非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的合成+最終稿

非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的合成【摘要】目的：本論文的研究內容包括非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的合成，并利用核磁共振波譜儀和高分辨質譜對合成的化合物進行結構確證，為后續(xù)抗腫瘤活性的評價做了一定基礎性工作。方法：本文以咔唑為起點，根據目標產物的結構選擇合適的反應物，經N-烷基化、開環(huán)、酰胺縮合等步驟合成目標產物，根據化合物的物理化學性質選擇合適的催化劑、溶劑等，采用TLC薄層色譜法判斷反應是否完成，采用液-液萃取法將脂溶性化合物與水溶性雜質、中間體、副產物、催化劑和溶劑分離，采用柱層析法或PTLC薄層色譜法對目標產物進行分離純化，最后采用核磁共振波譜法和質譜法對目標產物進行結構確證。結果：成功合成14.5mg淡黃色固體H，產率59.8%，經結構確證所合成的化合物H為N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。結論：成功制備了結構正確的N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺?！娟P鍵詞】雙靶點藥物，抗腫瘤，DNA甲基轉移酶，組蛋白去乙酰酶

Synthesisofnon-nucleosideDNMT1andHDACdualtargetinhibitors[Abstract]Objective:Theresearchinthisthesisincludedthesynthesisofnon-nucleosideDNMT1andHDACdualtargetinhibitors,andthestructuralconfirmationofthesynthesizedcompoundsusingNMRspectroscopyandhigh-resolutionmassspectrometry,whichmadesomebasicworkforthesubsequentevaluationoftheantitumoractivity.Methods:Inthispaper,carbazolewasusedasthestartingpointtoselectsuitablereactantsaccordingtothestructureofthetargetproducts,andthetargetproductsweresynthesizedbyN-alkylation,ringopeningandamidecondensationsteps,etc.Suitablecatalystsandsolventswereselectedaccordingtothephysicochemicalpropertiesofthecompounds,andTLCthin-layerchromatographywasusedtodeterminewhetherthereactionwascompleted,andliquid-liquidextractionwasusedtoseparatethefat-solublecompoundsfromthewater-solubleimpurities,intermediates,by-products,theThetargetproductswereseparatedandpurifiedbycolumnchromatographyorPTLCthin-layerchromatography,andfinallythetargetproductswerestructurallyconfirmedbyNMRspectroscopyandmassspectrometry.Results:14.5mgoflightyellowsolidHwassynthesizedsuccessfullywithayieldof59.8%.ThecompoundHsynthesizedwasN1-(4-(2-((3-(9H-carbazol-9-yl)-2-hydroxypropyl)amino)ethyl)phenyl)-N5-hydroxy-glutenediamine.Conclusion:N1-(4-(2-((3-(9H-carbazol-9-yl)-2-hydroxypropyl)amino)ethyl)phenyl)-N5-hydroxy-pentenediaminewaspreparedsuccessfully.[Keywords]DualtargetdrugsAntitumorDNAmethyltransferaseHistonedeacetylase

目錄1前言 1前言1.1表觀遺傳學惡性腫瘤（癌癥）已經成為當今社會影響人們健康和日常生活的重大因素，其發(fā)病可由多方面因素造成，包括基因層面的遺傳學因素，以及與遺傳方面無關的飲食方面的因素。表觀遺傳學是與遺傳學(genetic)相對應的概念。表觀遺傳學改變是基于對DNA堿基排列順序以外的基因調控，不影響DNA的堿基序列，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質結構重組、非編碼RNA等。此外，表觀遺傳改變還可以通過以下途徑參與調控惡性腫瘤的多種生物學過程：（1）通過調控原癌基因或抑癌基因激活與沉默；（2）通過調控相關基因的表達與沉默；（3）通過調控DNA復制和修復；（4）通過調控端粒調節(jié)、有絲分裂期著絲粒的穩(wěn)定性和染色體分離等過程[1]。這些調控信息的改變，與人體許多疾病息息相關，如腫瘤、代謝性疾病和退行性疾病等[2]。由于這些疾病在某種程度上是可逆的，因此，對相關靶點進行干預和調控，可以在一定程度上延緩甚至逆轉疾病發(fā)展的進程。近年來，以表觀遺傳學上的改變作為抗腫瘤治療的切入點進行藥物研發(fā)和調控機制的研究，已經成為國內外抗腫瘤研究的熱點[3,4]。DNA甲基化和組蛋白去乙?；潜碛^遺傳學修飾的重要途徑，是表觀遺傳調控的主要方式，它們分別由多種亞型的DNA甲基轉移酶（DNMTs）和組蛋白去乙酰酶（HDACs）催化調控，當DNA甲基轉移酶和組蛋白去乙酰酶在細胞中的表達水平升高時，會使得細胞中抑癌基因沉默，然后使其失活，從而抑制了腫瘤細胞的凋亡，使腫瘤細胞的水平相對升高，最終促進了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-8]。DNMT和HDAC是具有極大研究意義和前景的抗腫瘤治療靶標。對靶向作用于DNMTs和HDACs的小分子抑制劑進行調控機制的研究，可為腫瘤等疾病的預防和治療提供新的方案和選擇。1.2DNA甲基化與癌癥DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體提供甲基，與CpG二核苷酸中5′端胞嘧啶共價結合，從而生成5-甲基胞嘧啶，這一過程稱為“DNA甲基化”[9-12]。目前發(fā)現的DNA甲基轉移酶有五種，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，它們對于DNA甲基化的調控方式各有不同，在人體中的含量也各不相同[13]。在已發(fā)現的幾種DNA甲基轉移酶中，DNMT1在人類的細胞中含量最高，其異常表達可導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[14-16]，例如在實體瘤中，DNMT1過表達會導致患者的淋巴結轉移和預后不良，在前列腺癌、膠質母細胞瘤中都存在DNMT1過表達的情況；在胰腺癌中，存在DNMTI和DNMT3A過度表達現象[17]；在三陰性乳腺癌（triple-negativebreastcancer,TNBC）中，也可以檢測到由于DNMT1高表達而導致的DNA高甲基化，產生了包括抑制雌激素受體（ER）的表達、促進腫瘤轉移所需的上皮-間質轉換（EMT）、誘導細胞自噬和促進TNBCs中癌干細胞的生長等作用，目前已被認為是TNBC腫瘤發(fā)生的原因之一[18]。因此，對DNMT1進行抑制可能對人體產生一定的抗腫瘤活性。1.3DNA甲基轉移酶抑制劑現階段研究的DNA甲基轉移酶抑制劑可以按照其結構特征分為兩類：一類是核苷類似物，另一類是非核苷類似物。核苷類似物屬于抗代謝抗腫瘤藥物，其結構與胞嘧啶相似，多是在胞嘧啶的結構基礎上進行細微的結構改造所得。它可以通過模擬胞嘧啶結構與DNA結合，進而與DNMT形成共價復合物，抑制DNA甲基化，干擾腫瘤的形成[19-25]。其中，阿糖胞苷、阿扎胞苷和地西他濱是常見的核苷類抑制劑。當抑制劑的劑量較低時，可以激活由于DNA甲基化而失活的細胞周期蛋白，從而促進細胞分化；而當劑量較高時，則可以誘導癌細胞的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[26-33]。然而，核苷類似物由于低選擇性和高副作用，且大多局限于實體瘤，在抑制DNA甲基轉移酶的同時，也會影響染色體的整體穩(wěn)定性。此外，此類藥物還常見骨髓抑制、免疫抑制和惡心等副作用。非核苷類似物化學結構較多，但大多數的選擇性和活性都較低，其來源包括：（1）源自天然產物，如姜黃素（curcumin）等，雖然姜黃素抗癌作用具有潛在的臨床應用價值，但有研究表明，由于其體內代謝過快，因此難以在生物體內達到有效的血藥濃度，無法發(fā)揮其藥理作用，從而限制其臨床應用[34-37]。（2）老藥新用，如普魯卡因[38-43]、普魯卡因胺及其衍生物[44-47]。在表觀遺傳學方面，普魯卡因是一種DNA脫甲基劑，它可以降低DNA上的CpG位點的甲基化程度，使沉默的腫瘤抑制因子重新活化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。雖然，普魯卡因可以成為癌癥治療的候選藥物，但活性并不理想。（3）甲基供體SAM的類似物：這類分子對DNA甲基轉移酶的選擇性較低，而且對所有使用SAM作為甲基供體進行催化的甲基化反應都有影響。綜上所述，目前研究得到的DNMT抑制劑都各有缺點，如毒副作用較大、活性較低、對酶的亞型選擇性較差且大多數同時作用于多種亞型等。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展原理和過程相當復雜，目前仍不清楚DNA甲基轉移酶的哪種亞型是發(fā)揮抗腫瘤作用的最佳治療靶標，然而，我們可以明確的一點是，無論是在抗腫瘤機制研究方面還是癌癥的靶向治療方面，設計具有亞型選擇性DNMT抑制劑并對其調控機制進行研究都具有很大的意義。1.4組蛋白乙酰化與癌癥組蛋白是真核細胞染色質中帶正電荷的蛋白質，由于其含有大量的堿性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸，因此整體上呈堿性。由于靜電效應，組蛋白可以與帶負電荷的DNA結合并纏繞在一起，它們共同構成了染色質的基本結構單元。組蛋白上所帶正電荷的量與組蛋白乙?；矫芮邢嚓P，可通過調節(jié)HDAC和HAT（組蛋白乙酰酶）之間的平衡來共同調節(jié)組蛋白乙?；絒48]。當細胞中HDAC表達的水平升高時，會導致組蛋白乙?；讲黄胶?，影響原癌基因和抑癌基因的表達，致使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[49,50]。由于HDAC的過度表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此，HDAC被認為是臨床上重要的抗癌靶標之一。抑制組蛋白去乙酰酶的活性，可以使抑癌基因的表達水平升高，從而抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。迄今為止，已有5種HDAC抑制劑(histonedeacety‐lasesinhibitors,HDACis)獲批上市，用于治療皮膚T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤并取得臨床成功，即Vorinostat、Romidepsin、Belinostat、Panobi‐nostat和Chidamide，這充分證明了HDAC作為抗癌靶標的研究意義和應用價值。因此，合成對組蛋白去乙酰酶具有抑制作用的小分子抑制劑在抗腫瘤藥物研發(fā)領域具有重大臨床意義。1.5組蛋白去乙酰酶抑制劑組蛋白去乙?；福℉DACs）是一個非常龐大的表觀遺傳金屬酶家族，涉及基因轉錄和調節(jié)、細胞增殖、分化、遷移和死亡以及血管生成。根據序列同源性，可將研究人員目前在哺乳動物體內發(fā)現的18種HDAC分為4種類型：Ⅰ型主要包括HDAC1、2、3和8，分子量42~55kDa，主要分布于細胞核中，與酵母Rpd3同源性較高；Ⅱ類包含HDAC4-7、9和10，分子量在120~130kDa之間，可分為Ⅱa型和Ⅱb型，其中Ⅱa型包括HDAC4、5、7、9，Ⅱb型主要包括HDAC6和10，它們主要分布于細胞質，但是仍然可以在細胞核與細胞質之間來回穿梭，與酵母的hda-1序列同源性較高；Ⅲ型包括SIRT1-7，其與酵母的Sir2有相似的序列；Ⅳ型包括HDAC11，其與酵母的Rpd3及hda-1序列相似[51]。組蛋白去乙酰酶（HDAC）抑制劑是一類細胞抑制劑，通過抑制其目標組蛋白去乙酰酶來阻斷組蛋白去乙酰酶與底物的結合，從而阻止HDAC-底物復合物的形成，進而誘導組蛋白賴氨酸殘基乙酰化，從而改變腫瘤細胞的轉錄模式，導致腫瘤細胞生長停滯、分化和誘導凋亡[52]，發(fā)揮抗腫瘤活性。HDAC抑制劑是近幾十年發(fā)展起來的一種小分子抑制劑，迄今為止，全世界已經開發(fā)了許多HDAC抑制劑（HDACis）（見表一），其中一些已經被批準用于治療癌癥，但由于亞型選擇性較低和脫靶毒性大等問題，其使用仍然受到限制。表一HDAC抑制劑分類類別代表藥物結構式異羥肟酸類伏立諾他（SAHA）帕比司他曲古抑菌素A（TSA）貝利司他短鏈脂肪酸類丙戊酸環(huán)肽類羅米地辛Apicidin苯甲酰胺類西達苯胺恩替諾特1.5.1異羥肟酸類異羥肟酸類組蛋白去乙酰酶抑制劑是通過異羥肟酸螯合HDACs催化活性中心的Zn2+，從而抑制HDACs活性的一類抑制劑。異羥肟酸類抑制劑包括曲古抑菌素A（TSA），Vorinostat（SAHA），Panabinostat等。TSA(TrichostatinA，曲古抑菌素A)是從鏈霉菌株Streptomyceshygroscopicus分離得到的一種天然抗生素，具有抗真菌和抗炎活性。經研究發(fā)現，TSA還具有抑制組蛋白去乙酰酶活性，是第一個被研究人員發(fā)現的具有抑制HDACs活性的小分子異羥肟酸類化合物[53]。SAHA可與HDAC的催化結構域結合，其異羥肟酸藥效團能夠在HDAC的催化口袋中形成鋅離子環(huán)，從而抑制其脫乙?；饔肹54]。Panobinostat是一種非選擇性HDAC抑制劑，目前已完成Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗，可單獨使用或與其他治療方法聯合使用，用于治療如非霍奇金淋巴瘤、白血病骨髓母細胞、急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤和其他在肺和乳腺組織中發(fā)現的晚期實體瘤。當與其他化合物組合使用時，Panobinostat具有干擾DNA甲基化和抑制酪氨酸激酶的作用[55,56]。此外，Panobinostat還能激活抑制細胞分裂和癌細胞生長的基因。Panobinostat已重新命名為Farydak，由諾華公司生產，以靜脈內給藥的方式，與Bortezomib聯合用于治療多發(fā)性骨髓瘤[57]。1.5.2短鏈脂肪酸類丙戊酸（VPA）原本作為抗癲癇藥物，廣泛用于癲癇、雙相情感障礙、精神分裂癥以及偏頭痛、抑郁癥的極端病例的臨床治療。作為HDAC抑制劑，在Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗中用于治療各種類型的癌癥[58]。VPA的短鏈脂肪酸結構增強了對膠質母細胞瘤和乳腺癌的治療作用，此外，還有學者將VPA與其他藥物聯合使用，用于治療淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、HIV感染和自身免疫性淋巴組織增生綜合癥等[59,60]。1.5.3環(huán)肽類環(huán)肽類化合物是一類結構龐大且復雜的HDAC抑制劑，代表藥物有羅米地辛和Apicidin等。目前，羅米地辛可用于T淋巴細胞瘤的治療，是唯一一個獲得美國FDA批準上市的環(huán)肽類HDAC抑制劑，并于2011年批準用于外周T淋巴細胞瘤的治療[61]。1.5.4苯甲酰胺類在目前已有的苯甲酰胺類化合物中，它們的活性通常低于異羥肟酸類和環(huán)肽類。其中，代表藥物西達苯胺在2014年被CFDA批準用于復發(fā)及難治性外周T細胞淋巴瘤的治療[62]。1.6雙靶點抑制劑研究策略在過去，單靶點抑制劑一直是抗腫瘤藥物的研究熱點，但是，單靶點抑制劑可能會產生快速耐藥性，并且即使激活了相關靶標后仍然不能產生理想的治療效果。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與環(huán)境、營養(yǎng)、飲食和遺傳密切相關，大量的腫瘤生物學研究也表明與腫瘤細胞生長、增殖、分化和轉移相關的信號傳導是一個極其復雜、多因素、多途徑的蛋白網絡系統，因此針對某一個靶點進行治療，往往不足以抑制腫瘤的進展，需要聯合不同作用途徑和機制的藥物多靶點聯合阻斷信號傳導，抑制腫瘤的生長。因此，本論文圍繞DNMT1和HDAC兩個表觀遺傳學相關靶點，設計合成了一種雙靶點抑制劑，以期能同時抑制DNMT1和HDAC，在抑制腫瘤增殖、轉移，促進腫瘤細胞凋亡方面等方面發(fā)揮治療作用。

2DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的設計與合成路線2.1DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的設計基于團隊前期研究工作與HDAC抑制劑結構特征，DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的結構設計見圖一。DNMT1抑制劑DC_05的藥效團[63]可分為陽離子-π相互作用區(qū)（常為咔唑基團）和疏水區(qū)；咔唑是抑制DNA甲基轉移酶的關鍵基團，因此在設計DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑時保留咔唑母核，發(fā)揮抑制DNA甲基轉移酶的作用。HDAC抑制劑的藥效團則可分為帽子區(qū)、連接部分和Zn2+絡合部分；其中，Zn2+絡合部分多為羥肟酸結構和鄰苯二胺結構，該部分為活性的必需結構，在設計DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑時保留Zn2+絡合部分，發(fā)揮抑制組蛋白去乙酰酶的作用。圖一羥肟酸類雙靶點抑制劑結構2.2化學合成路線圖二DNMT1和HDAC雙靶點抑制劑的合成路線反應物及反應條件：N,N-二甲基甲酰胺（DMF），氫氧化鉀（KOH），環(huán)氧氯丙烷，室溫，12h無水乙醇，對氨基苯乙胺，二碳酸二叔丁酯，冰浴10分鐘，室溫4h戊二酸單甲酯，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），三乙胺（TEA），2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），室溫，1h二氯甲烷，三氟乙酸（TFA），飽和碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液，室溫，10h化合物B，化合物F，無水乙醇，70℃，6h甲醇，50%羥胺溶液，60℃，反應過夜

3實驗部分3.1實驗儀器表二實驗所需儀器設備儀器名稱型號生產廠家三用紫外分析儀WFH-203B上海精科實業(yè)有限公司磁力攪拌器C-MAGHS7德國IKA集團電子天平BT125D德國賽多利斯公司旋轉蒸發(fā)儀B8德國BUTCH集團核磁共振儀BrukerAscend600MAvanceIIIHD德國Bruker公司高分辨液質聯用儀LTQOrbitrapXL美國ThermoFisherScientific公司注：BrukerAscend600MAvanceIIIHD型核磁共振儀（溶劑為CDCl3,DMSO-d6，methanol-d4四甲基硅烷（TMS）為內標，化學位移(δ)采用ppm為單位，化學位移的表示格式：位移+多重態(tài)（s=singlet,d=doublet,t=triplet,q=quartet,m=multiplet,br=broad）+耦合場數(Hz)+氫數）3.2實驗試劑表三化學合成所需試劑試劑名稱生產廠家環(huán)氧氯丙烷安耐吉化學試劑氫氧化鉀安耐吉化學試劑N,N-二甲基甲酰胺（DMF）廣州化學試劑乙酸乙酯廣州化學試劑無水硫酸鈉國藥集團化學試劑石油醚廣州化學試劑乙醇（超干）安耐吉化學試劑甲醇廣州化學試劑試劑名稱生產廠家三乙胺（超干）安耐吉化學試劑羥胺（50%）Accela戊二酸單甲酯上海畢得醫(yī)藥對氨基苯乙胺安耐吉化學試劑二碳酸二叔丁酯安耐吉化學試劑3.3合成實驗3.3.1N-烷基化反應在100mL圓底燒瓶中加入咔唑5g（29.9mmol,1.0eq），20mLN,N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌，加入KOH2g（35.9mmol,1.2eq），攪拌40分鐘，滴加環(huán)氧氯丙烷5.5g（59.8mmol,2.0eq），反應12小時。TLC檢測，石油醚-乙酸乙酯（10:1）展開，原料點消失，加水200mL對反應進行淬滅處理。乙酸乙酯50mL萃取，萃取動作平行重復3次，合并3次萃取所得的乙酸乙酯層（一共約150mL），依次用飽和NaCl溶液、無水Na2SO4除水干燥，使用旋轉蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得咔唑環(huán)氧丙烷（即固體B）用于下一步反應。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.16(d,J=7.7Hz,2H),7.67(d,J=8.2Hz,2H),7.47–7.44(m,2H),7.22(t,J=7.4Hz,2H),4.84–4.77(m,1H),4.44(dd,J=15.9,5.7Hz,1H),2.80–2.73(m,1H),2.62–2.56(m,1H)13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ140.79,126.18,122.55,120.64,119.48,110.11,50.77,45.16,44.64.3.3.2氨基Boc保護在1000mL圓底燒瓶中加入對氨基苯乙胺10g(73.4mmol,1.0eq)，冰浴條件下加入200mL無水乙醇，攪拌10分鐘;滴液漏斗中加入160mL無水乙醇，二碳酸二叔丁酯16g(73.4mmol,1.0eq)，混合均勻后，邊攪拌邊緩慢滴加至圓底燒瓶中。滴加完畢后撤去冰浴，反應4小時。TLC薄層色譜法監(jiān)測反應進度，展開劑石油醚-乙酸乙酯（5:1）展開，原料點消失，停止反應。使用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，得黃色油狀液體，置于通風櫥中冷卻，析出黃色固體D。HRMSm/zcalculatedforC12H18N2O2[M+Na]+259.1426,found236.1525.3.3.3酰胺縮合20mL樣品瓶，加入3mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），邊攪拌邊加入177mg（1.21mmol,1.0eq）戊二酸單甲酯，483mg(1.27mmol,1.05eq)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），337μL(2.42mmol,2.0eq）三乙胺（TEA），反應10分鐘，加入300mg(1.27mmol,1.05eq)固體D，室溫攪拌60分鐘，TLC檢測，石油醚-乙酸乙酯(2:1)展開，TLC顯示原料點消失，并且出現新的產物點。將上述體系轉移至100mL圓底燒瓶，往其中加入30mL飽和食鹽水淬滅反應，乙酸乙酯20mL萃取，萃取動作平行重復3次，合并三次萃取所得的乙酸乙酯層（一共約60mL），依次用飽和NaCl溶液、無水Na2SO4除水干燥，減壓除去溶劑，將所得粗產物進行硅膠柱層析純化分離，石油醚-乙酸乙酯（2:1）洗脫純化，得到化合物E0.57g。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.46(d,J=8.4Hz,2H),7.12(d,J=8.2Hz,2H),4.64(s,1H),3.70-3.65(m,3H),3.34(d,J=6.1Hz,2H),2.75(t,J=6.7Hz,2H),2.43(dd,J=13.6,7.0Hz,4H),2.05(dd,J=14.4,7.2Hz,2H),1.43(s,9H).13CNMR(151MHz,CDCl3)δ173.83,170.71,165.77,155.95,136.52,134.74,129.20,120.15,79.20,51.65,41.79,38.61,36.23,35.53,33.02,28.40,20.79.3.3.4氨基脫Boc保護基在50mL圓底燒瓶中加入0.57g固體E(1.94mmol,1.0eq)和10mL二氯甲烷，攪拌使其溶解，冰浴條件下邊攪拌邊滴加2.2g(19.4mmol,10.0eq)三氟乙酸(TFA)，滴加完畢后撤去冰水混合物，室溫反應10小時，TLC薄層色譜法監(jiān)測反應進程，展開劑二氯甲烷-甲醇(20:1)展開，TLC顯示原料點消失，出現新點，停止反應。減壓蒸干溶劑，得粗品。重新加入5mL二氯甲烷，超聲至溶解，用飽和NaHCO3溶液調節(jié)體系酸堿度至呈堿性，二氯甲烷5mL萃取，萃取動作平行重復3次，合并三次萃取所得的二氯甲烷層，依次用飽和NaCl溶液干燥有機層，無水Na2SO4除水干燥，使用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干二氯甲烷，得化合物F485mg，產率100%。1HNMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.49–7.41(m,3H),7.14(d,J=8.1Hz,2H),4.54(s,1H),3.69(s,3H),3.39–3.29(m,2H),2.76(t,J=6.6Hz,2H),2.44(dt,J=13.4,7.2Hz,4H),1.67(s,3H),1.43(s,10H).13CNMR(151MHz,Chloroform-d)δ173.86,170.43,155.89,136.25,134.97,129.32,120.11,51.72,41.77,36.38,35.56,32.92,28.41,20.81.3.3.5環(huán)氧環(huán)開環(huán)反應50mL圓底燒瓶，加入4mL無水乙醇，174mg(0.78mmol,1.0eq)化合物B，195mg(0.78mmol,1.0eq)化合物F。70℃條件下反應6小時，TLC檢測,二氯甲烷-甲醇(10:1)展開，原料點變小，出現新的反應點，終止反應。減壓除去溶劑，所得粗產物經柱層析分離，二氯甲烷-甲醇(100:1-20:1)洗脫純化，得化合物G45mg，產率11.8%。3.3.6羥肟酸化合物合成取24mg固體G，溶于1mL甲醇，加入0.5mL50%羥胺溶液，加熱至60℃，反應過夜。TLC薄層色譜法監(jiān)測反應進程，二氯甲烷-甲醇(5:1)展開，原料點變小，出現其他新點，停止反應。所得反應液直接經PTLC薄層色譜制備純化，展開劑二氯甲烷-甲醇(10:1-5:1)洗脫純化，選取合適的條帶刮下，混合溶劑二氯甲烷：甲醇=2：1浸泡過夜，取0.22μm微孔濾膜進行過濾，取濾液減壓旋干，得14.5mg化合物H，產率59.8%。1HNMR(600MHz,methanol-d4)δ8.08(d,J=7.7Hz,2H),7.92(s,1H),7.61(d,J=8.2Hz,2H),7.50(dd,J=8.2,4.6Hz,2H),7.45(t,J=7.6Hz,2H),7.21(t,J=7.4Hz,2H),7.16(d,J=8.3Hz,2H),4.50–4.42(m,3H),3.35(s,1H),3.24–3.13(m,4H),2.98–2.88(m,2H),2.47–2.40(m,2H),2.33(t,J=7.3Hz,1H),2.21(q,J=7.8Hz,2H),2.04–1.93(m,2H),1.36–1.23(m,2H).13CNMR(151MHz,methanol-d4)δ172.31,140.72,137.45,132.01,128.71,125.54,122.92,120.32,119.71,118.96,108.98,78.13,65.86,50.45,48.56,46.70,35.47,31.34,31.08,21.39.HRMSm/zcalculatedforC28H33N4O4[M+H]+489.2502,found489.2508.3.4實驗結果成功合成14.5mg淡黃色固體H，產率59.8%，經結構確證所合成的化合物H為N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。3.5討論在羥肟酸化合物的合成中，由于一開始反應條件選擇不當（反應條件為新鮮制備的羥胺甲醇溶液室溫反應1小時）導致末端甲酯未能生成羥肟酸化合物而是生成了一系列羧酸副產物。在開題報告中，結合先前查閱的文獻資料，我們計劃將羧酸化合物與鄰苯二胺進行酰胺縮合，合成鄰苯二胺類化合物作為另一種結構的雙靶點抑制劑。但是經結構確證后發(fā)現所得化合物并非目標化合物，由于所合成的羧酸副產物有限且時間限制而無法優(yōu)化反應條件后繼續(xù)實驗。后來我們更換了反應條件（反應條件為50%羥胺60℃反應過夜）成功合成了羥肟酸類雙靶點抑制劑。羥肟酸化合物的合成中，不采用硅膠柱進行分離純化，因為羥胺的溶解性能佳，在硅膠柱中容易擴散和溶解，因此采用PTLC進行制備純化，既可以有效除去羥胺，又可以提高產物的純度。在酰胺縮合反應中，選擇DMF作為溶劑，可以使反應物在其中具有良好的溶解度，但DMF在后續(xù)的處理中較難除去，因此我們可以采用往反應體系中加入10倍量的水，再用乙酸乙酯分3次萃取，后收集有機層進行后續(xù)操作。經過這一步驟可使DMF、水溶性良好的HATU留在水相中，而目標產物則留在乙酸乙酯層，分離目標產物與其他水溶性雜質。在酰胺縮合反應中，當HATU在反應體系中濃度不均勻時，會發(fā)生以下副反應：所以在投反應時，一般是先將酸、堿和HATU與選擇的溶劑充分混合，待羧基充分活化后再加入胺類化合物，以避免此類副產物的生成并降低產率。

4總結和展望本實驗成功制備出N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺（即羥肟酸類雙靶點抑制劑）并對其進行結構確證，確定所合成化合物H為結構正確的N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。未對以上化合物展開抗腫瘤活性的研究。課題組后續(xù)將對N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺開展分子水平和細胞水平活性實驗，測定化合物抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的效果；此外還將對化合物G的羧酸化合物的酰胺反應條件進行優(yōu)化，以期能與鄰苯二胺進行酰胺縮合反應合成結構正確的鄰苯二胺類雙靶點抑制劑，并對其進行結構確證和抗腫瘤活性的研究。

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