原料，分別作為硫源和鎘源，并為了可以更好的控制量子點(diǎn)的形狀而加入了適量的油胺（OAm）和油酸（OA）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過此法制得的熒光納米材料具有結(jié)晶性好、量子效率高、分散性好、粒徑均一、熱化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且此法還具有反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)易、產(chǎn)量較高、綠色環(huán)保、安全可靠、無需高溫和使用惰性氣體等優(yōu)點(diǎn)。1.5.4微流控技術(shù)法李子洋REF_Ref9412\r\h[43]研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表了的一篇關(guān)于微流控技術(shù)制備熒光納米材料的研究報(bào)告。報(bào)告中指出微流控技術(shù)是指使用數(shù)十到數(shù)百微米的微管道來處理或控制微量流體的一門技術(shù)，還分析了不同反應(yīng)器制備熒光納米材料的優(yōu)缺點(diǎn)以及一些國內(nèi)外研究人員利用不同反應(yīng)器制備了不同的熒光納米材料的典型例子。研究表明，此法制備熒光納米材料，可以通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)控某些參數(shù)，制備出具有特定形狀、粒徑均一且粒度分布更窄、分散性能更優(yōu)、熒光性能更佳的熒光納米材料，且此法還具有反應(yīng)安全性高、試劑用量少、傳熱效率高、可連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)。1.6RhB@β-CDs探針1.6.1羅丹明的概述羅丹明B（RhodamineB，RhB）是一系列在生物分析中廣泛使用的熒光團(tuán)，是一種常用的的堿性熒光染料，具有易合成，成本低、易溶解、色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)REF_Ref24330\r\h[49,REF_Ref29296\r\h50]。雖然此類化合物具有優(yōu)異的光物理特性，例如長吸收和發(fā)射波長以及高熒光量子產(chǎn)率REF_Ref11932\r\h[51]，但許多基于羅丹明的熒光探針存在一些局限性，例如熒光弱REF_Ref30103\r\h[52]、熒光關(guān)閉REF_Ref30110\r\h[53]、選擇性差REF_Ref12030\r\h[54]、不可逆檢測(cè)過程REF_Ref30116\r\h[55]，以及不適用于生物系統(tǒng)REF_Ref30123\r\h[56]。所以目前對(duì)羅丹明的應(yīng)用主要在于部分取代的羅丹明衍生物REF_Ref17518\r\h[57]。本文便是制備了復(fù)合物羅丹明-環(huán)糊精（RhB@β-CDs），作為比率熒光探針檢測(cè)ZEN。1.6.2RhB@β-CDs的合成本文通過室溫下的簡(jiǎn)單脫水反應(yīng)使RhB與環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CDs）結(jié)合在一起形成復(fù)合物RhB@β-CDs比率熒光探針（見圖1-2），用于比率熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)ZEN。圖1-2RhB@β-CDs比率熒光探針的合成1.6.3RhB@β-CDs的檢測(cè)機(jī)理ZEN與RhB@β-CDs比率熒光探針結(jié)合之后，使λem=463nm處的熒光增強(qiáng)，而λem=574nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減弱（見圖1-3），此機(jī)制為ZEN的定量和視覺檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。圖1-3RhB@β-CDs比率熒光探針檢測(cè)ZEN的機(jī)理1.7本論文的選題依據(jù)及研究意義1.7.1本論文的選題依據(jù)ZEN是真菌毒素中造成食品和中藥材污染最常見的毒素之一，嚴(yán)重危害著動(dòng)物和人類健康，因此需要開發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確和檢測(cè)成本低的檢測(cè)方法。據(jù)我們所知，到目前為止，還沒有關(guān)于不經(jīng)過適配體標(biāo)記的用于熒光傳感ZEN的比率熒光探針的報(bào)告，且人眼對(duì)顏色變化的敏感性遠(yuǎn)大于對(duì)亮度變化的敏感性REF_Ref31311\r\h[58]?；谝陨纤伎迹菊撐慕⒘艘环N以羅丹明為參考信號(hào)的比率熒光探針用于ZEN的可視化檢測(cè)。1.7.2本論文的研究意義本實(shí)驗(yàn)的研究意義在于成功建立了一種新型的RhB@β-CDs比率熒光探針用于定量及可視化檢測(cè)ZEN的方法，為ZEN的檢測(cè)提供了新的思路，也為食品和中藥材中ZEN的檢測(cè)提供了一種新的快速分析方法。

2實(shí)驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)試劑本實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑如表2-1所示。表2-1實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱純度生產(chǎn)廠商羅丹明B（RhB）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司玉米赤霉烯酮（ZEN）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司苯丙氨酸（Phe）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司纈氨酸（Val）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司半胱氨酸（Cys）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司色氨酸（Trp）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司甘氨酸（Gly）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司肌氨酸（Sar）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司酪氨酸（Tyr）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司組氨酸（His）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司谷氨酸（Glu）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司葡萄糖（Glucose，Glc）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司4-二甲氨基吡啶（DMAP）分析純上海麥克林生化技術(shù)有限公司β-環(huán)糊精（β-CDs）分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司冰醋酸分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司甲醇分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸銀分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鋇分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鈣分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸銅分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司續(xù)表2-1實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱純度生產(chǎn)廠商硝酸鉀分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鎂分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鋅分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鉛分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸錳分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硝酸鈉分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司硫酸鈉分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司氯化鈉分析純天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司鹽酸（HCl）分析純廣州化學(xué)試劑廠氫氧化鈉（NaOH）分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司2.2實(shí)驗(yàn)儀器本實(shí)驗(yàn)主要的實(shí)驗(yàn)儀器如下，采用傅里葉變換紅外光譜儀（ThermoScientificiN10，美國）分析合成的RhB@β-CDs的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，采用熒光分光光度計(jì)（SHIMADZURF-5301PC，日本）測(cè)定ZEN的熒光光譜。2.3合成RhB@β-CDs將0.03gRhB、3.0gβ-CDs、4.0gDCC和0.250gDMAP加入到30mLDMF中，室溫條件下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，留下濾液，往濾液中加90mL冰甲醇析出沉淀，抽濾之后，取沉淀再用20mLDMF溶解，然后再次加60mL冰甲醇析出沉淀，如此重復(fù)3次。最后抽濾，取沉淀，于60℃烘箱中干燥過夜得到RhB@β-CDs。2.4玉米赤霉烯酮的熒光測(cè)定基于RhB@β-CDs的ZEN檢測(cè)按照以下程序進(jìn)行。首先，將3.0g的RhB@β-CDs加入到30.0mL的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=6）中，均勻混合后，作為RhB@β-CDs儲(chǔ)備液（100mg/mL）。然后制備3.947mmol/LZEN儲(chǔ)備液。吸取180μL的RhB@β-CDs儲(chǔ)備液加入到2.0mL的離心管中，分別加入不同體積的ZEN溶液（10~200.0μL）（需要再稀釋ZEN儲(chǔ)備液）。然后，用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=6）將混合溶液稀釋至2.0mL，最終得到的ZEN濃度范圍為0.4934~394.7μmol/L。在室溫下孵育20min后得到測(cè)試溶液，分別轉(zhuǎn)移至熒光比色皿中，然后設(shè)置儀器參數(shù)：激發(fā)狹縫為3nm，發(fā)射狹縫為5nm，激發(fā)波長為335nm，熒光發(fā)射光譜檢測(cè)范圍為350~700nm，進(jìn)行熒光檢測(cè)。為了進(jìn)行ZEN的可視化檢測(cè)，按上述方法于2.0mL的離心管中制備ZEN濃度范圍為0.4934~394.7μmol/L的待檢溶液。用手機(jī)相機(jī)在黑暗環(huán)境下的紫外燈（365nm）照射下拍攝各個(gè)ZEN濃度的待檢溶液的照片，以記錄熒光顏色的變化。2.5實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定所制備的比率熒光探針分別用于測(cè)定從本地超市購買來的啤酒和玉米樣品中的ZEN。啤酒樣品溶液的制備方法如下：將樣品啤酒于4℃冰箱中冷藏30min，取出超聲20min。然后稱取5g啤酒樣品于10mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻。量取2mL溶液，用0.22μm濾膜過濾，取濾液作為啤酒樣品溶液。玉米樣品溶液的制備方法如下：首先將生玉米粒置于研缽中碾碎，倒出混懸液，稱取5g于燒杯中，加入20mL70%甲醇，超聲提取10min。然后用定量濾紙過濾，量取2mL續(xù)濾液，作為玉米樣品溶液。隨后，為了有效地避免啤酒和玉米的內(nèi)源性熒光對(duì)探針的干擾，將所得樣品液用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=6）稀釋100倍后，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：取1.8mL稀釋后的啤酒和玉米樣品溶液，分別加入10.0、40.0uL的98.68μmol/LZEN儲(chǔ)備液和30.0uL的3.947mmol/LZEN儲(chǔ)備液以及180μL的RhB@β-CDs儲(chǔ)備液，用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=6）稀釋至2.0mL，孵育20min后進(jìn)行熒光和可視化檢測(cè)。3結(jié)果與討論3.1材料表征采用FT-IR光譜鑒定了RhB@β-CDs比率熒光探針上的官能團(tuán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，已成功合成了RhB@β-CDs比率熒光探針。3.2RhB@β-CDs的合成條件為了得到最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)RhB@β-CDs比率熒光探針的合成物料比進(jìn)行了考察，固定β-CDs的用量為3.0g，分別合成了加入20mg、25mg、30mg、35mg、40mgRhB的RhB@β-CDs比率熒光探針。如圖3-1所示，為不同RhB加入量的RhB@β-CDs比率熒光探針溶液分別加入相同體積的98.68μmol/LZEN儲(chǔ)備液后得到的的熒光發(fā)射圖譜。且當(dāng)RhB加入量為20mg時(shí)，RhB@β-CDs比率熒光探針溶液的熒光顏色較弱，不適于可視化檢測(cè)。隨著RhB加入量的增加，RhB@β-CDs比率熒光探針的I574逐步增強(qiáng)，但隨之變化的溶液熒光顏色由開始變化明顯到無明顯變化。最終我們選擇了RhB的加入量為30mg的RhB@β-CDs比率熒光探針進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3-1不同RhB加入量合成的RhB@β-CDs比率熒光探針溶液加入98.68μmol/LZEN后的熒光發(fā)射光譜圖3.3檢測(cè)體系pH的考察由于pH對(duì)RhB@β-CDs比率熒光探針與ZEN的結(jié)合有較大的影響，因此有必要對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的pH進(jìn)行優(yōu)化。將RhB@β-CDs比率熒光探針儲(chǔ)備液稀釋于不同pH的水溶液中（用0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH），分別加入相同體積的98.68μmol/LZEN儲(chǔ)備液，均勻混合，用于熒光檢測(cè)。圖3-2及圖3-3分別顯示了RhB@β-CDs比率熒光探針在pH值為3~7時(shí)的熒光發(fā)射光譜圖與熒光強(qiáng)度比I463/I574。顯而易見的，pH=6時(shí)的I463/I574為最大值，這與前人的結(jié)果相符合，因此，最終選擇pH=6作為檢測(cè)系統(tǒng)的最優(yōu)pH。圖3-2當(dāng)pH值為3~7時(shí)，RhB@β-CDs比率熒光探針的熒光發(fā)射光譜圖圖3-3當(dāng)pH值為3~7時(shí)，熒光強(qiáng)度比I463/I574的值3.4反應(yīng)時(shí)間的考察在使用RhB@β-CDs比率熒光探針檢測(cè)ZEN之前，本實(shí)驗(yàn)中還研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度比I463/I574的影響。在上述最優(yōu)條件下，加入59.21μmol/L的ZEN儲(chǔ)備液，然后測(cè)定了不同反應(yīng)時(shí)間的熒光發(fā)射光譜圖（見圖3-4）和熒光強(qiáng)度比I463/I574（見圖3-5）。如圖3-5所示，在加入ZEN后的前10min，I463/I574變化迅速，并在20min時(shí)基本達(dá)到平衡，后續(xù)不再有大幅變化。因此，我們選擇20min作為最佳反應(yīng)時(shí)間。圖3-4RhB@β-CDs比率熒光探針加入59.21μmol/L的ZEN后，不同反應(yīng)時(shí)間的熒光發(fā)射光譜圖圖3-5RhB@β-CDs比率熒光探針加入59.21μmol/L的ZEN后，不同反應(yīng)時(shí)間的熒光強(qiáng)度比I463/I574的值3.5定量和可視化檢測(cè)在上述最佳條件下，分別用熒光分光光度計(jì)在最大激發(fā)波長為335nm的激發(fā)下和紫外燈（λex=365nm）下分別進(jìn)行定量和可視化檢測(cè)ZEN。如圖3-6所示，隨著ZEN濃度的增加（由a到j(luò)濃度逐漸增加），574nm處的熒光強(qiáng)度隨著ZEN濃度的增加而降低，而463nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度比I463/I574增大。如圖3-7所示，RhB@β-CDs比率熒光探針的熒光強(qiáng)度比I463/I574與ZEN的濃度在0.4934~98.68μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性相關(guān)的關(guān)系，檢測(cè)限（LOD）為147.2nmol/L，線性方程為I463/I574=0.00782CZEN+0.0346，相關(guān)系數(shù)為0.9990?？梢奟hB@β-CDs作為比率熒光探針檢測(cè)ZEN具有優(yōu)越的性能。此外，如圖3-8所示，探針溶液的整體顏色隨著ZEN加入量的增加逐漸由黃色變?yōu)辄S白色，這一現(xiàn)象很容易用肉眼識(shí)別，說明本方法具有可視化的優(yōu)點(diǎn)。總之，該方法具有良好的檢測(cè)限和可視化檢測(cè)的能力，表明此法對(duì)痕量ZEN的檢測(cè)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。圖3-6RhB@β-CDs比率熒光探針與0.4934~394.7μmol/L的ZEN反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜圖圖3-7RhB@β-CDs比率熒光探針的熒光強(qiáng)度比I463/I574與ZEN濃度之間的線性關(guān)系圖3-8RhB@β-CDs比率熒光探針與0.4934~98.68μmol/L的ZEN在365nm紫外燈下的照片圖3.6熒光檢測(cè)的機(jī)制為了說明RhB@β-CDs比率熒光探針可能的熒光增強(qiáng)機(jī)理，研究分析了ZEN和RhB@β-CDs的光學(xué)性質(zhì)。β-CDs腔內(nèi)富含酚羥基，當(dāng)與ZEN相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生主客體絡(luò)合而形成配合物，這些配合物具有較的高穩(wěn)定性，誘導(dǎo)了絡(luò)合時(shí)的熒光增強(qiáng)REF_Ref4438\r\h[59]。圖3-9所示為RhB和RhB@β-CDs加入相同量的ZEN之后的熒光發(fā)射光譜，可以清楚的看到，單純的RhB與ZEN并不會(huì)發(fā)生反應(yīng)使熒光增強(qiáng)，只有與β-CDs形成復(fù)合物之后，才會(huì)出現(xiàn)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。這與前人的結(jié)論相同。因此，RhB@β-CDs比率熒光探針對(duì)ZEN的熒光增強(qiáng)機(jī)制是由于β-CDs與ZEN形成的新的絡(luò)合物。圖3-9RhB和RhB@β-CDs比率熒光探針與ZEN反應(yīng)后的熒光發(fā)射光譜圖3.7抗干擾能力的考察抗干擾能力也是在實(shí)際應(yīng)用中必須考慮的一個(gè)重要因素。為了檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的基于RhB@β-CDs熒光增強(qiáng)效應(yīng)的比率熒光探針檢測(cè)ZEN的選擇性，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)一些常見的干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)試。如圖3-10和圖3-11所示，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，分別向59.21μmol/LZEN或額外加入各種潛在干擾物質(zhì)之后的59.21μmol/LZEN中加入相同量的RhB@β-CDs比率熒光探針，干擾物質(zhì)為葡萄糖（Glc）、離子（Ag+、Ba2+、Ca2+、Cl-、Cu2+、K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、SO42-、Zn2+）和氨基酸（Cys、Phe、Gly、Sar、Tyr、Trp、Val、His、Glu），與空白相比，RhB@β-CDs比率熒光探針與ZEN的混合溶液在過量金屬離子或氨基酸存在下，熒光強(qiáng)度比I463/I574沒有發(fā)生顯著的變化，這說明RhB@β-CDs比率熒光探針對(duì)所添加干擾物質(zhì)沒有響應(yīng)。因此探針溶液的熒光強(qiáng)度比I463/I574不受所添加干擾物質(zhì)的干擾，結(jié)果表明RhB@β-CDs比率熒光探針具有良好的抗干擾能力。圖3-10RhB@β-CDs比率熒光探針加入59.21μmol/LZEN或額外加入各種潛在干擾物質(zhì)之后的熒光發(fā)射光譜圖圖3-11RhB@β-CDs比率熒光探針加入59.21μmol/LZEN或額外加入各種潛在干擾物質(zhì)之后的熒光強(qiáng)度比I463/I5743.8穩(wěn)定性和重復(fù)性調(diào)查為評(píng)價(jià)此方法的穩(wěn)定性，在365nm紫外燈下連續(xù)照射RhB@β-CDs比率熒光探針溶液和RhB@β-CDs比率熒光探針與59.21μmol/LZEN的混合溶液，并測(cè)量熒光發(fā)射光譜與記錄熒光強(qiáng)度比I463/I574的變化。如圖3-12和圖3-13所示，RhB@β-CDs比率熒光探針溶液和RhB@β-CDs比率熒光探針與59.21μmol/LZEN的混合溶液在2h內(nèi)均保持穩(wěn)定，表明RhB@β-CDs比率熒光探針具有良好的抗光漂白性和良好的穩(wěn)定性。為了研究本方法的重復(fù)性，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，通過測(cè)定6次不同批次的RhB@β-CDs比率熒光探針和次甲基藍(lán)（MB）進(jìn)行光催化來考察其重復(fù)性，經(jīng)重復(fù)測(cè)定每批樣品3次后，得到熒光強(qiáng)度比I463/I574的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%。結(jié)果表明，本方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。圖3-12RhB@β-CDs比率熒光探針在加入59.21μmol/LZEN前的熒光強(qiáng)度比I463/I574圖3-13RhB@β-CDs比率熒光探針在加入59.21μmol/LZEN后的熒光強(qiáng)度比I463/I574

3.9實(shí)際樣品檢測(cè)為了評(píng)價(jià)該比率熒光探針的準(zhǔn)確性和在實(shí)際樣品中的適用性，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法和回收率試驗(yàn)法測(cè)定啤酒和玉米樣品中的ZEN：在啤酒和玉米樣品溶液中加入ZEN，使ZEN濃度分別為0.4934、1.970和59.21μmol/L，測(cè)定所有樣品3次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD，n=3）。如表3-1所示，回收率范圍在89.17%~101.7%之間，RSD在0.98%~3.81%之間。以上結(jié)果表明，它具有良好的重現(xiàn)性和精度，在實(shí)際樣品檢測(cè)中實(shí)用可靠。表3-1實(shí)際樣品中ZEN的回收率樣品添加量(μM)檢出量(μM)回收率(%)RSD(%)啤酒0.49340.4400701.90196.491.8459.2159.52100.50.98玉米0.49340.444190.013.811.9702.003101.72.5159.2158.9199.491.14

4結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)研究中，成功構(gòu)建了一種基于熒光增強(qiáng)效應(yīng)的新型RhB@β-CDs比率熒光探針，并用于ZEN的定量及可視化檢測(cè)。ZEN與RhB@β-CDs比率熒光探針結(jié)合之后可以增強(qiáng)λem=463nm處的熒光強(qiáng)度，減弱λem=574nm處的熒光強(qiáng)度，該機(jī)制為ZEN的比率熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，結(jié)合比率熒光法檢測(cè)和加樣回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定了實(shí)際樣品中的ZEN。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，ZEN濃度為0.4934~98.6μmol/L時(shí)與RhB@β-CDs比率熒光探針的熒光強(qiáng)度比I463/I574呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為147.2nmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)ZEN的檢測(cè)具有較高的靈敏度、良好的選擇性、較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，以及顯著的可視化檢測(cè)效果。此法已成功地應(yīng)用于啤酒和玉米中ZEN的檢測(cè)。所有樣品的回收率均在89.17%~101.7%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD，n=3）在0.98%~3.81%之間。為食品中ZEN的檢測(cè)提供了一種新的快速分析方法，并擴(kuò)展了RhB在傳感分析中的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)朱雪蕊.基于表面增強(qiáng)拉曼光譜光子晶體微球生物芯片真菌毒素多元檢測(cè)[D].南京:南京師范大學(xué),2019.楊建伯.真菌毒素與人類疾病[J].中國地方病學(xué)雜志,2002,21(04):76-79.陳麗星.真菌毒素研究進(jìn)展[J].河北工業(yè)科技,2006,23(02):124-126.王剛,王玉龍,張海永,等.真菌毒素形成的影響因素[J].菌物學(xué)報(bào),2020,39(03):477-491.袁航,丁同英.食品中主要真菌毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械,2020,36(12):203-206.劉振江,潘興魯,郭艷國,等.農(nóng)產(chǎn)品中典型真菌毒素免疫檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2023,49(02):1-5.齊彪,湯思凝,張誼,等.玉米赤霉烯酮對(duì)奶牛的毒性作用及脫毒方法研究進(jìn)展[J].中國奶牛,2022,392(12):5-9.鄧友田,袁慧.玉米赤霉烯酮毒性機(jī)理研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(02):89-92.崔紅杰,盧春亭,潘麗琴,等.姜黃素通過SIRT1/FOXO1通路緩解玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)的豬腎上皮細(xì)胞氧化損傷[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2023,56(05):1007-1018.李順意,于秋香,向臘,等.真菌毒素玉米赤霉烯酮生物降解的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2018,34(04):489-500.XinliuTan,XueqingWang,AiyueHao,etal.Aptamer-basedratiometricfluorescentnanoprobeforspecificandvisualdetectionofzearalenone[J].MicrochemicalJournal,2020,157:104943.鄧桃,袁青松,周濤,等.中藥材中玉米赤霉烯酮毒素污染現(xiàn)狀及其脫毒研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2022,50(16):5-9.HassanM,FatemehR,KobraB.ZearalenoneisbioactivatedintheriverBuffalo(Bubalusbubalis):hepaticbiotransformation[J].TropicalAnimalHealthandProduction,2010,42(6):1229-1234.陳寶江.關(guān)注玉米赤霉烯酮,保障動(dòng)物健康[J].飼料與畜牧,2017,(19):1.姜淑貞,楊維仁,楊在賓.玉米赤霉烯酮的代謝、毒性及其預(yù)防措施[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(02):196-202.董宇涵,劉鵬飛,吳正宗,等.玉米赤霉烯酮的性質(zhì)與脫除技術(shù)研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2022,35(12):10-14.董梅,武琴園,薛海燕,等.高效液相色譜法測(cè)定食品中玉米赤霉烯酮的研究[J].糧食與食品工業(yè),2022,29(03):65-68+72.丁雪瑤,黃鈺,鐘曉霞,等.動(dòng)物性食品中玉米赤霉烯酮?dú)埩舻腖C-MS/MS法測(cè)定[J].畜牧與獸醫(yī),2016,48(01):86-89.DanleiSun,ChenglongLi,ShuangZhou,etal.DeterminationofTraceZearalenoneandItsMetabolitesinHumanSerumbyaHigh-ThroughputUPLC-MS/MSAnalysis[J].AppliedSciences,2019,9(4):741.高琳,王磊.飼料中玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法概況[J].中國畜禽種業(yè),2021,17(06):51-52.謝賢慶,侯正宗,羅雪云,等.一起霉變飼料引起的豬中毒[J].衛(wèi)生研究,1988,(01):40-42.AnnaYuKolosova,SarahDeSaeger,LibertySibanda,etal.Developmentofacolloidalgold-basedlateral-flowimmunoassayfortherapidsimultaneousdetectionofzearalenoneanddeoxynivalenol[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2007,389(7):2103-2107.謝剛,王松雪,崔華,等.超高效液相色譜法快速檢測(cè)糧食中玉米赤霉烯酮的含量[J].糧油食品科技,2014,22(02):71-75.譚新柳,黃菲,繆文俊,等.玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,42(01):9-17.曾紅燕,黎源倩,晉軍,等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定玉米赤霉烯酮及其代謝物[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003,(02):333-336.溫雨柔,王浩洋,趙翔,等.咔唑基化學(xué)傳感器識(shí)別各種陰離子研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑,2023,45(03):74-84.張來新,陳琦.熒光化學(xué)傳感器的產(chǎn)生、發(fā)展及應(yīng)用[J].合成材料老化與應(yīng)用,2019,48(01):120-124.劉方園,王詩樂,于景洋,等.基于比色化學(xué)傳感器定量檢測(cè)土壤中可交換態(tài)Cu2+的研究[J].中國土壤與肥料,2023,309(01):240-246.張麗,王新星.MOF材料的制備及其在光電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用綜述[J].山東化工,2022,51(19):82-84.房鈺鑫,郭義,尹飛,等.針型化學(xué)傳感器研制及其在體檢測(cè)的應(yīng)用及前景展望[J].世界中醫(yī)藥,2020,15(07):983-989.黎雪英,李曉坤,馮素香,等.基于TiO2-ZnPc(NH2)4復(fù)合材料的光電化學(xué)傳感器檢測(cè)抗壞血酸[J].分析試驗(yàn)室,2021,40(05):598-604.ShuaiMa,MengWang,TianyanYou,etal.UsingMagneticMultiwalledCarbonNanotubesasModifiedQuEChERSAdsorbentforSimultaneousDeterminationofMultipleMycotoxinsinGrainsbyUPLC-MS/MS[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2019,67(28):8035-8044. XiaoyaBi,LiboLi,LijunLuo,etal.AratiometricfluorescenceaptasensorbasedonphotoinducedelectrontransferfromCdTeQDstoWS2NTsforthesensitivedetectionofzearalenoneincerealcrops[J].FoodChemistry,2022,385:132657.YuyuanXue,ZechenWan,XinpingOuyang,etal.Lignosulfonate:AConvenientFluorescenceResonanceEnergyTransferPlatformfortheConstructionofaRatiometricFluorescencepH-SensingProbe[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2019,67(4):1044-1051.曾木蘭.納米熒光材料的制備及其在熒光分析中的應(yīng)用[D].南昌:江西師范大學(xué),2017.李強(qiáng),高濂,嚴(yán)東生.稀土化合物納米熒光材料研究的新進(jìn)展[J].無機(jī)材料學(xué)報(bào),2001,(01):17-22.王緒美.熒光納米材料的合成制備、性質(zhì)表征和應(yīng)用研究[D].長春:吉林大學(xué),2012.陳秋琪,王謝.采用納米熒光材料檢測(cè)魚中痕量六價(jià)鉻的含量[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2015,26(05):358-359+364.崔小虎.熒光納米材料的合成及其在潛在指紋顯現(xiàn)中的應(yīng)用研究[D].蘭州:甘肅政法大學(xué),2021.趙丹,王昌濤,蘇磊,等.熒光納米材料在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展,2021,33(09):1482-1495.孫溥臨.量子點(diǎn)納米材料探針及其在腫瘤影像中的應(yīng)用[J].粘接,2021,48(10):58-61.王琪,王蓓蓓,馬