兩面針5種成分含量測定 高效液相色譜一測多評法（征求意見稿） 編制說明

1《兩面針5種成分含量測定高效一、項目來源本標準由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提出，深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司和廣西廣林正山藥業(yè)有限公司共同參與編制，經(jīng)廣西中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會批準立項，列入廣西中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會2023年第3批團體標準制定項目計劃。二、項目背景和目的意義L.）木質(zhì)藤本植物兩面針（Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.）的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風通絡、解毒消腫的功效，可用于跌撲損傷、胃痛、牙痛、風濕痹痛、毒蛇咬傷及燒燙傷等。兩面針作為一味傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，效果顯著，經(jīng)濟價值高，是三九胃泰、正骨水、金雞膠囊、兩面針牙膏等醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的重要原料。因此，兩面針藥才的質(zhì)量、臨床療效和安全性備受關(guān)注。目前《中華人民共和國藥典》（2020年版）規(guī)定兩面針藥材中氯化兩面針堿含量不得少于0.13%。但兩面針成分復雜，含有生物堿類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、木脂素類等多種化學成分，因此，制定一套科學、全面、高效的兩面針多種成分質(zhì)量檢測2標準顯得尤為必要。目的：一測多評技術(shù)可以在一次測定中實現(xiàn)多個成分定量分析，即降低成本又提高效率。標準編制工作組利用高效液相色譜檢測法與一測多評分析方法建立同步測定兩面針中5種成分的標準操作規(guī)程，實現(xiàn)對兩面針質(zhì)量全面評價，以解決傳統(tǒng)測定方法中存在的評價指標單一、成本高等問題，為臨床用藥提供更加安全、有效的保障，能更好地滿足大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應用的需求。意義：全面評價兩面針整體藥材質(zhì)量，保障臨床用藥安全、推動中醫(yī)藥行業(yè)健康發(fā)展，也為更多從事中醫(yī)藥研究和使用兩面針的人士提供參考依據(jù)和指導作用。三、項目編制過程（一）成立標準編制工作組團體標準《兩面針5種成分含量測定高效液相一測多評法》項目任務下達后，由廣西藥用植物園牽頭，深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司和廣西廣林正山藥業(yè)有限公司共同參與成立標準編制工作組，表1標準編制工作組人員與分工性別霞女婭女3云女德男華男江男莉女娥女勝男男洪男快男文男郎女通男（二）收集整理文獻資料標準編制工作組經(jīng)查閱，收集了國內(nèi)有關(guān)兩面針成分含量測定方法的相關(guān)文獻資料。主要有：《中華人民共和國藥典》2020年版；《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》第一卷（2008年版4《廣西中藥材標準》第二冊（1996年版（三）研討確定標準主題內(nèi)容標準編制工作組對收集到的資料進行整理研究后，組織召開了標準編制工作會議，對標準的整體框架結(jié)構(gòu)進行研究分析，并對標準的關(guān)鍵性內(nèi)容進行了初步探討。經(jīng)工作組研究確定，標準主體內(nèi)容主要包括：術(shù)語和定義、原理、試劑、儀器、測定步驟、結(jié)果計算、精密度。（四）編寫標準草案及征求意見稿整合現(xiàn)有資料中有關(guān)兩面針的5種成分的檢驗方法，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成團體標準草案及其編制說明。標準草案編制后，標準編制工作組多次組織召開座談會后根據(jù)座談討論情況對標準草案進行反復修改完善，最終形成團體標準征求意見稿及其編制說明。四、標準制定原則5（一）實用性標準內(nèi)容符合當前兩面針藥材質(zhì)量標準和檢驗方法技術(shù)發(fā)展方向，滿足兩面針市場需求，標準條款切實可行，具有較強的實用性和可操作性。（二）協(xié)調(diào)性本標準編寫過程中尊重知識產(chǎn)權(quán)，同時注重做好與相關(guān)法律法規(guī)、強制性標準的銜接，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、強制性標準協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性本標準嚴格按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，標準涉及的專業(yè)術(shù)語、方法原理、試劑和材料、儀器和設備、測定步驟、結(jié)果計算等內(nèi)容表達準確，引用數(shù)據(jù)、檢驗方法來源真實可靠，指標科學、論證充分，標準質(zhì)量有保證。（四）前瞻性本標準在充分考慮當前中藥材市場需求、試驗標準品研制及成本問題的基礎上，體現(xiàn)了特色性和先進性條款，為兩面針藥材及其制劑質(zhì)量控制研究提供技術(shù)支撐和指導。五、標準主要內(nèi)容及依據(jù)來源（一）術(shù)語和定義1、一測多評法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,6通過測定中藥中某個代表性成分的含量，依據(jù)相對校正因子可計算出該中藥中其他多種待測成分的含量，使其計算值與實測值符合定量方法學要求的一種多指標同步質(zhì)量控制方2、相對校正因子Relativecorrectionfactor是一種修正因子，它的主要作用是修正測量值，以獲得更準確的實驗數(shù)據(jù)，提高研究質(zhì)量，它的計算公式為某組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子之比。（二）方法原理在同時測定兩面針多個指標質(zhì)量成分的含量時，以兩面針中典型成分氯化兩面針堿做內(nèi)參物，分別求出內(nèi)參物與木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿等其它4個待測成分間的相對校正因子，并把相對校正因子作為一個常數(shù)用于相應成分的含量測定。（三）儀器設備Agilent1260Infinity型高效液相色譜儀（四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱，美國安捷倫公司Cary50型紫外分光光度計（美國Varian公司KQ5200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公CP225D型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius7（四）試劑鹽酸血根堿標準品（批號510001-201101，純度99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；購自中國食品藥品檢定研究院；白屈菜紅堿標準品（批號111718-201402，純度80.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；橙皮苷標準品（批號160406，純度98.0%）購自北京博藝匯科生物技術(shù)有限公司；木蘭花堿標準品（批號P11A10L85442，純度98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純（美國賽默飛世爾科技有限公（五）實驗方法AgilentEclipseC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm流動相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH至4.5體積流量1.0mL/min；柱溫30℃;檢測波長273、284nm；進樣量2、制備標準品溶液精密稱取氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿標準品分別約1.25mg、5mg、5mg、1.25mg8和5mg，加70%甲醇溶解并定容至25mL，制成混合標準品貯備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。鹽酸血根堿和白屈菜紅堿的濃度分別為0.0456mg/mL、然后從混合標準品貯備液中分別精確量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得不同濃度的混合標準品3、供試品溶液制備收集12批次的兩面針藥材作為本研究的供試品（經(jīng)廣西藥用植物園黃寶優(yōu)高級工程師鑒定為兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的根樣品信息見表1。表1兩面針供試樣品信息精密稱定供試樣品粉末（粒徑≤0.5mm）1.0g，置于具（料液比1:6合并提取液，用70%甲醇定容至50mL容量9瓶中，最后用0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。4、制作標準曲線分別吸取10μL不同濃度的混合標準品溶液依次注入高效液相色譜儀，按“1”項的色譜條件，測定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿峰面積，以峰面積（As）為縱坐標，對照品濃度（Cs）為橫坐標，繪制氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿的標準曲線。結(jié)果見表2。5種標準品的高效液相色譜峰圖見表2各成分的標準曲線1.木蘭花堿；2.橙皮苷；3.鹽酸血根堿；4.氯化兩面針堿；5.白屈菜紅堿。圖1對照品高效液相色譜圖5、精密度試驗精密吸取5種標準品貯備溶液，在“1”項的色譜條件下分別進樣5次，測得的木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積見表3，計算得出5種成分的RSD分別為0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明儀器精密度良好。表3精密度試驗峰面積結(jié)果分析6、穩(wěn)定性試驗h在“1”項的色譜條件下進樣，測得的木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積見表4，計表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。表4穩(wěn)定性試驗峰面積結(jié)果分析7、重復性試驗精密稱取同一批兩面針供試品（Z2）粉末6份，分別制備供試品溶液，在“1”項的色譜條件下進樣，測得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量2.36%，表明該方法重復性良好。表5重復性試驗含量檢測結(jié)果分析(mg/g)8、加樣回收率試驗以供試品（Z2）粉末為材料，制備供試品溶液45份，加入一定濃度的標準品貯備液，然后在“1”項的色譜條件表明該方法系統(tǒng)誤差小。表6加樣回收率分析結(jié)果成分稱樣量/g/mg/mg/mg/%平均回收率/%D木蘭花堿 鹽酸血根堿氯化兩面針堿白屈菜紅堿10、外標法測定12批次供試樣品中5種成分含量分別精密稱取12批供試品溶液吸取10μL，在“1”項的色譜條件下進樣測定峰面積，根據(jù)“表2”的標準曲線計算出濃度，然后計算含量，結(jié)果見表7。表7外標法測定得5種成分的含量結(jié)果（mg/g）11、一測多評法檢測供試樣品中5種成分含量第一步：氯化兩面針堿較易獲得，價格低廉，而且在樣品中的含量較高，故選擇氯化兩面針堿為內(nèi)參，采用外標法檢測12批次供試樣品中內(nèi)參的含量，結(jié)果見表7中第一列第二步：配制5種標準品的混合液，然后將母液依次稀釋成2倍液、5倍液、10倍液和25倍液。第三步：吸取5個濃度的混合標準品溶液各10μL，依次注入高效液相色譜儀，按“1”項的色譜條件，分別測定得出氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4。第四步：根據(jù)氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸應的峰面積，計算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的相對校正因子f1、f2、f3、f4。計算公式如下：f1=(Cs×A1)/（C1×As）;f2=(Cs×A2)/（C2×As）;f3=(Cs×A3)/（C3×As）;四種成分的相對校正因子計算結(jié)果見表8。表8各成分的相對校正因子f1f2f3f412345第五步：在不同色譜柱下計算相對校正因子，檢驗重復性。吸取5個濃度的混合標準品溶液各10μL，依次注入高效液相色譜儀，在“1”項的色譜條件下改變色譜柱，分別選擇5種不同的色譜柱（ShimadzuWondaCractODS-2、TianheKromasilC18、PhenomenexLunaC18、DalianElitehypersilBDSC18、AgilentZorbaxSB-aqC18分別測定得出氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4，計算相對校正因子，結(jié)果見表可知該方法能滿足定量分析要求。表9不同色譜柱測定得出的相對校正因子f1f2f3f4DalianElitehypersilBD093“1”項的色譜條件下進樣測定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積，以氯化兩面針堿為內(nèi)參，根據(jù)相對校正因子計算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的濃度C1、C2、C3、C4。其中C1=f1×Cs計算結(jié)果見表10。表10一測多評法測定得5種成分的含量結(jié)果（mg/g）12、一測多評法與外標法的結(jié)果比較分別采用外標法和一測多評法檢測得出12批