結(jié)核病診斷技術(shù)

第2章實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查，特別是細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診和治療的主要依據(jù)。結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)主要包括4項(xiàng)基本技術(shù)，即涂片染色鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)、分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)、分枝桿菌菌種鑒定。檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)臨床醫(yī)師檢驗(yàn)申請(qǐng)要求并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和技術(shù)條件，負(fù)責(zé)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)，及時(shí)、準(zhǔn)確地填寫檢驗(yàn)報(bào)告。

近年來，國內(nèi)、外研究者在分子生物學(xué)、分子微生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域建立了若干快速、敏感、特異的檢測新技術(shù)，為可疑結(jié)核病患者的早期診斷與合理治療帶來了新的希望。列入“規(guī)范”的結(jié)核桿菌臨床基因擴(kuò)增(PCR)檢驗(yàn)技術(shù)、分枝桿菌快速培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)、免疫學(xué)檢測技術(shù)，因有多種試劑盒(試劑)及分析儀器可供選擇，目前尚難制定統(tǒng)一的技術(shù)操作規(guī)范，故暫定為輔助操作技術(shù)。具備開展這些技術(shù)項(xiàng)目條件的實(shí)驗(yàn)室(或檢驗(yàn)科)，須經(jīng)有關(guān)主管部門批準(zhǔn)后，嚴(yán)格按照相應(yīng)技術(shù)所附的說明書與操作規(guī)程實(shí)施。

鑒于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查，特別是細(xì)菌學(xué)檢查在結(jié)核病控制工作中的重要性，為保障相應(yīng)檢查項(xiàng)目結(jié)果的可靠性，要求相應(yīng)的檢查項(xiàng)目必須由經(jīng)過培訓(xùn)并考核合格的專職人員完成，且開展相應(yīng)檢查的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備安全操作設(shè)施，制定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制措施，同時(shí)接受專業(yè)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制督導(dǎo)和培訓(xùn)。第一節(jié)結(jié)核茵檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)則

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須具有與其服務(wù)級(jí)別相應(yīng)的裝備，其原則是能滿足該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室的需要，使實(shí)驗(yàn)室工作人員得到充分的防護(hù)，并避免造成環(huán)境污染。

1．實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有合理布局及合適的單向(外排)通風(fēng)體系。

2．實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備相應(yīng)的防護(hù)設(shè)備，以保護(hù)工作人員的安全和實(shí)驗(yàn)工作的順利進(jìn)行。分離培養(yǎng)、藥物敏感性測定、菌種鑒定試驗(yàn)等操作應(yīng)設(shè)有生物安全操作柜或接種間和通風(fēng)櫥等。

3．實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)按正確方式進(jìn)行技術(shù)操作，穿戴隔離衣、口罩和帽子等。

4．實(shí)驗(yàn)室所有帶毒廢棄物應(yīng)滅菌及無害化處理。

5．建立清潔消毒制度，限制非工作人員進(jìn)入室內(nèi)，禁止在實(shí)驗(yàn)室飲食和吸煙等。

6．進(jìn)行下列操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照技術(shù)操作規(guī)范，防止產(chǎn)生細(xì)菌氣溶膠：①涂片制作；②培養(yǎng)液的傾倒和轉(zhuǎn)移；③高速混合含菌液體；④滴加、接種培養(yǎng)物；⑤吸管稀釋和混合菌懸液；⑥取樣器和振蕩器的使用；⑦細(xì)菌細(xì)胞超聲粉碎；⑧感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。第二節(jié)標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存

初診患者應(yīng)送3份痰標(biāo)本(夜間痰、清晨痰和即時(shí)痰)。如無夜間痰，在留取清晨痰后2～3h再留取1份痰標(biāo)本，或在送檢時(shí)，留取2份即時(shí)痰。療程中或復(fù)診隨訪患者按期每次送檢2份痰(清晨痰和夜間痰)。一、痰標(biāo)本的采集

1．即時(shí)痰為病人就診時(shí)咳出的痰液；清晨痰為就診當(dāng)天清晨深咳出的痰液；夜間痰為就診前夜咳出的痰液。合格的痰標(biāo)本應(yīng)是膿樣、干酪樣或膿性黏液樣痰液，痰量應(yīng)為3～5ml。

2．痰標(biāo)本應(yīng)由檢驗(yàn)人員或經(jīng)培訓(xùn)合格的專人驗(yàn)收，痰液不合格者，要求重新送檢。難以獲得合格標(biāo)本時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，但應(yīng)注明標(biāo)本性狀，以便分析結(jié)果時(shí)參考。

3．留取痰標(biāo)本的容器應(yīng)為廣口、直徑4cm、高2cm、有蓋密閉的塑料盒或蠟紙盒，容器上應(yīng)注明患者姓名、編號(hào)(門診序號(hào)或患者登記號(hào))及送檢日期。二、痰標(biāo)本的保存和運(yùn)送

留取痰標(biāo)本后，應(yīng)將容器密封，切勿倒置，嚴(yán)防痰液外溢。需外送檢查的標(biāo)本應(yīng)認(rèn)真核對(duì)痰盒上的標(biāo)注是否正確清晰，是否與檢驗(yàn)單一致，痰容器應(yīng)采用專用的冰盒，或以紙張和塑料袋封裝、扎牢，順序放置于包裝袋內(nèi)，注明盒蓋向上的標(biāo)示，嚴(yán)防運(yùn)送途中倒置。當(dāng)天不能檢查的痰標(biāo)本須置4℃冰箱保存。三、其他標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存

1．尿液及胸、腹水標(biāo)本留全量夜尿或胸、腹水，靜置4～5h后，棄上清液，取沉淀部分至少10ml送檢。

2．大便、膿液、病灶組織或干酪塊、腦脊液標(biāo)本應(yīng)至少留取或采集2～3ml(g)，采集后立即送檢。

3．標(biāo)本運(yùn)送和保存可參考本節(jié)痰標(biāo)本的保存和運(yùn)送。第三節(jié)涂片檢查法一、玻片的準(zhǔn)備

取經(jīng)95％乙醇擦拭脫脂的干燥、清潔、無油污、無劃痕的新玻片，于玻片背面的左端1／3處用玻璃筆編號(hào)。一張玻片只能涂抹一份痰標(biāo)本，每張玻片只能使用1次，不得清洗后再次用于抗酸染色檢查。六、廢棄標(biāo)本和污染物的處理

痰盒和廢棄標(biāo)本等污染物，均須經(jīng)高壓蒸汽滅菌后才能丟棄或清洗，嚴(yán)禁不經(jīng)滅菌隨意處理。

痰盒等污染物如采用焚燒處理，須置于焚燒爐內(nèi)徹底焚化。焚燒不徹底或暴露焚燒是有害的。

痰檢工作面的消毒：可將痰標(biāo)本置于一搪瓷盤中，在操作櫥內(nèi)進(jìn)行痰涂片操作。操作完畢后將盤與廢棄物一并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，或與操作臺(tái)面同時(shí)以3％苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外線滅菌燈(距離≤1．2m)照射30min。

附錄1：萋-尼氏染色試劑的配制

1．8％苯酚復(fù)紅染色劑堿性復(fù)紅乙醇貯存液(堿性復(fù)紅8g，溶于95％乙醇100m1中)10ml，加5％苯酚水溶液至100ml，混勻。

2．5％鹽酸乙醇脫色劑濃鹽酸5ml加95％乙醇至100ml，混勻。

3．0．3‰亞甲藍(lán)復(fù)染劑亞甲藍(lán)0．3g加95％乙醇50ml待溶解后，加蒸餾水至100ml，混勻，即為貯存母液，使用時(shí)10倍稀釋。

附錄2：熒光染色試劑的配制

1．1％金胺“O”染色液金胺“O"0．1g溶于95％乙醇10ml內(nèi)，加5％苯酚至100ml，混勻。

2．3％鹽酸乙醇脫色液濃鹽酸3ml加95％乙醇至100ml，混勻。

3．0．5％高錳酸鉀復(fù)染液0．5g高錳酸鉀加蒸餾水至100ml，混勻。第四節(jié)分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法

分枝桿菌屬(Mycobacterium)迄今報(bào)道有100多個(gè)種?！恫芟到y(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》將分枝桿菌菌種劃分為兩大類：緩慢生長分枝桿菌與快速生長分枝桿菌。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，接種很稀的新鮮培養(yǎng)物，在適宜培養(yǎng)溫度下。7d以上肉眼可見單個(gè)菌落，稱為緩慢生長分枝桿菌，其代表菌種是結(jié)核分枝桿菌(M．tuberculo—sis)。在上述條件下，7d以內(nèi)肉眼可見單個(gè)菌落，稱為快速生長分枝桿菌。分枝桿菌屬，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)及麻風(fēng)分枝桿菌外，余者統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(NontuberculosisMyco—bacteria，NTM)。

結(jié)核分枝桿菌是專性需氧菌，最適生長溫度為37℃，最適pH為6．5～7．2。對(duì)營養(yǎng)要求較高，專嗜甘油作為碳源，天門冬酰胺是最好氮源。

分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查法，是結(jié)核病確診最可靠的方法。是獲得純培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)以及其他生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。一、培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用酸性改良羅氏培養(yǎng)基。

(一)成分

谷氨酸鈉(純度99％以上)

7．2g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

14．0g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0．24g

檸檬酸鎂

0．6g

丙三醇

12ml

馬鈴薯淀粉

30g

蒸餾水

600ml

新鮮全卵液

1000ml

2％孔雀綠水溶液

20ml

注1：無機(jī)鹽試劑應(yīng)采用化學(xué)純(CP)以上等級(jí)的試劑。

注2：WHO在“結(jié)核病控制實(shí)驗(yàn)室工作手冊(cè)(1998)”中建議分離培養(yǎng)使用無淀粉的改良羅氏培養(yǎng)基。

(二)制備方法

1．基礎(chǔ)液制備量取蒸餾水600ml，加入各無機(jī)鹽成分、谷氨酸鈉和丙三醇，溶解后加馬鈴薯淀粉，混勻，沸水浴1h使呈糊狀(不時(shí)搖動(dòng)，防凝塊)，冷卻。

2．新鮮雞卵液制備洗凈新鮮雞卵表面，浸泡在70％乙醇或其他稀釋消毒液中20～30min。取出，拭干，開口，收集雞卵液，攪勻。通過消毒的紗布過濾成雞卵液。

3．培養(yǎng)基制備將600ml基礎(chǔ)液和1000ml新鮮雞卵液混勻。加入2％孔雀綠水溶液20ml，混勻，靜置1h后，分裝至標(biāo)準(zhǔn)螺旋蓋培養(yǎng)管或滅菌中試管中，每管7ml。雙層放置于擱架中，經(jīng)培養(yǎng)基蒸汽凝固滅菌器85℃凝固滅菌50min。培養(yǎng)基斜面應(yīng)占試管的2／3。制成的培養(yǎng)基應(yīng)斜面鮮艷，表面光滑，有一定韌性和酸堿緩沖能力。

4．培養(yǎng)基保存制成的培養(yǎng)基經(jīng)37℃無菌試驗(yàn)24h，檢查培養(yǎng)基污染情況后置4℃避光保存，1個(gè)月內(nèi)使用。二、去污染處理

(一)痰標(biāo)本

視標(biāo)本性狀，加1～2倍體積4％氫氧化鈉(NaOH)消化液于痰瓶中，擰緊螺旋蓋，渦旋振蕩器上振蕩1min，使痰液充分勻化，室溫放置。自加入氫氧化鈉消化液起，整個(gè)處理時(shí)間應(yīng)在15～20min。樣本份數(shù)較多時(shí)，應(yīng)分批處理。

(二)其他標(biāo)本

1．膿液采用4％硫酸(H2SO4)處理。標(biāo)本與4％硫酸(H2SO4)以1：3混勻后，靜置25min(其間振蕩數(shù)次)，按無菌手續(xù)接種0．1ml經(jīng)處理的標(biāo)本至L—J培養(yǎng)基，每份標(biāo)本接種2支培養(yǎng)基。酸處理去污染時(shí)間不超過25min。

2．病理組織或干酪塊標(biāo)本切碎后置于無菌組織研磨器，加入適量(0．5～1容積)生理鹽水后充分研磨成混懸液；混懸液經(jīng)3000r／min離心30min后，沉淀物進(jìn)行堿處理[與2～4倍量2％氫氧化鈉(NaOH)混合，處理15min]后接種。

3．尿液留全量夜尿，靜置4～5h，取沉淀部分約10ml，3000r／min離心30min，取沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4％硫酸(H2SO4)混合，處理15min]后接種。

4．胸、腹水、支氣管灌洗液標(biāo)本參照痰標(biāo)本處理方法。

5．腦脊液無菌操作收集的腦脊液，置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后將薄膜接種到L—J培養(yǎng)基；或?qū)⒛X脊液在無菌操作環(huán)境中3000r／min離心30min，取沉淀直接接種到L-J培養(yǎng)基。非無菌操作采集的腦脊液標(biāo)本，離心后的沉淀進(jìn)行堿處理[與等倍量4％氫氧化鈉(NaOH)混合，處理10～15min]后接種于酸性L-J培養(yǎng)基。

6．糞便標(biāo)本與生理鹽水混合后，充分振蕩使之成為混懸液；定性濾紙過濾后，濾液經(jīng)3000r／min離心10min；沉淀進(jìn)行酸處理[與2～4倍量的4％硫酸(H2SO4)混合，處理15～20min)后接種L-J培養(yǎng)基。

7．咽喉棉拭子將棉拭子放入一無菌試管，加入適量生理鹽水浸泡，加入等體積4％氫氧化鈉(NaOH)后強(qiáng)烈振蕩，靜置15min后接種。三、接種和培養(yǎng)

用吸管取去污染后的標(biāo)本0．1ml，均勻接種在整個(gè)培養(yǎng)基斜面，每份標(biāo)本接種2支酸性羅氏培養(yǎng)基。接種后斜面向上于37℃環(huán)境中平放24h后，檢查培養(yǎng)基污染情況，擰緊瓶蓋，直立放置，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。四、結(jié)果報(bào)告

1．接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告快速生長分枝桿菌陽性。此后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經(jīng)抗酸染色證實(shí)后，可報(bào)告分枝桿菌生長。滿8周后未見菌落生長者方可報(bào)告培養(yǎng)陰性結(jié)果。

2．觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)非分枝桿菌生長時(shí)，應(yīng)報(bào)告污染。培養(yǎng)污染率應(yīng)在2％～5％范圍內(nèi)。污染率過高，提示培養(yǎng)基滅菌不佳，標(biāo)本前處理、接種等環(huán)節(jié)有誤，應(yīng)當(dāng)分析原因，采取相應(yīng)措施。

3．培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告方式

(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長，以“培養(yǎng)陰性”報(bào)告，不可以“一”表示。

(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(1+)：菌落生長占斜面面積的1／4。

(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(2+)：菌落生長占斜面面積的1／2。

(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(3+)：菌落生長占斜面面積的3／4。

(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(4+)：菌落生長布滿整個(gè)斜面。

(6)報(bào)實(shí)際菌落數(shù)：菌落生長不足斜面面積1／4。第五節(jié)分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查

分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查是使用分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，通過測定細(xì)菌生長代謝檢測分枝桿菌生長情況的方法。由于應(yīng)用營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基，并且檢測儀能連續(xù)監(jiān)測，故提高了從標(biāo)本中分離分枝桿菌的敏感性進(jìn)而縮短報(bào)告結(jié)果的時(shí)間。為保證檢查方法的可靠性，目前分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查系統(tǒng)除提供相應(yīng)儀器、試劑以外，均根據(jù)不同系統(tǒng)制定了相應(yīng)的臨床標(biāo)本前處理、接種、檢測和報(bào)告結(jié)果的規(guī)程，故在進(jìn)行相應(yīng)的檢查時(shí)，結(jié)果的可重復(fù)性和可比性均能得到認(rèn)可。

在進(jìn)行分枝桿菌快速培養(yǎng)檢查時(shí)，標(biāo)本接種前的去污染處理，必須嚴(yán)格按照系統(tǒng)說明書中規(guī)定的方法進(jìn)行。孵育檢測過程中系統(tǒng)報(bào)告陽性時(shí)，相應(yīng)標(biāo)本的培養(yǎng)液必須首先進(jìn)行抗酸染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)抗酸菌后方可發(fā)出陽性報(bào)告。第六節(jié)分枝桿菌藥物敏感性測定法一、培養(yǎng)基

(一)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

無淀粉改良羅氏培養(yǎng)基：

谷氨酸鈉(純度99％以上)

7．2g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

2．4g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0．24g

檸檬酸鎂

0．6g

丙三醇

12ml

蒸餾水

600ml

新鮮全卵液

1000ml

2％孔雀綠水溶液

20ml

注：無機(jī)鹽試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純(CP)以上等級(jí)。

(二)抗結(jié)核藥物溶液的配制和稀釋

1．藥敏試驗(yàn)用抗結(jié)核藥物應(yīng)從廠家取得純品，并確認(rèn)純度和效價(jià)，在有效期內(nèi)使用。

2．異煙肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TBl)、乙硫異煙胺(TH)、環(huán)絲氨酸(SC)的生物效價(jià)按其重量單位計(jì)算，計(jì)算用藥量時(shí)只需考慮其純度。鏈霉素硫酸鹽(SM—SO4)、乙胺丁醇鹽酸鹽(EMB—C1)、卡那霉素硫酸鹽(KM—SO4)、卷曲霉素硫酸鹽(CPM—SO4)、紫霉素硫酸鹽(VM—SO4)、對(duì)氨水楊酸鈉鹽(PAS-Na)等在考慮其純度的同時(shí)，應(yīng)按生產(chǎn)廠家標(biāo)定的毫克效價(jià)計(jì)算其鹽型藥用量。

3．加入培養(yǎng)基中實(shí)際藥量的計(jì)算可參考下列公式：

上述公式中各變量的單位：

實(shí)際藥量：mg

效價(jià)：％

培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度：μg／ml

純度：％

需制備培養(yǎng)基體積：ml

4．絕對(duì)濃度法每種藥物按表2-1制成高濃度藥液，再按相應(yīng)比例稀釋成低濃度藥液。

5．比例法按表2-2所述濃度制備藥物儲(chǔ)存液，分裝至無菌試管，每管5～10ml，封口，一20℃保存，3個(gè)月內(nèi)使用。

6．除RFP、TBl、TH用二甲基甲酰胺溶解，再用滅菌蒸餾水稀釋外，其他藥物可用滅菌蒸餾水溶解、稀釋。

(三)含藥培養(yǎng)基制備

1．每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1ml配制、稀釋好的抗結(jié)核藥液，混勻，無菌分裝每管7ml，85℃凝固50min。

2．制成的培養(yǎng)基37℃無菌試驗(yàn)24h，檢查培養(yǎng)基污染情況后置4℃避光保存，1個(gè)月內(nèi)使用。二、藥敏試驗(yàn)方法

(一)絕對(duì)濃度法間接法

1．菌懸液制備

(1)臨床分離分枝桿菌的新鮮培養(yǎng)物(初生長2周)無須二次傳代即可做藥敏試驗(yàn)，初生長2周以后和貯存培養(yǎng)物須在改良羅氏培養(yǎng)基上二次傳代，取2～3周的亞培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)。

(2)取上述培養(yǎng)物(須刮取斜面各個(gè)部分的培養(yǎng)物)置于玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻動(dòng)使呈乳酪樣，以0．5％聚山梨醇-80(吐溫-80)生理鹽水磨菌稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo．1)比濁，即配成1mg／ml的菌懸液。

2．接種將1mg／ml的菌懸液10倍稀釋至0．01mg／ml(10^-2mg／ml)，以滅菌吸管準(zhǔn)確吸取菌液0．1m1分別接種于含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為1O^-3mg。置37℃培養(yǎng)，4周后觀察結(jié)果。

3．結(jié)果報(bào)告按下列方式報(bào)告對(duì)照及含藥培養(yǎng)基上菌落生長情況。

(1)分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長。

(2)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(1+)：菌落生長占斜面面積的1／4。

(3)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(2+)：菌落生長占斜面面積的1／2。

(4)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(3+)：菌落生長占斜面面積的3／4。

(5)分枝桿菌培養(yǎng)陽性(4+)：菌落生長布滿整個(gè)斜面。

(6)報(bào)告菌落數(shù)：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)少于20個(gè)時(shí)。

4．質(zhì)量控制

每批試驗(yàn)應(yīng)以結(jié)核分枝桿菌參考菌株(H37Rv敏感株)10^-3mg檢測含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。接種10^-3mg要求對(duì)照培養(yǎng)基菌落數(shù)在200個(gè)以上且無融合，若菌落數(shù)低于50個(gè)時(shí)，要求重新做藥敏試驗(yàn)。

(二)比例法

1．茵懸液制備同絕對(duì)濃度法。

2．稀釋、接種和培養(yǎng)

(1)菌液稀釋：靜置片刻，使菌液中的顆粒或菌塊沉淀后，用刻度吸管或22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)將1mg／ml的菌液上清逐步稀釋至0．01mg／ml和0．1mg／ml。

①22號(hào)接種環(huán)100倍稀釋法：用22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)沾取2滿環(huán)1mg／ml的菌液，移至2ml滅菌生理鹽水中，即稀釋成0．01mg／ml菌液；用同樣方法再進(jìn)行100倍稀釋，即成10^-4mg／ml菌液(注：22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)：金屬絲直徑O．7mm，接種環(huán)內(nèi)徑3mm，1滿環(huán)移液0．01m1)。

②微量吸管10倍稀釋法：用無菌微量刻度吸管吸取0．5ml上述1mg／ml菌懸液至4．5ml的滅菌生理鹽水[可加入0．5％聚山梨醇-80(吐溫一80)]中，即可得到0.mg／ml菌液。按上述方法連續(xù)進(jìn)行10倍稀釋，可得到0．01rag／ml和0．1mg／ml的菌液。

(2)接種：用22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別沾取1環(huán)(即0．01m1)0．01mg／ml和0．1mg／ml的菌液，用劃線法均勻接種至對(duì)照及含藥培養(yǎng)基表面，應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終接種菌量為10^-4mg和10^-6mg。

(3)培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，4周后報(bào)告結(jié)果。

3．結(jié)果報(bào)告及解釋

(1)按以下方式記錄菌落生長情況。

①少于50個(gè)菌落：

實(shí)際菌落數(shù)

②50～100個(gè)菌落：

1+

③100～200個(gè)菌落：

2+

④大部分融合(200～500個(gè)菌落)：

3+

⑤融合(大于500個(gè)菌落)：

4+

(2)計(jì)算耐藥百分比：

若耐藥百分比大于1％，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

4．質(zhì)量控制

(1)若高稀釋度菌液(10^-4mg／ml)在對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個(gè)菌落，則應(yīng)從對(duì)照管傳代培養(yǎng)，重復(fù)試驗(yàn)。

(2)每批試驗(yàn)以結(jié)核分支桿菌參考菌株(H37Rv敏感株)10^-3mg檢測含藥培養(yǎng)基的質(zhì)量。

附錄3：麥?zhǔn)?號(hào)比濁管的制備

0．1m11％氯化鋇(BaCl3)加入9．9ml1％硫酸(H2SO4)，封口，比濁前搖勻。第七節(jié)分枝桿茵菌種鑒定一、分枝桿菌微生物學(xué)概述

目前報(bào)道的分枝桿菌種類已有100余種。在微生物分類中，分枝桿菌屬于放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。

在結(jié)核病流行病學(xué)研究和臨床診斷檢驗(yàn)中，通常將分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(TBcomplex)和非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosismycobacteria，NTM)。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括四種分枝桿菌：結(jié)核分枝桿菌(M．tuberculo—sis)，牛分枝桿菌(M．bovis)，非洲分枝桿菌(M．a(chǎn)fricahum)和田鼠分枝桿菌(M-microti)。臨床上最常見的是結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。

根據(jù)“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(Bergeymanualofdeterminativebacteriology，9^the-dition)，將分枝桿菌菌種分為兩大類：一是在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基內(nèi)，在適宜的溫度條件下，接種很少的細(xì)菌分離物，孵育7d以內(nèi)肉眼可見單個(gè)菌落者為快速生長分枝桿菌；超過7d的則為緩慢生長分枝桿菌。緩慢生長分枝桿菌根據(jù)其色素產(chǎn)生的情況，又進(jìn)一步分為光產(chǎn)色、暗產(chǎn)色和不產(chǎn)色三組。二、分枝桿菌菌種鑒定的實(shí)驗(yàn)流程

經(jīng)抗酸染色鏡檢確定為抗酸菌的培養(yǎng)陽性菌株，必須首先接種改良羅氏(L—J)培養(yǎng)基進(jìn)行增菌傳代。

進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，首先經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長試驗(yàn)、28℃生長試驗(yàn)、耐熱觸酶試驗(yàn)、觀察記錄細(xì)菌的生長速度、菌落形態(tài)和菌落顏色等來確定該菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分枝桿菌。

經(jīng)菌群鑒定試驗(yàn)確定屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株，再進(jìn)行噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)和煙酸試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。

屬于NTM的菌株，首先根據(jù)生長速度確定屬于快速生長還是緩慢生長的分枝桿菌。快速生長的分枝桿菌可通過生長特征和生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定；緩慢生長的分枝桿菌經(jīng)色素產(chǎn)生試驗(yàn)確定菌株的產(chǎn)色特征后，再通過生長特征和生化試驗(yàn)確定菌株的種類。

分枝桿菌菌種(菌群)鑒定試驗(yàn)流程參見圖2—1。三、分枝桿菌菌群鑒定試驗(yàn)

分枝桿菌菌群鑒定的目的既是鑒定菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群還是非結(jié)核分枝桿菌，也是進(jìn)行進(jìn)一步菌種鑒定的基礎(chǔ)。

分枝桿菌菌群主要通過菌株在含對(duì)硝基苯甲酸(PNB)的鑒別培養(yǎng)基上的生長情況、28℃生長情況、生長速度、耐熱觸酶試驗(yàn)及觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色等生物特征來進(jìn)行區(qū)分。通過上述試驗(yàn)，可將需要鑒定的菌株劃歸結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或非結(jié)核分枝桿菌菌群。

(一)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長試驗(yàn)

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在含有PNB的培養(yǎng)基中生長受到抑制；大多數(shù)NTM菌種對(duì)一定濃度的PNB有耐受性。

培養(yǎng)基：PNB培養(yǎng)基(含PNB500μg／ml的L-J培養(yǎng)基)1支，L-J培養(yǎng)基1支。

試驗(yàn)方法：每支培養(yǎng)基接種10^-3mg細(xì)菌；37℃孵育，每周觀察1次結(jié)果，同時(shí)記錄PNB培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基上菌落生長情況直至孵育4周?？焖偕L的非結(jié)核分枝桿菌1周左右可見菌落；緩慢生長的分枝桿菌4周報(bào)告結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在．PNB培養(yǎng)基上不生長。

陽性對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)

陰性對(duì)照菌株：H37Rv。

(二)28℃生長試驗(yàn)

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在28℃的孵育環(huán)境中不能生長；而TNM菌群的大部分分枝桿菌可以生長。

培養(yǎng)基：2支L-J培養(yǎng)基。

試驗(yàn)方法：每支L-J培養(yǎng)基接種10^-3mg細(xì)菌；1支置于28℃、1支置于37℃孵育，每周觀察1次結(jié)果，同時(shí)記錄羅氏培養(yǎng)基上菌落生長情況直至孵育4周?？焖偕L的非結(jié)核分枝桿菌1周左右可見菌落；緩慢生長的分枝桿菌4周報(bào)告結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在28℃不生長。

陽性對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對(duì)照菌株：H37Rv。

(三)耐熱觸酶試驗(yàn)

多數(shù)NTM經(jīng)68℃處理一定時(shí)間后，其過氧化氫酶仍保持活性，可分解過氧化氫。

試劑：A．pH=7．0、0．0667mol／L(1／15M)PBS(無菌)

B．30％H2O2(過氧化氫)

C．10％聚山梨醇-80(Tween-80)水溶液(121℃滅菌10min，4℃保存，2周內(nèi)使用)

試驗(yàn)方法：取在L-J培養(yǎng)基上生長旺盛的細(xì)菌約5mg，在裝有1．5ml試劑A的試管中研磨成菌懸液；放于68℃水浴20min，取出后立即冷卻；緩緩加入等量混合的B、C(使用前配制)反應(yīng)液0．5ml。

結(jié)果判定：有持續(xù)小氣泡產(chǎn)生的為陽性；10～20min．仍無氣泡產(chǎn)生的為陰性；空白試劑對(duì)照無氣泡產(chǎn)生。

陽性對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對(duì)照菌株：H37Rv。

空白對(duì)照：pH=7．0、0．0667mol／L(1／15M)PBS(無菌)。四、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種鑒定試驗(yàn)

結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌占結(jié)核分枝桿菌菌群的絕大多數(shù)。這兩種分枝桿菌，須同時(shí)采用下列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒別。

(一)噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基生長

一定濃度的TCH對(duì)牛分枝桿菌和小部分結(jié)核分枝桿菌有抑制生長的作用；而對(duì)大部分結(jié)核分枝桿菌無抑制作用。

培養(yǎng)基：TCH培養(yǎng)基(含5μg／mlTCH的羅氏培養(yǎng)基)1支，羅氏(L-J)培養(yǎng)基1支。

試驗(yàn)方法：每支培養(yǎng)基接種10^-3mg細(xì)菌；37℃孵育4周時(shí)觀察結(jié)果，同時(shí)記錄TCH培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基上菌落生長情況。大部分結(jié)核分枝桿菌TCH培養(yǎng)基和羅氏培養(yǎng)基上菌落的生長情況相同；牛分枝桿菌在羅氏培養(yǎng)基生長良好，在TCH培養(yǎng)基上生長受到抑制。

陽性對(duì)照菌株：H37Rv。

陰性對(duì)照菌株：牛分枝桿菌(M．bovis)。

(二)硝酸還原試驗(yàn)

結(jié)核分枝桿菌和部分NTM能夠產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；在酸性條件下，亞硝酸鹽與氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽形成紅色偶氮化合物。牛分枝桿菌和部分NTM因不能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，故該實(shí)驗(yàn)陰性。因此本實(shí)驗(yàn)可用于結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌的鑒別。

試劑：A．硝酸鹽溶液[NaNO3(0．085g)]溶100mlPBS[pH7．0、0．0667mol／L(1／15M)]

內(nèi)，121℃滅菌20min，每管分裝2ml。

B．35％的濃鹽酸等倍稀釋。

C．0．2％氨基苯磺胺水溶液(4℃保存，4周內(nèi)使用)。

D．0．1％N一甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽水溶液(4℃可保存4周)。

E．鋅粉：0．1g。

試驗(yàn)方法：刮取4周菌齡、L-J培養(yǎng)基上生長旺盛的菌落約5mg，置于裝有2m1試劑A的試管中充分研磨并混勻，37℃水浴2h后取出。加入試劑B1滴、試劑C、D各2滴；混勻。

結(jié)果判定：1min內(nèi)呈紅色為陽性；試劑混勻后1min內(nèi)顏色無變化，加入0．1g鋅粉混勻觀察5min，顏色仍無變化者為強(qiáng)陽性，出現(xiàn)紅色或淡紅色者為真陰性；空白對(duì)照從無色變?yōu)榧t色。

陽性對(duì)照菌株：H37Rv。

陰性對(duì)照菌株：牛分枝桿菌(M．bovis)。

空白對(duì)照：pH一7．0，滅菌的0．0667mol／L(1／15M)PBS。

(三)煙酸試驗(yàn)

由于結(jié)核分枝桿菌缺乏煙酸酶，故不能分解代謝過程中產(chǎn)生的煙酸。在培養(yǎng)基中，結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)的煙酸聚集量較牛分枝桿菌及其他分枝桿菌高。煙酸吡啶核環(huán)的氮與聯(lián)苯胺及溴化氰作用后，呈現(xiàn)桃紅色或紅色沉淀反應(yīng)。但應(yīng)注意，對(duì)INH高度耐藥的結(jié)核分枝桿菌可能此實(shí)驗(yàn)亦為陰性，應(yīng)結(jié)合硝酸還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。

試劑：A．3％聯(lián)苯胺乙醇溶液。

B．10％溴化氰溶液(劇毒!在通風(fēng)櫥內(nèi)配制)。

(注：上述試劑必須存放于褐色試劑瓶中，瓶口密封，4℃可保存2周。溴化氰溶液如發(fā)生沉淀，應(yīng)在室溫下溶解后使用。)

實(shí)驗(yàn)方法：取在羅氏培養(yǎng)基孵育4周且生長旺盛的一支培養(yǎng)管，將菌落用無菌吸管刮到培養(yǎng)基斜面一邊，在暴露出的培養(yǎng)基斜面上加入2ml沸水，振蕩數(shù)次后，將培養(yǎng)基平放在37℃孵箱中孵育30min(應(yīng)注意使蒸餾水鋪滿斜面)。取浸提液0．8ml平分到2支試管中，各加入0．1ml試劑A，混勻后向其中一支試管中加入0．1ml試劑B，觀察顏色變化。

結(jié)果判定：加人兩種試劑的試管內(nèi)菌液呈現(xiàn)紅色或桃紅色沉淀為陽性*；白色沉淀為陰性；空白試劑對(duì)照不變色。結(jié)果觀察完畢后，加入4％NaOH溶液，加塞混勻后放置24小時(shí)后方可消除溴化氰的毒性。

陽性對(duì)照菌株：H37Rv*。

陰性對(duì)照菌株：牛分枝桿菌(M．boris)。

空白對(duì)照：生理鹽水。

*由于煙酸含量在2g以上才出現(xiàn)陽性結(jié)果，故培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)一般必須在50個(gè)以上，否則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

結(jié)核分枝桿菌與NTM的鑒別見表2-3。

由于臨床分離的菌株生物特性不穩(wěn)定，故對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌群的菌株進(jìn)行菌種鑒定時(shí)應(yīng)至少同時(shí)使用上述三種鑒定實(shí)驗(yàn)中的兩種，以便對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。五、NTM菌群生長特征鑒定試驗(yàn)

經(jīng)菌群鑒定試驗(yàn)被劃歸為NTM菌群的分枝桿菌，如需要進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定，應(yīng)首先進(jìn)行生長特征鑒定試驗(yàn)。相關(guān)試驗(yàn)主要目的是觀察分枝桿菌的生長速度、色素產(chǎn)生情況、菌落形態(tài)特征、在各種鑒別培養(yǎng)基上生長情況等。

(一)生長速度

傳代培養(yǎng)4周菌齡的NTM菌株，制備菌懸液并進(jìn)行稀釋；接種2支L-J培養(yǎng)基(10^-3mg／支)后，分別置于28℃、37℃孵育；在第3、7天觀察結(jié)果，以后每周觀察1次。1周內(nèi)生長菌落的為快速生長NTM；反之則為緩慢生長NTM。

緩慢生長NTM對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)。

快速生長NTM對(duì)照菌株：草分枝桿菌(M．phlei)。

(二)色素產(chǎn)生

傳代培養(yǎng)4周菌齡的NTM菌株，制備菌懸液并進(jìn)行稀釋；接種4支L-J培養(yǎng)基(10^-3mg／支)后，2支培養(yǎng)基以錫紙或黑紙包裹密封，另2支不包。將兩支培養(yǎng)基(1支包紙和1支不包紙)置于37℃培養(yǎng)，另2支置于28℃培養(yǎng)。不包紙的培養(yǎng)基長出菌落時(shí)，打開2支包紙的培養(yǎng)管觀察：有色素產(chǎn)生為暗產(chǎn)色菌；無色素產(chǎn)生者，放松膠塞進(jìn)行通氣，同時(shí)以100W鎢燈近距離(燈與試管的距離≤50cm)照射3h，放置于原溫度孵育3d，每日觀察1次，產(chǎn)生色素者為光產(chǎn)色菌；不論光照與否，菌落均無色素產(chǎn)生者為不產(chǎn)色菌。

光產(chǎn)色對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

暗產(chǎn)色對(duì)照菌株：戈登分枝桿菌(M．gordonae)。

不產(chǎn)色對(duì)照菌株：胞內(nèi)分枝桿菌(M．intracellulare)。

產(chǎn)色情況隨培養(yǎng)溫度變化的菌株：蘇加分枝桿菌(M．szulgai)。

(三)苦昧酸培養(yǎng)基生長試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分：谷氨酸鈉(0．4g)、枸櫞酸鈉(0．2g)、KH2P04(O．05g)、苦味酸(O．2g)、MgSO4·7H20(0．05g)和丙三醇(3m1)，溶解于97ml蒸餾水；以10％氫氧化鈉(NaOH)調(diào)pH至7．0～7．2，加瓊脂3g，121℃20min滅菌，分裝試管制成斜面使用。

試驗(yàn)方法：接種0．1mg細(xì)菌至培養(yǎng)基斜面，37℃孵育2周。有菌落生長者為快速生長菌。龜分枝桿菌不生長；膿腫分枝桿菌生長，二者可依此實(shí)驗(yàn)初步鑒別。

(四)5％氯化鈉(NaCI)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分：羅氏培養(yǎng)基中按5％(W／V)加入氯化鈉(NaCI)。

試驗(yàn)方法：接種10^-3mg細(xì)菌，37℃培養(yǎng)；每周觀察1次至4周。L-J培養(yǎng)基作為對(duì)照管。對(duì)照管及試驗(yàn)管均生長則為陽性；反之為陰性?？焖偕L菌不產(chǎn)色菌中龜分枝桿菌為陰性。

(五)谷氨酸鈉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基生長試驗(yàn)

培養(yǎng)基成分：谷氨酸鈉O．4g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O．05g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0．05g，溶于90ml蒸餾水，以10％氫氧化鈉(NaOH)調(diào)pH至7．O～7．2，然后加蒸餾水至100ml，再加瓊脂3g，121℃滅菌20min，按1％比例加入葡萄糖(注意無菌操作)，分裝試管制成斜面。

試驗(yàn)方法：接種O．1mg細(xì)菌(以羅氏培養(yǎng)基為對(duì)照)，37℃培養(yǎng)3周，觀察結(jié)果；羅氏和瓊脂培養(yǎng)基均生長者為陽性。

陽性對(duì)照菌株：胞內(nèi)分枝桿菌(M．intracellulare)。

陰性對(duì)照菌株：鳥分枝桿菌(M．a(chǎn)vium)。

(六)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基生長試驗(yàn)*

培養(yǎng)基成分：用不含結(jié)晶紫的麥康凱培養(yǎng)基制成平板。

試驗(yàn)方法：接種O．1mg細(xì)菌，37℃培養(yǎng)5～11d(為保持平板濕度，可將平板放在鋪有濕紗布的帶蓋容器中)。生長的菌落經(jīng)抗酸染色確認(rèn)。

陽性對(duì)照菌株：偶然分枝桿菌(M．fortuitum)。

陰性對(duì)照菌株：恥垢分枝桿菌(M．smegmatis)。

*此試驗(yàn)主要用于快速生長菌的鑒別。六、NTM菌種鑒定常用生化特征試驗(yàn)

(一)聚山梨醇-80(吐溫-80)水解試驗(yàn)

某些分枝桿菌具有一種酯酶，可分解聚山梨醇-80(吐溫-80)成為油酸等物質(zhì)，使菌懸液的琥珀色變?yōu)樽霞t色。

試劑：O．0667mol／L(1／15M)PBS(pH7．0)100ml，加入0．5ml聚山梨醇-80和0．1％中性紅溶液2ml，121℃滅菌20min后，每管分裝3ml?？?℃保存，限2周內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)方法：用吸管挑取在羅氏培養(yǎng)基上生長旺盛的細(xì)菌約5mg，置于裝有3ml試劑的試管中，37℃孵育10d。第3、5、10天觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：菌懸液由琥珀色變?yōu)樽霞t色者為陽性；不變者為陰性；空白試劑對(duì)照不變色。

陽性對(duì)照菌株：堪薩斯分枝桿菌(M．kansasii)。

陰性對(duì)照菌株：瘰癘分枝桿菌(M．scrofulaceum)。

空白對(duì)照：空白試劑。

(二)尿素酶試驗(yàn)

某些分枝桿菌產(chǎn)生尿素酶，可分解尿素使菌懸液呈紅色。

試劑：A．0．0667mol／L(1／15M)PBS(pH6．7)，121℃滅菌20min，4℃保存。

B取試劑A配制0．12％尿素，以0．22mm濾膜除菌，每支試管分裝3ml。

C．0．1％酚磺酞(酚紅)：取酚磺酞O．1g加O．05mol／L(1／20N)氫氧化鈉(NaOH)

5．7ml溶解后，加水至100ml，113℃滅菌10min。

實(shí)驗(yàn)方法：用吸管挑取在羅氏培養(yǎng)基上生長旺盛的細(xì)菌約5mg，移置于裝有3ml試劑B的試管中，每管加入1滴試劑C；37℃孵育3d，觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：菌懸液呈紅色者為陽性；不變色者為陰性；空白試劑對(duì)照不變色。

陽性對(duì)照菌株：結(jié)核分枝桿菌(M．tuberculosis)。

陰性對(duì)照菌株：蟾蜍分枝桿菌(M．xenopi)。

空白對(duì)照：空白試劑。

(三)芳香硫酸酯酶試驗(yàn)

某些分枝桿菌產(chǎn)生硫酸芳香酯酶，能分解二硫酸酚酞三鉀鹽，游離出酚酞，在堿性環(huán)境下出現(xiàn)紫紅色。

試劑：A．含二硫酸酚酞三鉀鹽的培養(yǎng)基：二硫酸酚酞三鉀鹽(分子量610．34)61．0mg，加入100ml蘇通液體培養(yǎng)基，混勻后12l℃滅菌15min，每支試

管分裝2m1。

B．10．6％碳酸鈉(NaCO3)水溶液。

實(shí)驗(yàn)方法：取裝有試劑A的試管2支，分別加入生長旺盛的細(xì)菌菌懸液(20～40mg／m1)0．5m1；37℃孵育的第3、10天，分別取一支試管加入O．5m1試劑B后，觀察顏色變化。

結(jié)果判定：菌懸液呈紫紅色者為陽性；不變者為陰性；空白對(duì)照不變色。

陽性對(duì)照菌株：偶然分枝桿菌(M．f0rtuitum)。

陰性對(duì)照菌株：H37Rv。

空白對(duì)照：空白試劑。

(四)鐵離子吸收試驗(yàn)

某些分枝桿菌具有還原鐵鹽的能力。鐵離子被吸收后，菌落呈鐵銹色。

試劑：4％枸櫞酸鐵胺水溶液，121℃滅菌15min，每支試管分裝1ml，4℃保存，3周內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)方法：接種前棄去改良羅氏培養(yǎng)基管內(nèi)凝固水，接種O．1mg生長旺盛的細(xì)菌，加入試劑1ml到培養(yǎng)基底部，37℃孵育3周，每周觀察結(jié)果1次。未加試劑的羅氏培養(yǎng)基為對(duì)照。

結(jié)果判定：菌落呈鐵銹色者為陽性；不變色者為陰性(注意與羅氏培養(yǎng)基上生長的菌落對(duì)比)。

陽性對(duì)照菌株：偶然分枝桿菌(M．fortuitum)。

陰性對(duì)照菌株：龜分枝桿菌(M．chelonae)。

(五)亞碲酸鹽還原試驗(yàn)

某些分枝桿菌可使碲鹽還原為碲，使培養(yǎng)物呈黑色或深棕色沉淀物。

試劑：A．0．2％亞碲酸鉀水溶液，121℃滅菌15min。

B．0．5％蘇通瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，每管分裝3ml，制成斜面。

實(shí)驗(yàn)方法：接種O．1mg細(xì)菌到試劑B培養(yǎng)基表面，37℃孵育7d時(shí)加入2滴試劑A，再孵育3d觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：有黑色或深棕色沉淀物為陽性；無沉淀物者為陰性；空白試劑對(duì)照無變化。

陽性對(duì)照菌株：胞內(nèi)分枝桿菌(M．intracellulare)。

陰性對(duì)照菌株：次要分枝桿菌(M．triviale)。七、分枝桿菌菌種鑒定試驗(yàn)的質(zhì)量控制

所有進(jìn)行菌種(菌群)鑒定的臨床分離株，必須經(jīng)過傳代增菌，菌齡為3～4周且生長良好；所有實(shí)驗(yàn)涉及的培養(yǎng)基、試劑必須符合規(guī)定的使用期限；所有標(biāo)明有對(duì)照的鑒別實(shí)驗(yàn)，在實(shí)施時(shí)參照系的結(jié)果符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)后方可判定待測菌株的結(jié)果；進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采取必要措施，注意防止菌株對(duì)操作人員、實(shí)驗(yàn)室和社會(huì)環(huán)境造成危害和污染。

NTM菌株經(jīng)過生長特性和生化特性鑒別實(shí)驗(yàn)后，結(jié)合菌種鑒定流程圖和菌種鑒定實(shí)驗(yàn)對(duì)照表(表2-3和表2-4)綜合判定菌種鑒定結(jié)果。第八節(jié)結(jié)核分枝桿菌聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)或稱DNA體外擴(kuò)增技術(shù)是一種選擇性的體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，作為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段之一，由于其敏感性高、特異性強(qiáng)和反應(yīng)迅速等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域；近年來隨著該技術(shù)的不斷完善和改進(jìn)，已用于對(duì)多種病原微生物的臨床檢測。一、PCR技術(shù)在結(jié)核病臨床診斷中的作用

目前臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的PCR檢測結(jié)果，在結(jié)核病的臨床診治中，只能作為輔助參考，不能作為結(jié)核病診斷的主要指標(biāo)。因?yàn)槟壳暗慕Y(jié)核分枝桿菌PCR檢測商業(yè)試劑盒，基本上僅針對(duì)一個(gè)(或幾個(gè))結(jié)核分枝桿菌特異性基因靶序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測；而影響PCR檢測結(jié)果的諸多因素，在檢測體系中不能完全被消除；另外，結(jié)核分枝桿菌PCR檢測結(jié)果與結(jié)核病臨床診治及流行病學(xué)的吻合程度尚待進(jìn)一步證實(shí)。因此，臨床醫(yī)師在參考結(jié)核分枝桿菌PCR檢查的同時(shí)，必須同時(shí)參照結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng)檢查)的結(jié)果并參考其他臨床檢查手段所得到的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。二、臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒概述

根據(jù)我國臨床生物診斷試劑有關(guān)規(guī)定，用于臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌PCR檢測的試劑盒，必須具有國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的生產(chǎn)文號(hào)。

目前，我國的結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒，按照其擴(kuò)增和檢測原理，可分為兩大類：一類是擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雜交后利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkimmunesorbentassay，ELISA)進(jìn)行檢測，該技術(shù)原理是將引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記以獲得帶有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后與包被于微孔板的捕獲探針進(jìn)行雜交，然后與酶標(biāo)親和素結(jié)合，進(jìn)行生物素一親和素一辣根過氧化物酶顯色，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行半定量測定。此類試劑盒中都應(yīng)具有防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染的試劑和相關(guān)操作步驟；另一類采用熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物或探針在擴(kuò)增管中直接進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，對(duì)于熒光定量PCR技術(shù)，操作與標(biāo)準(zhǔn)PCR操作基本相同，只是在PCR反應(yīng)體系中添加一個(gè)熒光雙標(biāo)記的寡核甘酸探針，該探針能與擴(kuò)增片段中的特定區(qū)域結(jié)合。5’端帶有報(bào)告熒光基因，3’端帶有熒光淬滅基因。當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合處時(shí)，探針被分割切下，報(bào)告基因釋放熒光。隨著模板量的增加，報(bào)告基因釋放熒光量也增加，且與模板量成正相關(guān)。其特點(diǎn)是閉管、實(shí)時(shí)、防污染、既能定性也能定量。由于此類試劑盒一般要求使用特定的擴(kuò)增儀、在相對(duì)封閉的環(huán)境中連續(xù)完成擴(kuò)增和檢測過程，故此類試劑盒中可能沒有防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染的試劑和相應(yīng)操作步驟。三、臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌PCR檢測步驟

由于目前獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)并上市的臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒的種類較多，故檢測實(shí)驗(yàn)必須嚴(yán)格按照試劑盒生產(chǎn)廠家提供的使用說明和操作步驟完成相應(yīng)檢測并判斷結(jié)果。四、PCR操作注意事項(xiàng)

1．應(yīng)在專門的PCR超凈臺(tái)內(nèi)吸加PCR試劑，不工作時(shí)應(yīng)以紫外線燈消毒。所有吸頭、離心管使用前必須經(jīng)高壓處理，防止DNA污染。

2．在另一超凈臺(tái)內(nèi)吸加DNA樣品，并勤于更換手套。

3．設(shè)立陽性和陰性對(duì)照。

4．反應(yīng)模板的用量應(yīng)適當(dāng)，防止非特異性擴(kuò)增。五、結(jié)核分枝桿菌PCR檢測的質(zhì)量控制

PCR檢測實(shí)驗(yàn)室必須建立相應(yīng)質(zhì)量控制規(guī)章制度。

1．PCR檢測實(shí)驗(yàn)操作人員必須經(jīng)過專門培訓(xùn)。

2．PCR檢測實(shí)驗(yàn)室必須制定處理有害試劑和預(yù)防污染的規(guī)定，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程劃出工作內(nèi)容相對(duì)單一的操作區(qū)域。

3．必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號(hào)的檢測試劑盒，同時(shí)生產(chǎn)廠商應(yīng)提供操作的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)。

4．使用的試劑盒必須在有效期內(nèi)，檢測實(shí)驗(yàn)記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號(hào)。

5．進(jìn)行檢測的相應(yīng)標(biāo)本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

6．每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實(shí)驗(yàn)，如果相應(yīng)對(duì)照樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)問題，必須進(jìn)行重新實(shí)驗(yàn)并分析記錄引起問題的可能原因。

7．對(duì)于結(jié)果檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進(jìn)行全過程的重復(fù)檢測并根據(jù)重復(fù)檢測值報(bào)告結(jié)果。

8．檢測實(shí)驗(yàn)使用后的廢棄物、廢棄試劑必須按照操作區(qū)域分別集中，并經(jīng)12l℃30min高壓蒸汽滅菌后方可丟棄。

9．實(shí)驗(yàn)使用的各種儀器必須符合相應(yīng)規(guī)定。第九節(jié)結(jié)核病免疫學(xué)檢查

結(jié)核病作為因病原微生物感染所造成的人體疾病之一，在臨床上利用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢查機(jī)體對(duì)分枝桿菌、特別是結(jié)核分枝桿菌感染造成的免疫反應(yīng)，從而幫助臨床醫(yī)師進(jìn)行鑒別診斷，有一定的實(shí)際意義。但由于結(jié)核分枝桿菌的生物特性及其引起的人體免疫反應(yīng)較為特殊和復(fù)雜，目前結(jié)核病免疫學(xué)的檢測結(jié)果，在結(jié)核病的臨床診治中，只能作為輔助參考，不能作為結(jié)核病診斷和評(píng)價(jià)治療效果的指標(biāo)。臨床醫(yī)師在參考免疫學(xué)檢查結(jié)果的同時(shí)，必須同時(shí)參照結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng))的結(jié)果并參考其他臨床檢查手段所得到的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。一、結(jié)核病免疫學(xué)檢查試劑盒概述

根據(jù)我國臨床生物診斷試劑的有關(guān)規(guī)定，用于結(jié)核病免疫學(xué)檢查的試劑盒，必須具有國家有關(guān)部門頒發(fā)的生產(chǎn)文號(hào)。

目前，我國結(jié)核病免疫學(xué)檢測試劑盒，按照相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟，可分為兩大類：一類試劑盒檢測的標(biāo)本一般為血清，利用ELISA實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行檢測，此類試劑盒中都應(yīng)具有相應(yīng)的陰性、陽性和空白對(duì)照試劑；另一類試劑盒采用快速金標(biāo)法(免疫膠體金標(biāo)記法)進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)，檢測的標(biāo)本有血清和全血，此類試劑盒均應(yīng)具備顯示反應(yīng)正常的質(zhì)控線或斑點(diǎn)。

由于結(jié)核病免疫學(xué)檢查的試劑盒種類及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟差別較大，故開展此項(xiàng)檢查工作應(yīng)嚴(yán)格按照選用試劑盒廠家提供的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、判斷和報(bào)告結(jié)果。二、結(jié)核病免疫學(xué)檢查試劑盒實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制

1．完成結(jié)核病免疫學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)的操作人員必須經(jīng)過專門培訓(xùn)。

2．必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號(hào)的檢測試劑盒，同時(shí)生產(chǎn)廠商應(yīng)提供操作的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)。

3．使用的試劑盒必須在有效期內(nèi)，檢測實(shí)驗(yàn)記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號(hào)。

4．進(jìn)行檢測的相應(yīng)標(biāo)本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5．采用ELISA技術(shù)完成檢測的試劑盒，每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照。嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實(shí)驗(yàn)，如果相應(yīng)對(duì)照樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)問題，必須進(jìn)行重新實(shí)驗(yàn)并分析記錄引起問題的可能原因。

6．采用快速金標(biāo)方法完成檢測實(shí)驗(yàn)的試劑盒，每批試劑盒投入正常使用前，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用檢測結(jié)果已知為陽性、陰性的標(biāo)本或使用生產(chǎn)廠家提供的對(duì)照預(yù)先進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果相符后方可投入正常使用。

7．對(duì)于檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進(jìn)行全過程的重復(fù)檢測并根據(jù)重復(fù)檢測值報(bào)告結(jié)果。結(jié)核病免疫學(xué)輔助診斷檢查利用免疫學(xué)原理檢查機(jī)體對(duì)分枝桿菌、特別是結(jié)核分枝桿菌感染造成的免疫反應(yīng)，從而幫助臨床醫(yī)師進(jìn)行鑒別診斷；但由于結(jié)核分枝桿菌的生物特性及此類病原菌引起的人體免疫反應(yīng)較為特殊和復(fù)雜，截止到目前為止，結(jié)核病的免疫學(xué)檢查在臨床診斷中的作用尚存有較大爭議。因此，目前結(jié)核病免疫學(xué)的檢測結(jié)果，在結(jié)核病的臨床診治中，只能夠作為輔助參考，不能作為結(jié)核病診斷和評(píng)價(jià)治療效果的指標(biāo)。臨床醫(yī)師在參考免疫學(xué)檢查結(jié)果的同時(shí)，必須同時(shí)參照結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查(包括抗酸染色鏡檢、特別是分枝桿菌培養(yǎng)檢查)的結(jié)果并參考其它臨床檢查手段所得到的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。（一）結(jié)核病免疫學(xué)檢查試劑盒概述根據(jù)我國臨床生物診斷試劑的規(guī)定，用于結(jié)核病免疫學(xué)檢查的試劑盒，必須具有國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的生產(chǎn)文號(hào)。目前，我國已頒發(fā)生產(chǎn)文號(hào)的結(jié)核病免疫學(xué)檢測試劑盒，按照相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟，可分為兩大類：一類試劑盒檢測的標(biāo)本一般為血清，是利用ELISA實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行檢測，此類試劑盒中都應(yīng)具有相應(yīng)的陰性、陽性和空白對(duì)照試劑；另一類試劑盒采用快速金標(biāo)法進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)，檢測的標(biāo)本有血清和全血，此類試劑盒均應(yīng)具備顯示反應(yīng)正常的質(zhì)控線或斑點(diǎn)。由于結(jié)核病免疫學(xué)檢查的試劑盒種類及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟區(qū)別較大，故請(qǐng)開展此項(xiàng)檢查工作的實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照選用試劑盒廠家提供的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、判斷和報(bào)告結(jié)果。（二）結(jié)核病免疫學(xué)檢查試劑盒實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制1、完成結(jié)核病免疫學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)的操作人員必須經(jīng)過專門培訓(xùn)。2、必須選用具備國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)生產(chǎn)文號(hào)的檢測試劑盒；同時(shí)生產(chǎn)廠商提供操作的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)。3、使用的試劑盒必須在有效期內(nèi)；檢測實(shí)驗(yàn)記錄中必須包括試劑盒的生產(chǎn)批號(hào)。4、進(jìn)行檢測的相應(yīng)標(biāo)本必須符合試劑盒說明書中列舉的種類和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。5、采用ELISA技術(shù)完成檢測的試劑盒，每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照；嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的操作步驟完成檢測實(shí)驗(yàn)，如果相應(yīng)對(duì)照樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)問題，必須進(jìn)行重新實(shí)驗(yàn)并分析記錄引起問題的可能原因。6、采用快速金標(biāo)方法完成檢測實(shí)驗(yàn)的試劑盒，每批試劑盒投入正常使用前，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用檢測結(jié)果已知為陽性、陰性的標(biāo)本或使用生產(chǎn)廠家提供的對(duì)照預(yù)先進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果相符后方可投入正常使用。7、對(duì)于結(jié)果檢測值處于無效區(qū)和灰區(qū)的樣本必須進(jìn)行全過程的重復(fù)檢測并根據(jù)重復(fù)檢測值報(bào)告結(jié)果。本文歸納了結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)所包括的4項(xiàng)基本技術(shù)（涂片染色鏡檢、分枝桿菌分離培養(yǎng)、分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)、分枝桿菌菌種鑒定）以及結(jié)核桿菌臨床基因擴(kuò)增（PCR）檢驗(yàn)技術(shù)、分枝桿菌快速培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)、免疫學(xué)有關(guān)檢測技術(shù)的國家規(guī)范。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查，特別是細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診和治療的主要依據(jù)。雖然這些常規(guī)檢查方法在技術(shù)上比較成熟，但筆者認(rèn)為尚存在以下幾個(gè)問題：1、結(jié)核病診斷方法，目前只是在結(jié)核病防治系統(tǒng)內(nèi)初步得到規(guī)范和質(zhì)量控制，但結(jié)核病最初的診斷約85%是在綜合性醫(yī)院里，而恰恰是在綜合性醫(yī)院里結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)診斷尚不夠規(guī)范且水平參差不齊，所以加強(qiáng)和提高綜合性醫(yī)院的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷水平是我們今后工作的重點(diǎn)之一。2、結(jié)核病的診斷技術(shù)目前還處在較低的水平，國際推薦的涂片和培養(yǎng)方法也還分別存在著特異性差、敏感性低和結(jié)果報(bào)出時(shí)間太長的不足，因此不斷加強(qiáng)結(jié)核病診斷新技術(shù)的研究和開發(fā)仍然是十分必須的。結(jié)核菌的快速培養(yǎng)系統(tǒng)是一項(xiàng)得到國際認(rèn)可的結(jié)核菌檢測技術(shù)，大大提高了培養(yǎng)結(jié)果的報(bào)出時(shí)間，但由于儀器設(shè)備昂貴，檢測成本太高而較難推廣普及。敏感、特異、快速、經(jīng)濟(jì)、個(gè)體化是今后結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的發(fā)展方向。鑒于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查、特別是細(xì)菌學(xué)檢查在結(jié)核病控制工作中的重要性，為保障相應(yīng)檢查項(xiàng)目結(jié)果的可靠性，要求相應(yīng)的檢查項(xiàng)目必須由經(jīng)過培訓(xùn)并考核合格的專職人員完成，且開展相應(yīng)檢查的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備安全操作設(shè)施并制定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制措施，同時(shí)接受專業(yè)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制督導(dǎo)和培訓(xùn)。結(jié)核病的免疫學(xué)診斷十幾年來國內(nèi)外學(xué)者一直從MT培養(yǎng)濾液中提純蛋白質(zhì)抗原，由于該方法制備蛋白抗原較煩瑣、費(fèi)時(shí)。因此，近年來，筆者研究室應(yīng)用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)MT基因，簡便地獲得了大量MT單一的蛋白抗原(如CFPl0、ESAT6、MPT63、MPT64、Ag85A、Ag85B、KatG、16ku、3Sku、65ku等蛋白)，研究其診斷應(yīng)用價(jià)值。(1)血清學(xué)診斷20世紀(jì)70年代應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測患者血清中結(jié)核特異性抗體，成為結(jié)核病常用的輔助診斷手段之一，尤其是近十幾年來金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法檢測抗原抗體反應(yīng)已成為無需