菌種管理和保藏

菌種的保藏和管理2024/4/111菌種保藏的重要性

菌種保藏是微生物學(xué)檢驗工作中的一項常規(guī)技

術(shù)，菌種的科學(xué)保藏和管理直接關(guān)系到檢驗結(jié)

果的正確性。

2024/4/112菌種的來源國內(nèi)或國外認可的菌種收藏機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所

有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。2024/4/113

-廣泛收集各種有用的微生物菌種。

-選擇最適宜的保藏方法。菌種保藏的中心任務(wù)2024/4/114常用菌種保藏方法

菌種保藏的原則根據(jù)微生物菌種的生理、生化特性降低微生物細胞的代謝強度。

2024/4/115

標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按驗證的方法進行。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株-從國內(nèi)、外菌種收藏機構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后,既為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。菌種的保藏2024/4/116菌種的保藏抑制微生物的代謝和生長繁殖，如低溫、干燥和真空等標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株經(jīng)純度和特性確認后，分裝于小瓶中,

可采用低溫冷凍干燥，液氮儲存，超低溫冷凍(低

于-70℃)等方法保存。

2024/4/117菌種的保藏

低于-70℃或低溫冷凍干燥可以延長菌種的保存時間.

標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作

菌株。冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后,不得重新冷凍

或再次使用。2024/4/118菌種的保藏

工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍

生物僅可用作工作菌株。2024/4/119菌種的保藏

不同的微生物，應(yīng)根據(jù)其生物特征來選擇最適宜的

保藏方法，菌種的保藏方法一般分四個階段：2024/4/1110⑴

挑選特征典型的純菌菌落。⑵確定保藏的合適菌體形態(tài)，孢子和芽孢死亡代謝作用弱，同時對惡劣環(huán)境有很強的抵抗力。⑶選擇最適宜的方法。⑷定期對保藏的菌種進行鑒定，確定保藏方法的有效性。菌種的保藏2024/4/1111方法主要原理適用的微生物保藏時間特點液氮超低溫保藏法超低溫廣泛數(shù)十年復(fù)雜、需要專門設(shè)備，有效冷凍真空干燥保藏法干燥、缺氧、低溫廣泛5～10年以上復(fù)雜、需要專門設(shè)備和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥、無營養(yǎng)產(chǎn)孢微生物1～10年較簡便，需制備沙土管，有效液體石蠟保藏法低溫、缺氧廣泛1年以上簡便瓊脂斜面低溫保藏法低溫4℃廣泛短時間簡便液體冷凍保藏法液體培養(yǎng)基低溫廣泛半年以上簡便一定比例甘油低溫、缺氧廣泛數(shù)十年以上簡便瓷珠冷凍保藏法低溫廣泛1年以上簡便菌種的保藏2024/4/1112

瓊脂斜面低溫保藏法

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳接時間細菌一般為營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4～6℃芽孢菌3～6個月，其他細菌約1個月酵母菌霉菌瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基4～6℃一般3～6個月真菌PDA瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基4～6℃一般3～6個月2024/4/1113

液體冷凍保藏法

菌種保存液（2mL）保存溫度保存時間金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯1%蛋白胨甘油水

10%～40%甘油-30～-80℃

半年以上或數(shù)十年

枯草芽孢桿菌大腸埃希菌膽鹽乳糖增菌液乙型副傷寒沙門菌銅綠假單孢桿菌生孢梭菌皰肉培養(yǎng)基白色念珠菌

改良馬丁培養(yǎng)基黑曲霉2024/4/1114

液體冷凍保藏法

制備方法1%蛋白胨1.5ml加入甘油0.15ml

,接種新鮮培養(yǎng)物,培養(yǎng).

保存條件

-80℃可保存數(shù)年.

2024/4/1115瓷珠菌種保存

使用方法-用接種環(huán)挑取18-24小時新鮮培養(yǎng)物接入凍存液中-擰緊瓶蓋，來回顛倒制成均勻的菌懸液-使菌懸液充分吸附在小瓷珠內(nèi)外表面-將凍存管中的菌懸液吸出-使用時充分搖勻使管內(nèi)瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板

培養(yǎng)基上劃線接種或接種液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)。

保存條件

室溫保存12個月、-20℃保存12個月、-80℃可保存24個月2024/4/1116二、菌種的傳代和使用

工作菌種的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代從菌種

保藏中心獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）防止過度的傳代造

成菌種變異。

2024/4/1117

細菌的接種、分離和培養(yǎng)

接種：將微生物的培養(yǎng)物、含有微生物或可能污染有微生物的樣品接種到培養(yǎng)基上的一種操作技術(shù)。2024/4/1118

常用培養(yǎng)基種類

斜面培養(yǎng)基半固體斜面培養(yǎng)基液體斜面培養(yǎng)基平板斜面培養(yǎng)基2024/4/1119接種方法涂布法劃線法穿刺法直接加入法等2024/4/1120

分離：為了獲得純菌種（株），采用的將細菌分離成

單個細胞，使其獨立分裂繁殖形成單個菌落的

操技術(shù)。分離一般采用平板培養(yǎng)基。分離方法主要有分段劃線法、連續(xù)劃線法、

涂布分離法、傾注分離法等。2024/4/1121

接種后的培養(yǎng)基，根據(jù)不同微生物生長條件的要求，培養(yǎng)基放在適宜微生物生長的環(huán)境中溫度、濕度、氧氣等），使其生長繁殖的過程。

需氣菌培養(yǎng)法

厭氧培養(yǎng)法培養(yǎng)2024/4/1122

培養(yǎng)后微生物的生長判斷

固體培養(yǎng)基有菌落生長或沿穿刺線擴散生長。

液體培養(yǎng)基渾濁、菌膜、沉淀等。

2024/4/1123菌種的傳代和使用

凍干菌種（0代）↓增菌液培養(yǎng)（1代）↓增菌液培養(yǎng)（2代）→分裝冷凍保存↓增菌液培養(yǎng)適宜的斜面培養(yǎng)基→使用工作菌株（3代）↓

工作菌株傳代（4代）→冷凍保存↓工作菌株傳代（5代）→冷凍保存如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培養(yǎng)物，加入培養(yǎng)基中，在規(guī)定條件培養(yǎng)后冷凍保存。2024/4/1124

斜面培養(yǎng)物↓稀釋（比濁或預(yù)實驗）↓菌液稀釋↓平板計數(shù)↓驗證實驗、陽性對照

平板計數(shù)也可和試驗同時進行

菌液的制備和使用2024/4/1125

三、菌種的檢查與復(fù)壯

菌種的衰退菌種經(jīng)過長期人工傳代培養(yǎng)或保藏，由自發(fā)突變的作用

而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象?？刂凭N的衰退方法

控制傳代次數(shù)

創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件采用有效的保藏方法2024/4/1126

定期檢查

定期檢查復(fù)活、分離、純化、檢查鑒定和再保藏。發(fā)現(xiàn)變異或衰退，應(yīng)及時給予恢復(fù)。

主要檢查項目菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查。菌種的檢查與復(fù)壯2024/4/1127菌種的復(fù)壯

主要采用分離純化的方法。經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化特征、代謝產(chǎn)物、血清學(xué)等一系列實驗鑒定，證明復(fù)壯后的菌種與原種完全一致，方可認為菌種已被復(fù)壯。菌種的檢查與復(fù)壯2024/4/1128

四、菌種的管理

使用菌種的單位，應(yīng)具備從事微生物工作的條件和設(shè)備。菌種應(yīng)由專人負責(zé)管理，管理人員應(yīng)具有微生物專業(yè)知

識和技術(shù)水平，并應(yīng)具有較強的責(zé)任心。

2024/4/1129菌種的管理

實驗室必須建立菌種保存和使用文件化的程序管理制度；

包括：每支菌種標(biāo)注名稱、標(biāo)準(zhǔn)號、接種日期、傳代次數(shù)、進出、收集、貯藏、保存、確認試驗以及銷毀的記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購記錄、從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作記錄，如菌種定期轉(zhuǎn)種傳代，鑒定（純度、特性）、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、菌種保存的位置和條件及其它需要的程序。2024/4/1130菌種應(yīng)冷藏或冷凍保存，保存菌種的冰箱不得放置食品和易揮發(fā)性藥品，放置菌種應(yīng)有專用的冰箱，應(yīng)上鎖管理。由專人按操作規(guī)程和有關(guān)要求定期進行傳代，并定期對保存的菌種進行檢查，一般每年1～2次，（或定期更換凍干菌種）。發(fā)現(xiàn)菌種的異常情況應(yīng)及時檢查。一旦發(fā)現(xiàn)菌種污染和變異現(xiàn)象，應(yīng)立即報告、研究處理。尤其長期保存時。

菌種的管理2024/4/1131

詳細記錄菌種的來源、接收、傳代、分離、復(fù)壯、使用和鑒定等均應(yīng)做好詳細記錄。包括菌保存位置、環(huán)境(溫度)、種傳代或使用時間、名稱、菌號、代數(shù)、傳代或保存形式、分離、復(fù)壯方式、使用內(nèi)容、鑒定情況等都應(yīng)進行詳細的記錄。2024/4/1132菌種不得隨意帶出實驗室，外單位索取、購買應(yīng)有證明和登記，并包裝嚴(yán)密。菌種處理應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，滅菌處理應(yīng)有詳細記錄。

2024/4/1133菌懸液的制備與保存

采用經(jīng)驗證的方法制備菌懸液，除另有規(guī)定外，微生物限度試驗用菌懸液的制備如下：

1、接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時.2、接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。2024/4/11343、接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基

中，培養(yǎng)5～7天。加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化

鈉溶液，將孢