抗體的分離純化原理和測定

關(guān)于抗體的分離純化原理和測定第一節(jié)抗體的分離純化

無論是將抗體用于研究還是用于檢測或臨床治療，均需對抗體進行分離與純化。分離：將抗體從其存在的體液或培養(yǎng)液中分離出來并加以初步純化。純化：提高分離出來的抗體的純度，并將其中的雜質(zhì)控制在所需的低水平。對治療性抗體尤為重要。第2頁,共126頁，2024年2月25日，星期天分離純化的方法可依據(jù)抗體的特性進行分離純化：據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異，以鹽析的方法將抗體與其他蛋白分開；據(jù)抗體帶有電荷的不同，用離子交換，電泳等技術(shù)分離…..按分離方法：沉淀、鹽析、膜技術(shù)、電泳、色譜等。其中只有電泳和色譜法可以將抗體精細分離即純化。第3頁,共126頁，2024年2月25日，星期天一、鹽析法（一）原理蛋白質(zhì)的溶解度在一定范圍內(nèi)隨鹽的濃度變化而變化。在低鹽濃度下溶解度隨著鹽濃度升高而增加，當(dāng)鹽濃度達到一定水平時，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白質(zhì)分子的極性基團有著靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽類時，鹽類離子與水分子對蛋白質(zhì)分子上的極性基團的影響，使蛋白質(zhì)在水個溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷被中和，水化膜破壞，致使蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度不同面達到彼此分離的方法。第4頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（二）鹽的選擇

蛋白質(zhì)鹽折常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，其優(yōu)點是溫度系數(shù)小，溶解度大(25℃時飽和溶解度為4.1mol/L，即767g/L)。在不同飽和度的硫酸銨溶液內(nèi)，不同蛋白質(zhì)依次析出，而且硫酸銨價廉易得，分段效果好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨濃溶液的pH常在4.5—5.5之間，市售的硫酸銨還常含有少量游離硫酸，pH往往在4.5以下，需用氨水調(diào)節(jié)其pH至7.0左右。第5頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(三)鹽析時需注意的問題1.鹽的飽和度鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組分的蛋白質(zhì)時，鹽的飽和度常由低到高逐漸增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進行離心分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。如用硫酸銨鹽析分離血漿蛋白，當(dāng)飽和度達20％時，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28％—33％時，優(yōu)球蛋白析出；飽和度達33％—50％時，球蛋白析出；飽和度大于50％以上時，清蛋白析出。免疫球蛋白常在飽和皮為33％開始析出。第6頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2.pH在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最?。菀壮恋砦龀?。因此，鹽析時除個別特殊情況外，pH常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點附近。

3.蛋白質(zhì)濃度在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越高越易沉淀，高濃度雖對沉淀有利，但濃度過高，也容易引起其它蛋白質(zhì)的共沉淀，因此，必須選擇適當(dāng)濃度，盡可能避免共沉淀作用的干擾。第7頁,共126頁，2024年2月25日，星期天4．溫度出于高濃度的鹽溶液對蛋白質(zhì)有一定保護作用，鹽析操作一般可在室溫下進行，但在使用某些中性鹽進行鹽析時，溫度對鹽溶解度的影響比較明顯。

5.脫鹽蛋白質(zhì)用鹽析沉淀分離后，常需脫鹽才能獲得純品。最常用的脫鹽方法是透析。通過透析袋內(nèi)外的離子交換，最后使透析袋內(nèi)溶液的鹽濃度與外界相一致。當(dāng)然，也可以使用凝膠過濾或超濾的方法除鹽。第8頁,共126頁，2024年2月25日，星期天二、膜分離技術(shù)

可以形象地將膜分離技術(shù)比喻成以多孔膜進行過濾或過篩子的過程。在實際操作時，由于膜上的孔很小，需使用一定的壓力，才能將含有待分離物質(zhì)的液體驅(qū)動通過分離膜，使具有不同分子量的物質(zhì)或通過膜、或截留于膜上而得到分離。有多種膜技術(shù)可用于抗體的分離與純化。第9頁,共126頁，2024年2月25日，星期天但最基本的是使用超濾膜。超濾膜的孔徑在1—100nm之間，其截止到分子量的范圍為幾百至一百萬，所需的驅(qū)動壓力在0.1—1.0MPa左右。第10頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(一)超濾膜的基本性能

作為膜分離材料，超濾膜的基本性能可以用透水率和截留分子量加以表征。

1．透水速率在一定的驅(qū)動壓力下，單位面積的膜在單位時間里所能透過的水的量稱為該膜的進水率(Jf)。第11頁,共126頁，2024年2月25日，星期天式中Jf為進水率，ρ為滲透系數(shù)，ΔP為壓力差，Δπ是料液的滲透壓差，ι是透過水流通道的長度，它正比于膜的厚度。通常情況下，由于Δπ很小，所以可以忽略不計、此時，透水率可簡化表達為第12頁,共126頁，2024年2月25日，星期天即透水率與操作壓力成正比，與膜厚呈反比。由于膜在使用過程中會發(fā)生污染和孔結(jié)構(gòu)的改變，因而在使用過程中，其透水率會逐漸發(fā)生變化。所以定義其初始運水量Qz和穩(wěn)定透水量Qs之比為穩(wěn)定系數(shù)Sm，即第13頁,共126頁，2024年2月25日，星期天一般情況下，Sm=0.6-0.8,不同規(guī)格和品種的膜的透水率相差很大。同時，不同的操作條件與參數(shù)，也會對實際透水量產(chǎn)生影響，這些參數(shù)包括操作壓力、料液流速、溫度以及料液的性質(zhì)等。一般情況下，在膜使用的開始和結(jié)束時，可以實際測定一下透水率。當(dāng)透水率已經(jīng)降低時，應(yīng)考慮將其清洗并再生，以恢復(fù)其透水率。第14頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2．截留分子量超濾膜的另一基本性能是標稱截留分子量。它的定義是指溶液中被截留的溶質(zhì)中最小的分子量。對于“截留分子量”這個指標，不應(yīng)做機械式的理解。例如，使用截留分子量5萬的膜時，分子量68萬的牛血清白蛋白也可通透過去。這是因為，一方面，膜上的孔的大小是不均勻的，一般情況下，有一個孔徑分布。另一方面，由于分子的形狀不同且分子鏈具有柔性，分子量相同的線型分子和球型分子的透過率是不同的，線型分子更容易透過。通常，廠家給出的截留分于量指的是截留率90％時，相對應(yīng)的蛋白質(zhì)(或其它水溶性高聚物)的分子量。在實際使用時應(yīng)注意以下幾個問題：第15頁,共126頁，2024年2月25日，星期天①一般超濾膜的截留分子量曲線多呈S形(如圖8-1)。S形透過率曲線的線性部分越陡，則截留性能亦越佳。②蛋白質(zhì)分子呈球形者其截留特性優(yōu)于呈線性者。因此，應(yīng)注意廠家給出的截留分子量是何種物質(zhì)為樣品所測定。一般情況下，裁留率順序為：球蛋白>支鏈高聚物>直鏈(線型)高聚物。③廠家給出的截留分子量是以單一蛋白質(zhì)(或水溶性大分子)為樣品所測定的。但是，實際樣品往往極為復(fù)雜，如體系中有多種蛋白質(zhì)存在時，膜的特性會因為濃差極化現(xiàn)象、‘‘凝膠層的形成”以及樣品間形成復(fù)合物等現(xiàn)象而有所改變。第16頁,共126頁，2024年2月25日，星期天圖8-1

截留分子量曲線第17頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(二)常用的超濾膜

用于生化分離的超濾膜，因使用目的的不同，有很多不同的種類和規(guī)格。若按其制造材料分，有醋酸纖維素(CA)、三醋酸纖維素(CTA)、聚砜(PS)、聚酰胺(PA)、聚酰亞胺(PI)、聚丙烯腈輕(PAN)、聚醚醚酮(PEEK)以及聚偏氟乙烯(PVDF)等。其中，以醋酸纖維素和聚砜制備的膜最為常用。膜的使用形式有平板膜、平板膜堆、管式膜、卷式膜以及中空纖維膜。其截留分子量自500-30萬不等，可按需要加以選擇。例如，當(dāng)分離IgG時，若使用截留分子量5萬以下的膜，均可達到98％的高截留率；使用截留分子量10萬的膜，截留率下降至95％。超濾膜的生產(chǎn)廠家很多，但適合于生化分離的產(chǎn)品也很有限。表8-1列出了代表件的廠家及其產(chǎn)品。第18頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共126頁，2024年2月25日，星期天三色譜法

（一）概述色譜(chromatography)，早期的文獻上曾翻譯為“層析”，具意義是很準確的。前國內(nèi)使用較多的則是“色譜”一詞。色譜是一種現(xiàn)代分離、分析方法，也是研究物理、化學(xué)和生物過程的很好的工具。色譜分離過程的本質(zhì)是溶質(zhì)在流動相和固定相之間分配的差異。任何兩種不同的物質(zhì)，只要它們存在有不同的物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)上的差異，而且還表現(xiàn)于在不同物相上分配系數(shù)的差異的話，它們便都可以在色譜過程中得到分離、分析或測定。第20頁,共126頁，2024年2月25日，星期天這里，所謂不同的物相可以包括氣相、液相、固相和超臨界相。不同物相的配合，可以得到不同的色譜類型，如氣相色譜系以氣相為流動相，以固相或載有液相的固體為固定相進行物質(zhì)的分離；液相色譜則以液體為流動相，以廣義的固相為固定相而進行分離。通常，均將固定相裝填于柱子中，即以色譜柱的形式進行工作。因此，色譜柱是進行色譜分離的主要場所。發(fā)生在色譜柱中的分離過程受熱力學(xué)因素和動力學(xué)因素的控制。為得到滿意的分離，首先必須考慮固定相的性質(zhì)從其與溶質(zhì)相互作用的強弱，這主要體現(xiàn)在色譜柱填料(在生物學(xué)文獻上常稱為“介質(zhì)”)第21頁,共126頁，2024年2月25日，星期天的設(shè)計、合成及選擇。為使不同的物質(zhì)盡可能地得到分離，亦即色譜峰盡可能地高而窄(色譜學(xué)的術(shù)語稱之為“譜帶展寬盡可能地小”)，就需要對柱子進行優(yōu)化設(shè)計．并將填料填充成性能優(yōu)良的柱子。同時，由于流動相的種類與使用條件既可影響動力學(xué)因素，又影響熱力學(xué)因素，故必須正確地選擇并優(yōu)化色譜條件，才能得到滿意的分離。第22頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

假設(shè)有兩個溶質(zhì)A和B，將它們注射進色譜柱后，便會在流動相的攜帶下通過色譜柱并獲得分離。在柱子出口處設(shè)置一個檢測器，便能記錄下流經(jīng)出口的溶質(zhì)的濃度的變化。這種濃度—時間曲線便是該物質(zhì)的色譜圖(圖8-2)。色譜圖上，可以見到溶質(zhì)的色譜峰：如A峰、B峰。同時，也有不保留物質(zhì)或雜質(zhì)形成的峰。沒有峰時的信號軌跡形成基線。從色譜圖上，可以直接得到或通過計算得到一系列的色譜參數(shù)，如保留時間、峰高、峰寬等。表8-2匯總了主要的色譜參數(shù)及其定義。第23頁,共126頁，2024年2月25日，星期天圖8-2色譜圖及其參數(shù)第24頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共126頁，2024年2月25日，星期天上面所舉出的各種色譜參數(shù)和名詞中，最重要的是保留時間TR、保留體積VR、容量因子K’、分離因子α以及分離度R。保留時間和保留體積指的是色譜峰出現(xiàn)的時間；容量因子，表示樣品在固定相上的被吸附的程度；分離因子表示樣品的選擇性的大??；分離度則用以表示兩個色譜峰分離的程度。按照分離原理的不同，可以將色譜方法分成不同的模式(表8-3)。第26頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

當(dāng)然，表中所例舉的各種色譜模式，還可以再細分為不同的類別。在抗體的分離、純化中，用得最多的是離子交換色譜、凝膠色譜與親和色譜。在以色譜技術(shù)進行抗體的分離純化時，還應(yīng)注意柱色譜和高效液相色譜(HPLC)的區(qū)別，以便實現(xiàn)對樣品的最有效、最合理的分離。在通常的柱色譜中，多使用軟質(zhì)凝膠或強度較好的半硬膠為基質(zhì)，填料的粒徑約40-150um。第28頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

（二）凝膠過濾

凝膠過濾是體積排除色譜的一種。在排除色譜中，溶質(zhì)即待測樣品組分，與填料(或介質(zhì))以及流動相之間沒有額外的相互作用，樣品只依據(jù)其分子體積(流動力學(xué)體積)的大小而分離。

1953年，Porath和Flodin首先用交聯(lián)預(yù)聚糖凝膠在水溶液中分離水溶性高分子，其商品名稱即Sephadex，由于其突出的優(yōu)點，立即得到了生物醫(yī)藥界的承認和廣泛的應(yīng)用。這種分離技術(shù)被稱為凝膠過濾。

1964年出現(xiàn)的以苯乙烯—二乙烯苯共聚物為基質(zhì)的不同孔徑的有機高分子凝膠，解決了分子量幾千至幾百萬的合成高分子的體積排除色譜分離問題。其后，體積排除色譜得到了快速發(fā)展并日臻完善，成為高效液相色譜家族中重要的一員。第29頁,共126頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾色譜的突出優(yōu)點：①出峰迅速，任何組分的保留體積均在Vi和V0之間，且不需要梯度淋洗；②溶質(zhì)與固定相(填料)和流動相之間沒有相互作用；③分離時不會滯留雜質(zhì)或殘留物在柱上，故柱壽命長；④可用以測定生物大分子的分子量；⑤生物相容性好，有很高的活性回收率；⑥柱負載較大，利于制備分離。缺點：分辨率及峰容量均相對較低。第30頁,共126頁，2024年2月25日，星期天1．原理凝膠過濾色譜是在裝填有多孔性材料的色譜柱中進行的。多孔材料的孔有大有小?？讖接衅洹翱讖椒植肌?，當(dāng)流動相攜帶分子量不同的溶質(zhì)進入色譜柱后，因濃度差而可能滲入或擴散進入填料的孔中：也就是說，溶質(zhì)在兩相中的運動的動力是濃度梯度。但是，分子體積的大小，造成了在孔中擴散路徑的差異，這可以從圖8-3看出：第31頁,共126頁，2024年2月25日，星期天單孔中的體積排除第32頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

形象地說，填料顆粒上的孔有大有小，但對于溶劑分子來說，它們是足夠大的，可以允許它們自由地擴散、進出。但是，對于體積大的分子來說，它們只能進入尺寸比它大的孔；對于比顆粒上的孔還要大的分子，則只能從孔旁流過。換句話說，分子量或分子體積較小時，能占有更多的孔體積。這樣，分子體積不同的混合物一齊進入柱端時．經(jīng)過淋洗、擴散，總是體積大的分子先流出柱子，小分子物質(zhì)(即體積小)因進入凝膠顆粒，行程延長而滯后流出．從而使兩者得以分離。第33頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2．常用的凝膠種類凝膠是膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，它們的內(nèi)部都具有很微細的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用于凝放過濾的常用凝膠有以下幾種：(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠(2)瓊脂和瓊脂糖凝膠

(3)聚丙烯酰胺凝膠

(4)其它凝膠過濾介質(zhì)第34頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(1）交聯(lián)葡聚糖凝膠

交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)，是最早出現(xiàn)的凝膠過濾介質(zhì)。其基本骨架是葡聚糖，由許多右旋葡萄糖單位通過l,6-糖苷鍵連接成鏈狀結(jié)構(gòu)，再由3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷作交聯(lián)劑，將鏈狀結(jié)構(gòu)連接起來形成具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。其網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)度和葡萄糖的比例以及反應(yīng)條件來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越疏松。交聯(lián)葡聚糖凝膠化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可工作于pH2-11范圍內(nèi)。表8-4列出了其規(guī)格性質(zhì)。第35頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(2)瓊脂和瓊脂糖凝膠：

瓊脂來源于一種海藻，其結(jié)構(gòu)為D-乳糖和3,6-無水-L-乳糖兩種糖的殘基所組成的多聚糖。瓊脂糖有較大的孔隙，允許較大分子滲入，能分離較高分子量的物質(zhì)，其工作范圍遠大于交聯(lián)葡聚糖和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠的最大缺點是它帶有大量電荷(主要是璜酸基，也有一定量的羥基)，過濾時常需使用較高離子強度的洗脫液，使分離物質(zhì)中的鹽濃度過高，影響純度。因不同廠家而異，主要商品有Sepharose系列等，其種類和特性見表8-5。第37頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(3)聚丙烯酰胺凝膠：

它是一種人工合成的凝膠，如生物凝膠-P(Bio-gel-P)，產(chǎn)品為顆粒狀干粉，在溶劑中能自動吸水膨脹成凝膠。聚丙烯酰胺系內(nèi)丙烯酰胺經(jīng)自由基聚合而成的線性高聚物，與甲叉雙丙烯酰胺共聚能生成交聯(lián)的聚丙烯酰胺，經(jīng)干燥粉碎或加壓成形處理即成生物凝膠-P。除了聚丙烯酚胺凝膠，完全是出碳—碳骨架構(gòu)成的．機械強度較好，適宜作為凝膠過濾的介質(zhì)。缺點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團，影響其使用范圍。（如表8-6）第39頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共126頁，2024年2月25日，星期天3．凝膠的選擇

前述各種凝膠在微觀結(jié)構(gòu)上是很相似的，它們都是三維空間網(wǎng)狀交織的高分子聚合物。所能適用的分子量范圍，主要決定于凝膠顆粒內(nèi)部微孔孔徑的大小?；旌衔锏姆蛛x程度，則取決于凝膠的粒度和凝膠的結(jié)構(gòu)。凝膠的粒度一般分為三級：40—60篩孔屬粗粒，100—200篩孔屬細粒．250—400篩孔屬最細粒；也有的廠家將其按粒徑劃分，即粗(200—600)、中(100—300)、細(40—160)和超細(20—80)四級。其中，以細粒的應(yīng)用較多，因為它能使洗脫曲線的峰區(qū)變得對稱而狹窄；使用過細的凝膠時，因洗脫阻力增大，使洗脫時間延長。

第41頁,共126頁，2024年2月25日，星期天與凝膠孔徑大小有直接關(guān)聯(lián)的是凝膠中的瓊脂糖或葡聚糖的比例，以及凝膠的交聯(lián)度；凝膠交聯(lián)度越高，孔徑越小，反之孔徑就越大。應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)分子量的大小與形狀，選擇不同孔徑和文聯(lián)度的凝膠。此外，如果用于脫鹽，則宜選擇SephadexG25等排阻極限較小的凝膠。第42頁,共126頁，2024年2月25日，星期天4．凝膠的填裝

商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需充分膨脹。（煮沸可充分溶脹，消毒，除去凝膠中污染的細菌。排除氣泡）。裝柱前凝膠應(yīng)充分洗滌，除去細顆粒，并減壓抽氣排除氣泡。將處理好的凝膠以適宜的緩沖液懸浮起來，趁其尚未沉降時，均勻而連續(xù)地傾倒入垂直放置的空柱子中。柱子的底部，應(yīng)預(yù)先放有過濾網(wǎng)或篩板。開放柱子底部活塞或螺旋夾，令緩沖液流出，而凝膠則滯留在柱子中形成均勻而穩(wěn)定的柱床。在這一過程中，切忌流干或部分流干。填裝軟凝膠的柱子時，須注意不可使凝膠受到過高的壓力，不宜使用減壓或加壓的方法；而硬膠，即高交聯(lián)度的凝膠，則可使用水泵減壓或以蠕動泵驅(qū)動的方法加速柱床的形成。第43頁,共126頁，2024年2月25日，星期天5．凝膠柱的檢查

樣品的分離效果主要取決于裝填起來的層析床是否均勻。為了確保分離效果，使用前應(yīng)檢查凝膠柱的質(zhì)量。即用肉眼觀察層析床是否均勻，有無“紋路’’或氣泡，或向?qū)游龃布尤氪蠓肿佑猩镔|(zhì)，觀察色帶移動。色帶狹窄，均勻和平整即說明柱子性能良好。色帶出現(xiàn)歪曲，散亂，變寬時必須重新填裝柱子。第44頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（三）離子交換色譜1．原理在適宜的載體上，例如在纖維素，瓊脂糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及各種合成高聚物型凝膠上，通過酯化、醚化或氧化等化學(xué)反應(yīng)，引入具有堿性或酸性離子基團，便可制備出各種類型的離子交換填料。按照表面基團的不同，可以將離子交換填料分成陰、陽兩類，其中又有強、中、弱之分。常見四種類型是：強陰型(SAX)，如[N(CH3)3]+(QAE)

中陰型(MAX)，如一O一(CH2)2一N(C2H5)2(DEAE)

強陽型(SCX)，如一SO3-H+(SA)

弱陽型(WCX)，如一OCH2COOH(CM)第45頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

當(dāng)離子交換填料帶有陽離子基團時，便可交換陰離子樣品，稱之為陰離子交換樹脂；當(dāng)交換劑帶有陰離子基團時，便可交換陽離子樣品，稱之為陽離子交換樹脂。將所需的離子交換樹脂制備成柱后，便可將其用于蛋白質(zhì)、酶、激素以及病毒等的分離。第46頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

通過改變流動相的pH值和離子強度，便能以可逆的吸附和釋放作用，在柱子上分離蛋白質(zhì)樣品，達到純化之目的。由于各種蛋白質(zhì)的等電點、分子大小、電荷及與離子交換劑結(jié)合的強度不同，故可利用不同的置換條件將它們分開。由于各種離子交換劑吸附和釋放的能力不同，可以被不同的緩沖液洗脫。有些蛋白質(zhì)層析時應(yīng)改變洗脫液PH值。以減少蛋白質(zhì)分子上的電荷數(shù)目；或適當(dāng)增加鹽類濃度，與蛋白質(zhì)競爭結(jié)合位置，以減低靜電鍵的結(jié)合可達到分離(表8-7)。第47頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2常用離子交換劑

從原則上講，任何親水凝膠均可以作為基質(zhì)，再經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾而制備出各種離子交換劑。因此，相應(yīng)的離子交換劑也有纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等系列。根據(jù)離子交換劑的性能，又可分為陽離子交換劑，陰離子交換劑兩大類。表8-8、8-9及8-10為常用的一些離子交換劑種類。第49頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共126頁，2024年2月25日，星期天3．羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)

羥基磷灰石是一種特殊的離子交換劑，其主成分為羥基磷酸鈣。天然的羥基磷灰石屬六方晶體，由于有很好的生物相容性，故可以用作生物醫(yī)學(xué)材料。1983年Bio-Rad公司生產(chǎn)并開始銷售由無定形羧基磷灰石填充的高效液相色譜柱。實際上，這種羥基磷灰石系由細小的片狀結(jié)晶所織成，因而柱效、柱子的通透性以及柱床的穩(wěn)定性均不是很好。由于粒徑的減小，使得色譜柱的阻力增高，只能用于高效液相色譜，而不能用于通常的柱色譜。第52頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

正是由于羥基磷灰石的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)特性，使得它具有獨特的分離機理。羥基磷灰石晶體上有兩種不同的晶面，形成了兩種具有不同吸附特性的吸附位點，即位于Ca2+離子上的吸附陰離子的位點和位于[PO43-]離子上的吸附陽離子的位點。而OH-不參與吸附過程。這種吸附作用的機理，使得它具有很高的吸附容量。第53頁,共126頁，2024年2月25日，星期天4、離子交換劑的選擇和處理(1)選擇：如前所述，離子交換劑由基質(zhì)和帶電的基團構(gòu)成，常用的有DEAE和CM，前者為弱陰型，后者為弱陽型。常用的離子交換劑，既有陰、陽離子之分，也有強、弱之別。因此，應(yīng)根據(jù)純化蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，決定離子交換劑以及相應(yīng)的淋洗條件的選擇；如使用陰離子交換劑，則所應(yīng)用的pH值應(yīng)高于蛋白質(zhì)等電點，以使蛋白質(zhì)呈陰離子性．反之亦然。此外，弱離子交換劑用于分離對電荷具有高親和力的蛋白質(zhì)，而強離子交換劑則用于分離對電荷具合較低親和力的蛋白質(zhì)(表8-11)。不過，一般不推薦使用強陽或強陰型離子交換劑，田其有導(dǎo)致蛋白變性之慮。第54頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

離子交換刑的吸附能力(即樣品的負載量)取決于離子交換基團的含量。離子交換基團愈多，交換量愈大，吸附容量亦愈大。通常，上樣量在離子交換劑交換容量的5％以下時，可獲得較好的分離效果。但是，如考慮進行制備型分離，則可不受此限。第56頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(2)處理：

處理纖維素離子交換劑時，一般允將所需量的交換劑輕輕加入0.5mol／LNaOH溶液中，略加攪拌，待其自然沉降，室溫靜置30min后去除上清液。然后按0.5mol／LNaOH-0.5mol／LHCl-0.5mol／LNaOH順序處理。每次更換前，需用蒸餾水充分洗滌至中性，CM纖維素和微粒型纖維素在堿洗時不易沉降，可加用0.5mol／LNaCl。葡聚糖制劑不需酸和堿處理，使用時將葡聚糖凝膠放于PBS緩沖液膨脹1—2d(室溫)，或在中性溶液中煮沸2h，在處理過程中，避免強烈的攪動，以避免圓珠結(jié)構(gòu)受損，但不需除去細粒。第57頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（四）親和色譜1、原理親和色譜是利用生物分子間的專一性識別能力、即它們之間所具有的親和力而設(shè)計的色譜技術(shù)：如抗原、半抗原與其抗體、蛋白A和一些抗體之間，均具有專一性的親和力，在一定條件下能緊密結(jié)合成復(fù)合物，而這種結(jié)合又是可逆的，改變條件可將它們解離。當(dāng)把可結(jié)合的一對分子的一方（例如抗原）作為配基，通過一定的化學(xué)修飾及偶聯(lián)反應(yīng)．將其固定化于惰性載體上，便制出了親和填料，亦即親和介質(zhì)（圖8-4）。有時因為空間位阻效應(yīng)的存在，使得被分離物難以接近固定化的配基．以致會降低樣品的負載量。第58頁,共126頁，2024年2月25日，星期天親和介質(zhì)示意圖

載體空間臂配基配原第59頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

為此，可以在載體和配基之間連接一個適宜長度的分子鏈段，稱為空間臂。將制得的親和介質(zhì)填裝成親和色譜柱，以適宜的緩沖液為流動相，并令親和介質(zhì)的對應(yīng)物（如抗體）隨流動相流過該色譜柱，則會因抗原-抗體的親和相互作用，使抗體被吸附于親和介質(zhì)上。此時，與該介質(zhì)沒有親和相互作用力的其它物質(zhì)，隨流動相一起被沖出色譜柱。改變流動相的組成或淋洗條件，可以將（固定化的）抗原-杭體復(fù)合物解離，收集其流出液，便可以得到已純化的抗體。從上述親和色譜的原理可知，它具有極高的選擇性。有時甚至可以僅用一步分離，便可得到純度很高的產(chǎn)品。第60頁,共126頁，2024年2月25日，星期天親和力一對親和物質(zhì)的親和力，可以用親和常數(shù)，即結(jié)合常數(shù)來表示，用于親和色譜時，這一常數(shù)不宜過高或過低。過高，則難以洗脫。過低，則因?qū)Ｒ恍圆疃x擇性不佳。親和力常數(shù)一般在103-108之間。第61頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2、載體的選擇

使配體固相化的不溶性化合物稱為載體。用于親和色譜的理想載體應(yīng)該具備下述特性：①高度親水，使固相配體易于同水溶液中的相應(yīng)結(jié)合物接近；②惰性載體，使載體的非專一性吸附盡可能??；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團可供活化，并在溫和條件下能與較大量配體連接；④有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，不易受周圍條件(如pH、離子強度、溫度、變性劑和去污劑等)的影響；⑤具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過而增加配體的有效濃度；⑥有良好的機械性能，利于控制色譜速度，最好是均一的珠狀顆粒。第62頁,共126頁，2024年2月25日，星期天可使用的膠的種類

凝膠色滯中所使用的各種凝膠，均可作為親和色譜的載體?？贵w純化中常用的載體為瓊脂糖凝膠，它是球狀凝膠顧粒、球狀瓊脂糖凝膠親水能力很強，物理和化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。交聯(lián)型凝膠，即機械強度較高的硬膠和半硬膠、在制備型抗體分離上有其特點。它們可以使用較高的流速，從而可以得到較高的制備效率，也縮短了制備生產(chǎn)的周期。膜為載體的膜親和色譜應(yīng)用：所使用的膜材料可以是微濾膜也可以是超濾膜；既可用合成的分子膜，也可用濾紙等天然材料將數(shù)層膜疊合起來制成膜色譜柱。第63頁,共126頁，2024年2月25日，星期天3、配體的選擇

在抗體的純化中，既可以使用該抗體的抗原，也可以利用該抗體的有關(guān)特性去制備或?qū)ふ疫m合的親和配體?？乖念愃莆镆部梢杂米鳛榕浠?，盡管它們與抗體的親和力一般較小，但選擇適宜的條件，依然可以得到很好的分離效果；此外，固定化金屬離子親和色譜、以組氨酸為配基的親和色譜以及利用親和標簽等方法，均可進行抗體的親和色譜分離。第64頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(1)抗原：

根據(jù)抗原和抗體能形成抗原-抗體復(fù)合物的特性，發(fā)展了免疫親和色譜。將可溶性抗原用化學(xué)方法偶聯(lián)到不溶性載體(如sepharose4B)上，使之固相化，并填裝入適宜的色譜柱中，將相應(yīng)的抗血清加入柱中，抗血清中相應(yīng)的抗體就與抗原特異結(jié)合，其它蛋白成分隨洗液流出。改變緩沖液的pH和離子強度，就可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的抗原分開而被洗脫下來，從而得到純凈的抗體。第65頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(2)蛋白A：

蛋白A是金黃色葡萄球菌細胞壁的一種蛋白成分，它是單一的多肽鏈，分子量為42000，分為5個片段。從N末端開始有4個由58-62個氨基酸殘基組成的高度同源的片段，每個片段都具有和IgG的Fc段結(jié)合的活性。但是，就整個蛋白A分子而言，只能與2個Fc段結(jié)合，這種結(jié)合是一種疏水性作用。改變pH、鹽濃度或加入有機溶劑，則可以將IgG從蛋白A洗脫下來。蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反復(fù)處理的性能極佳，并可采用高濃度的諸如尿素、鹽酸胍或異硫氰酸鉀等變性劑進行處理而不致受到破壞，大多數(shù)抗體都能耐受短暫的低pH處理。第66頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(3)蛋白G：

蛋白G是鏈球菌表面的一種蛋白，分子量為30000-35000，它對免疫球蛋白的吸附機制與蛋白A相似。蛋白G對各種免疫球蛋白的吸附能力與蛋白A不同．故在抗體的純化上可與蛋白A互補。當(dāng)某些抗體對蛋白A沒有吸附能力時，它們往往會對蛋白G有吸附作用(表8-12，8-13)。第67頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第69頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(4)蛋白L：

蛋白L是從厭氧鏈球菌細胞表面分離出來的一種蛋白質(zhì)，分子量約72000。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它可以專一地與κ鏈相結(jié)合。但是，它與λ鏈的結(jié)合力卻很弱。經(jīng)進一步的研究發(fā)現(xiàn)，也并不是所有的κ都和蛋白L有親和力，VκI亞群、VκIII亞群可以和蛋白L結(jié)合，而VκII亞群及λ輕鏈的所有亞群則否。此外，蛋白L也能識別大鼠、小鼠、免和靈長類的κ鏈。這樣，就有可能利用蛋白L為配基，以親和色譜去分離人鼠雜交抗體和重組的小抗體片段。第70頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(5)蛋白H：

蛋白H也是一種由鏈球菌(APl株)產(chǎn)生的表面蛋白。與前面介紹的幾個蛋白不同的是，蛋白H與免疫球蛋白的結(jié)合具有溫度依賴性。在22度時發(fā)生結(jié)合，盯在37度時則解離。它能以很高的親和力與人IgGl-IgG4、人IgGFc以及免IgG相結(jié)合。但是，不與人IgA、1gD、IgE、IgM以及大鼠、小鼠、牛、綿羊和山羊的IgG相結(jié)合。蛋白H具有很強的種屬專一性和溫度依賴性。很溫和的條件下，利用蛋白H去純化重組人單抗及其片段。第71頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(6)組氨酸：

早在10年前便已發(fā)現(xiàn)，以組氨酸為配基的親和色譜，可用以分離IgG。關(guān)于組氨酸與IgG之間的親和力，不同條件下有所差異。與組氨酸之間的親和作用力恰好適于親和色譜的要求。是一種簡單、有效、方便、價廉的分離純化IgG的親和色譜配基。組氨酸可以固定于任何載體上，例如：常用凝膠、交聯(lián)凝膠、高效凝膠、中空纖維以及其他膜材料上，非常適合制備分離之用。第72頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(7)固定化金屬離子：

利用帶有整合基團的凝膠或樹脂，將金屬離子以整合作用吸附或固定于其上。固定化的金屬離子能和蛋白質(zhì)分子鏈上的一些殘基，如組氨酸相互作用，產(chǎn)生親和作用力而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。這種方法被稱為固定化金屬離子親和色譜（IMAC)或稱為金屬整合親和色譜(MCAC)。

IMAC中常用的整合基團有亞胺基二乙酸基(IDA)和亞胺基二乙醛基(IDAD)等；常用的金屬離子有Zn2+、Ni+

、Mg2+、Cu2+等；可以選用任何載體以制備親和色譜柱。第73頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

為進一步增強分離的效果，可以在設(shè)計重組抗體時，在抗體鏈段的N端或C端融合上一串寡聚組氨酸鏈（6His，4His等），就像給重組抗體加上了一個標簽(tag)。這樣，便可以用IMAC柱子(帶有His的融合蛋白一般用鎳柱純化)很方便地將融合蛋白分離出來；得到的融合蛋白再以適當(dāng)方法去掉寡聚組氨酸，就能回收純化的蛋白。這種方法簡單、有效，運用得當(dāng)時，可收到很好的效果。（如果要去掉His，采用FactorXaProtease酶解即可）第74頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（五）高效液相色譜

前述各種色譜模式，已在生化實驗室中獲得了廣泛的應(yīng)用。但是，人們常為柱色譜(層析)的費時和低效而苦惱，通過色譜基本理論的研究可知，在填充色譜柱中，填料粒徑、形狀以及填充柱床緊密程度的不均一性，都會對色譜柱的性能產(chǎn)生影響。這些效應(yīng)對柱子理論塔板高度的影響，與填料顆粒的粒徑及粒徑分布密切相關(guān)。粒徑大時柱效低；粒徑小則柱效高；此外，填料顆粒的粒徑分布均勻時，柱效也相應(yīng)會高一些。因此，為提高柱效，應(yīng)使用細粒徑的填料，并要求填料的粒徑分布盡可能地均勻，甚至使用粒徑單分散的填料。正是基于這樣的原理，在20世紀70年代出現(xiàn)了以使用細粒徑填料為特征的高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)。第75頁,共126頁，2024年2月25日，星期天高效液相組成示意圖12345輸液系統(tǒng)2進樣系統(tǒng)3色譜柱4檢測器

5數(shù)據(jù)處理及控制系統(tǒng)第76頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第77頁,共126頁，2024年2月25日，星期天灌流色譜在灌流色譜的填料上，既有50-150um的微孔，又有貫穿整個顆粒的600-800um的超大孔存在，允許流動相直接進入填料顆粒內(nèi)部貫穿而過。柱子通透性很好，高流速條件下也不需要增加工作壓力。因此該種色譜柱同時具有高流速、高效率、高樣品負載率和低操作壓力（poros柱）。第78頁,共126頁，2024年2月25日，星期天灌流色譜填料示意圖擴散孔貫穿孔第79頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第80頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第81頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)抗體的測定

抗體的測定．包括抗體純度、含量、抗體活性、抗體特異性以及抗體親和力的測定等幾個方向。這些指標與參數(shù)對抗體的研究與應(yīng)用均十分重要．特別是近年來，隨著越來越多的治療用抗體進入臨床，必須嚴格地控制抗體制品的純度、含量和活性等指標。同時，對與其相關(guān)的其它一些參數(shù)，也需要加以測定。常用的方法．如RIA和ELISA等已很成熟。但是，這些方法往往較為煩瑣是需較多的時間并難于測定動態(tài)的過程。因此，需要發(fā)展簡單、準確、方便、快速和動態(tài)的檢測新方法。新的方法中，最引入注目的是基于表面等離子體共振的“生物相互作用體系”

(BIAcore)；利用BIAcore，可以快速、準擊、靈敏、方便、及時地測定抗原—抗體相互作用的動態(tài)過程。相對于常規(guī)的酶聯(lián)免疫和放射免疫等方法，這無疑是一個巨大的進步。第82頁,共126頁，2024年2月25日，星期天一抗體特異性的測定

抗體的特異性，指的是一種抗體識別只有不同結(jié)構(gòu)抗原的能力。或者說,一種抗體僅與具有特定分子結(jié)構(gòu)的抗原才發(fā)生明顯的分子識別作用。一般情況下，抗原與抗體之間的特異性相互作用，發(fā)生于抗原上的抗原決定簇與抗體上的抗體結(jié)合部位之間。而當(dāng)其它某種分子也具有類似結(jié)構(gòu)時，它也能與抗體發(fā)生類似的分子識別作用，這就是交叉反應(yīng)(crossreaction)。第83頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

抗體的特異性是決定抗體應(yīng)用價值的關(guān)鍵，可以用多種力法進行測定，其基礎(chǔ)均是利用了抗原—抗體特異性相互作用；這種測定可以通過沉淀、凝集等作用的直接觀察進行．但往往靈敏度較低。近年來，一些新的儀器和方法，如酶免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)；以及表面等離了體共振(SPR)和石英晶體微天平(QCM)等．被用于直接測定抗體的特異性，靈敏度可達到ug／m1或更低。第84頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

本節(jié)僅介紹酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、放射免疫測定（RIA）、免疫熒光測定三種方法。第85頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（一）ELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

第86頁,共126頁，2024年2月25日，星期天原理：ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體─聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法第87頁,共126頁，2024年2月25日，星期天ELISA圖8-9酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA

底物酶標抗體Ab（待測）Ag第88頁,共126頁，2024年2月25日，星期天ELISA常用的酶和底物辣根過氧化物酶，底物為OPD,深桔黃色，檢測波長492nmTMB，藍綠色，檢測波長450nm

堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－硝基苯磷酸酯）,黃色檢測波長405nm

ELISA各步驟的反應(yīng)時間

包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml

封閉：37oC2h或4oC過夜（3％BSA）樣本反應(yīng)時間：37oC45min-1h

酶標抗體反應(yīng)時間：37oC45min-1h

顯色時間：15min(避光）設(shè)對照可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?/p>

第89頁,共126頁，2024年2月25日，星期天辣根過氧化物酶標記方法酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。辣根過氧化物酶的標記常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。第90頁,共126頁，2024年2月25日，星期天ELISA常規(guī)生色底物辣根過氧化物酶底物：ABTS水溶性HRP底物，在過氧化物酶的作用下產(chǎn)生綠色終產(chǎn)物。該綠色產(chǎn)物在410nm及650nm具有兩個主要的吸收峰。OPD和HRP反應(yīng)時生成桔黃色的產(chǎn)物，在492nm時吸收最大。OPD易溶于底物緩沖液，如StablePeroxidaseSubstrateBuffer。TMB被過氧化氫氧化時（由HRP催化）可形成藍色產(chǎn)物，主要吸收峰在370nm和652nm。加入硫酸或磷酸后，它會變成黃色，最大吸收峰為450nm。TMB靈敏度很高，達到相同的檢測靈敏度需要的量比ABTS少，但這也可能產(chǎn)生較高的背景，所以要求使用較少的蛋白或較低的抗體濃度。第91頁,共126頁，2024年2月25日，星期天堿性磷酸酶色底物PNPP堿性磷酸酶和PNPP反應(yīng)后，形成黃色水溶反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物在405nm處有光吸光。半乳糖苷酶底物ONPGONPG是一種卓越的b-半乳糖苷酶底物。該產(chǎn)品完全可溶，并且在450nm具有高的消光系數(shù)。它產(chǎn)生一種黃色產(chǎn)物，用1M碳酸鈉終止后在可見光范圍內(nèi)進行檢測。第92頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2類型（1）間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。方法：抗原包被封閉待檢抗體洗滌酶標二抗洗滌顯色反應(yīng)終止反應(yīng)ELISAReader檢測OD值第93頁,共126頁，2024年2月25日，星期天(2)雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法。

只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。常用的組合：單克隆抗體＋多克隆抗體單克隆抗體＋單克隆抗體后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。例如各種細胞因子的檢測。第94頁,共126頁，2024年2月25日，星期天雙抗體夾心法測抗原的方法：捕獲抗體包被封閉（3％BSA）待測抗原洗滌（含0.1％Tween的PBS)酶標單抗或多抗洗滌顯色檢測第95頁,共126頁，2024年2月25日，星期天1）抗體固相測抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。方法：抗體包被封閉同時加入待測抗原和酶標抗原洗滌酶底物顯色ELISAreader檢測(3)競爭法測抗原第96頁,共126頁，2024年2月25日，星期天2）抗原固相測抗原其原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。方法:a:抗原包被96孔板；b:封閉;c:待測抗原與抗體反應(yīng)一定時間；d:加入96孔板

e:洗滌f：加入酶標二抗

g：洗滌h：顯色和檢測如臨床血清樣本的檢測以及細胞培養(yǎng)上清的檢測第97頁,共126頁，2024年2月25日，星期天第98頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（4）IgM抗體的檢測1）間接法：間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定血清中的IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。方法

a:抗原包被96孔酶標板；b:封閉;c:待測血清與A蛋白反應(yīng)一定時間后離心

d:吸取上清液加入96孔酶標板

e:洗滌f：加入酶標抗IgM的抗體

g：洗滌h：顯色和檢測第99頁,共126頁，2024年2月25日，星期天（5）ABC-ELISA技術(shù)（AvidinBiotinComplex-ELISA原理親和素是一種分子量是60，000的堿性蛋白，由四個相同亞基組成，每個亞基有一個生物素分子結(jié)合點。兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種材料所標記，成為一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素化抗體可捕獲多個親和素，后者再與酶結(jié)合，加入底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。這一系統(tǒng)可以大大提高ELISA的靈敏度。操作過程：抗原包被封閉待檢標本生物素化抗體洗滌酶標記親和素洗滌加底物顯色和檢測第100頁,共126頁，2024年2月25日，星期天EE生物素親和素底物酶圖8-11ELISA(ABC)法E第101頁,共126頁，2024年2月25日，星期天

（二）免疫熒光技術(shù)

利用某些熒光素，如FITC(異硫氰酸酯)、RB-200(羅丹明)等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測未知抗原或相應(yīng)配體。第102頁,共