常見的轉(zhuǎn)染方法有哪些種？細(xì)胞轉(zhuǎn)染

第第頁常見的轉(zhuǎn)染方法有哪些種？細(xì)胞轉(zhuǎn)染？說到轉(zhuǎn)染法，小伙伴們應(yīng)當(dāng)比較熟識(shí)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，那么細(xì)胞轉(zhuǎn)染你了解多少呢？本期AVT我給大家共享一下這個(gè)方面的一些知識(shí)，感興趣的來瞧一瞧吧！細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)初接觸細(xì)胞試驗(yàn)的科研人員而言，是一道難過的坎兒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低的話，你寶貴的細(xì)胞可能就只能扔掉了。大家都知道，細(xì)胞是由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，這對(duì)大分子物質(zhì)來說是個(gè)不行透過的屏障，譬如DNA和RNA的磷酸骨架，為了使核酸穿過細(xì)胞膜，開發(fā)了多種技術(shù)，大概可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)。幾種常見的轉(zhuǎn)染方法：1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前試驗(yàn)室***的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。2、磷酸鈣共沉淀法該方法可重復(fù)性差，而且磷酸鈣溶液對(duì)溫度、pH和緩沖鹽濃度的變動(dòng)十分敏感，對(duì)細(xì)胞尤其是原代細(xì)胞毒性較大，也不能采用RPMI培養(yǎng)基，由于其含有高濃度的磷酸鹽。3、電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或?qū)⒔鼰o法轉(zhuǎn)入時(shí)可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%—70%的細(xì)胞?，F(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，可以大大的降低細(xì)胞的死亡率，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。4、病毒感染對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以采用病毒感染，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率比較高，適用于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。但是插入的片段長度有肯定限制，最緊要的是技術(shù)難度比較高，在一般試驗(yàn)室中很難普及，而且某些病毒起效時(shí)間比較慢，跟不上細(xì)胞這種快速繁殖的速度，假如只是做簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染性價(jià)比不高。沒有一種方法適用于全部的細(xì)胞和試驗(yàn)，理想的方法應(yīng)依據(jù)細(xì)胞類型和試驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，假如只是在細(xì)胞水平做，而且用的是簡單細(xì)胞系，那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來不錯(cuò)的一個(gè)方法。所以，我們重要來探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：進(jìn)行試驗(yàn)之前，請(qǐng)先規(guī)劃好你的試驗(yàn)，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h—72h，所以要充分了解細(xì)胞生長速度，計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量，并確認(rèn)有充分的下列料子：Opti—MEM無血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，以及DNA，這個(gè)肯定要確認(rèn)好，否則生氣都沒方法怪別人。做好以上準(zhǔn)備后，具體的操作步驟如下：1、細(xì)胞鋪板（1）一般會(huì)選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3—4次（匯合率實(shí)現(xiàn)90%之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，不要長到100%），從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，傳代次數(shù)高（30—40）時(shí)，細(xì)胞的生長速度和形態(tài)會(huì)轉(zhuǎn)變。（2）假如提總蛋白，一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，由于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能實(shí)現(xiàn)200ug，一般夠做而且需要的DNA和Lipofectamine又相對(duì)比較少。（3）傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。對(duì)于快速生長的細(xì)胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)（如HEK293）。對(duì)于生長緩慢的細(xì)胞，倍增時(shí)間為36小時(shí)（如原代細(xì)胞）。（4）轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。假如在轉(zhuǎn)染前一天或更早時(shí)間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降，假如是簡單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞密度保持在匯合率為70—90%（這個(gè)前提是轉(zhuǎn)染24h，假如轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50—70%），細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時(shí)進(jìn)行。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液：用200μlOpti—MEM稀釋4μg質(zhì)粒；B液:用200μlOpti—MEM稀釋10μllipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成**培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)到24—48小時(shí)（不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體**搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前，應(yīng)當(dāng)摸一個(gè)**配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測(cè)**轉(zhuǎn)染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過察看每組熒光強(qiáng)弱來推斷轉(zhuǎn)染效率）。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。轉(zhuǎn)染時(shí)，應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：1、通過測(cè)量OD值來確定DNA純度和濃度，測(cè)得的OD值應(yīng)介于1.7—1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，假如DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯zhu影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞有很大的毒性作用。轉(zhuǎn)染時(shí)，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避開粗暴用力吹打，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體失效。血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細(xì)胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡（譬如貼壁較差的細(xì)胞，在PBS洗滌時(shí)很容易沖刷細(xì)胞）導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的當(dāng)下，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，但是血清的存在會(huì)影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，在DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)需用無血清培養(yǎng)基opti—MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換培養(yǎng)基，由于lipo2000具有肯定毒性。細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防備污染，但是抗生素可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成困擾。譬如盤尼西林和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來防備污染的抗生素，就會(huì)影響轉(zhuǎn)染，雖然這些抗生素一般情況下對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑加添了細(xì)胞的通透性時(shí)，就會(huì)使抗生素也進(jìn)入細(xì)胞從而間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來操作，特別方便，省去了污染等麻煩。3、察看轉(zhuǎn)染的效果在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用熒光顯微鏡察看試驗(yàn)結(jié)果并記錄熒光蛋白表達(dá)情況，如下圖所示，說明轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染效率還可以，假如不帶有熒光，可以用GFP來對(duì)照，可以放在一個(gè)單獨(dú)的孔中