黃曲霉毒素的檢測及防控課件

黃曲霉毒素的檢測及防控AnalysisandControlofAflatoxins內(nèi)容黃曲霉毒素的概述黃曲霉毒素的國際限量要求黃曲霉毒素的檢測黃曲霉毒素污染的預防和控制山東局技術中心黃曲霉毒素實驗室輸歐花生黃曲霉毒素實驗室檢測一、黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素的研究歷史黃曲霉毒素的毒理作用黃曲霉毒素的產(chǎn)生黃曲霉毒素的分布黃曲霉毒素的化學性質(zhì)研究歷史1960年,英國10萬只火雞死亡事件揭開了人們對于黃曲霉毒素的認識與研究。火雞的死亡與飼料中含有較高濃度的黃曲霉毒素有關。用這種飼料（花生粉）對動物進行急性毒理實驗后，證明具有強毒性。對大白鼠進行長期的慢性中毒實驗后，成功地誘發(fā)了肝癌。對毒飼料進行提取，得到了黃曲霉毒素。在隨后的幾十年中，黃曲霉毒素得到了科學界的高度重視。黃曲霉毒素的毒理作用黃曲霉毒素是潛在的肝臟毒素。當大劑量攝入這些毒素時可能是致命的。亞致死劑量會導致慢性中毒，而低劑量的長期接觸則會致癌，特別是導致肝癌。通常，動物幼仔比成年動物更加容易遭受黃曲霉毒素的毒害。黃曲霉毒素引起了人們對健康最強烈的關注，是因為其廣泛分布于一些食物諸如花生、堅果、牛奶、玉米中，同時也是人類潛在的致癌原。黃曲霉毒素的產(chǎn)生黃曲霉毒素主要由黃曲霉和寄生曲霉等在代謝過程中產(chǎn)生。黃曲霉毒素產(chǎn)生的條件：菌株的產(chǎn)毒能力、適宜的濕度（80%-90%相對濕度和基質(zhì)的含水量）、溫度（24-30度）、氧氣（1%以上）、培養(yǎng)時間、機械損傷、昆蟲損害等。黃曲霉毒素的分布黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2大多分布在農(nóng)產(chǎn)品中，常見的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。黃曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。在哺乳動物的肝臟與尿中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素P1和Q1。黃曲霉毒素的化學性質(zhì)黃曲霉毒素是結(jié)果相近的一群衍生物?；瘜W結(jié)構(gòu)式為二呋喃環(huán)和香豆素。在紫外線下，黃曲霉毒素B1、B2發(fā)蘭色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發(fā)綠色熒光。黃曲霉毒素的分解溫度為237-299度，一般加熱不能破壞其毒性。在有氧條件下，紫外線照射可去毒。難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，在強堿溶液下易分解黃曲霉毒素B1同肝細胞DNA的鳥嘌呤堿基結(jié)合，使得控制細胞生長的基因代碼發(fā)生錯誤，從而使細胞生長失控，成為癌性腫瘤。

二、黃曲霉毒素的國際限量

Codex花生(未加工):黃曲霉毒素總量15ppb

牛奶:黃曲霉毒素M10.5ppbEU黃曲霉毒素B1/總量花生、堅果、干果：2/4ppb花生（進一步挑選等）：8/15ppb堅果、干果（進一步挑選）：5/10ppb谷物及加工產(chǎn)品：2/4ppb各種調(diào)味品：5/10ppb澳大利亞、新西蘭黃曲霉毒素總量：花生：15ppb美國所有食品：黃曲霉毒素總量20ppb黃曲霉毒素的中國限量玉米、花生、花生油、堅果等B1不得超過20ppb。大米、其他食用油等B1不得超過10ppb。其它糧食（麥類、面粉、薯干）、發(fā)酵食品（醬油、醋等）、淀粉類制品（糕點、餅干、面包等）B1不得超過5ppb。牛奶及其制品中M1不得超過0.5ppb。三、黃曲霉毒素的檢測黃曲霉毒素的檢測，從廣義上，包括：采樣、制樣和檢測三個過程。黃曲霉毒素的檢測一直是困擾世界各國的難題。原因：不均勻分布；ppb水平檢測程序analyticalprocedure采樣樣品制備/分樣分析檢測采樣sampling目的：得到一個有代表性的樣品困難：1）分布不均勻

2）ppb水平辦法：盡量加大采樣點和采樣量，使貨物的每個部位都有同等的機會被抽到。均勻分布（如蛋白質(zhì)）不均勻分布（黃曲霉毒素）

所謂“ppb”1，000，000，000中的1分子

32年中的1秒地球至月球總距離中的40cm22公斤沙子中的1粒

3.5車廂中的1粒玉米

檢測誤差

ErrorsinAnalysis集裝箱樣品小樣檢測100%總誤差88%采樣誤差10%制樣誤差2%檢測誤差WhitakerDicken，1974針對卡車或拖車裝載玉米的取樣方式:第一次取樣的位點標記為“O”.如果需要更多的樣品，應在標記為“X”的位點再次取樣取樣方式從卡車中的取樣量由于分布不均勻可能檢測到的結(jié)果范圍4.50kg2.25kg1.00kg0.45kg11.6-28.4ppb8.1-31.9ppb3.2-38.8ppb0-46.9ppb*95%confidencerange一卡車玉米中有20ppb黃曲霉毒素的污染樣品制備samplepreparation目的：將樣品充分粉碎、均質(zhì)化，為下一步檢測做準備辦法：使用高效粉碎機，粉碎最終直徑小于2mm制樣誤差約占總誤差的10%分析檢測test提取extraction凈化purification分析analysis分析程序-提取使用甲醇/水或乙腈/水混合液萃取研磨樣品使用攪拌機(2-5Minutes)或震蕩儀(30-180Minutes)震蕩萃取液.樣品液數(shù)量與溶劑數(shù)量存在最佳比例。注意所使用的有毒溶劑對健康的損害及污染分析程序----凈化凈化是指去除提取液中的雜質(zhì)（如脂肪、蛋白質(zhì)、色素等），以避免對黃曲霉毒素的檢測造成干擾。幾種常用的凈化方法免疫親和柱(IAC)凈化固相萃取柱（SPE）凈化液-液萃取其他黃曲霉毒素的分析方法快速篩選法：熒光光度計法

ELISA法確證方法：

HPLC-FLD法免疫親和柱凈化-熒光光度計法原理：紫外線照射后，黃曲霉毒素能發(fā)射特征熒光優(yōu)點：1、操作簡便、安全2、檢測限小于2ppb缺點：有假陽性的存在酶聯(lián)免疫法原理：利用抗原抗體反應并由酶催化底物產(chǎn)生顏色進行定量的分析方法優(yōu)點：1、操作簡便、成本較低

2、有些商品化的試劑盒檢測限能達到1ppb

缺點：有假陽性的存在方法的選用經(jīng)過篩選方法檢測的樣品，可以繼續(xù)通過基準方法進一步確證黃曲霉毒素的存在，并進行更加準確的定量檢測。四、黃曲霉毒素的預防與控制預防prevention采樣sampling樣品制備samplepreparation樣品提取extraction測試需求評價evaluationoftestingrequirements檢測testing結(jié)果確證resultvalidation文本化documentation供貨方介入supplierinvolvement去毒removal五、山東局技術中心生物毒素實驗室介紹

1.AprofessionalMycotoxin

laboratory.

一個專業(yè)化的官方實驗室

2.AlonghistorytodetectAflatoxin.

檢測黃曲霉毒素歷史悠久

Introduction悠久的歷史Usebiologymethodsince1970s.UseTLCmethodsince1980s.UseHPLCmethodsince1990sHPLC-MS/MSCerealsMulti-mycotoxinBio-method/ELISASeafoodsDSP/PSPHPLC-FLD/ELISACerealsT-2toxinHPLC-FLDCorn,cerealsZearalenoneHPLC-UVCerealsDeoxynivalenolHPLC-UVApplejuicePatulinHPLC-FLDMilk,milkpowderAflatoxinM1IAC/PCD/HPLC-FLDPeanut,corn,cerealsAflatoxinMethodCommodityParameter

生物毒素檢測業(yè)務&

實驗室認可STCIQisaccreditedbyChinanationalaccreditationserviceforConformityAssessment(CNAS)andoperatedinaccordancewithISO/IEC17025:2005(E)Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories.FAPAS成績時間Date輪次號FAPASSeriesandRoundAFB1z-scoreTotalAFz-score2001.11Series4Round39-0.5-0.22002.10Series4Round470.70.72003.7Series4Round56-0.7-0.52004.9Series4Round67-0.4-0.42005.8FAPAS04790.80.92006.4FAPAS04880.80.82007.7FAPAS0410400組織國內(nèi)能力驗證活動1時間:2002年Analyse:花生醬中的黃曲霉毒素組織者:CCIBLAC輪次:國認實函[2001]17號參加實驗室數(shù):63

組織國內(nèi)能力驗證活動2時間:2005Analyse:花生醬中的黃曲霉毒素組織者:國家食品安全局Round:質(zhì)檢食函[2005]082號參加實驗室數(shù):15

組織國內(nèi)能力驗證活動3日期:2005Analyse:Aflatoxin

AnalysisinPeanutpaste組織者:山東局Round:魯檢便食字第077號AttendedLaboratoryNumber:52

組織國內(nèi)能力驗證活動4Date:2006(ongoing)Analyse:Aflatoxin

AnalysisinPeanutpasteSponsor:CNASRound:CANST0339AttendedLaboratoryNumber:74

組織國內(nèi)能力驗證活動5Date:2006Analyse:AflatoxinAnalysisinPeanutpasteSponsor:山東局Round:AttendedLaboratoryNumber:89六輸歐花生黃曲霉毒素的實驗室檢測工作&

（黃曲霉毒素的檢測流程）FlowchartofAflatoxinanalysis接樣Samplereceive

樣品登記Sampleregister

樣品制備Samplepreparation

凈化Samplecleanup

測定SampleHPLCdetermination

報告Report

留樣、記錄Reservesamplesandrecords接樣(1)Isitsealed?Isitclearlylabelled?Isitweighabout30kg?Samplereceive(2)樣品登記分樣SamplesmustbeThoroughlymixedbeforedividedintothreeSub-samples樣品制備、樣品均勻性測試

Sample

preparation

實驗室樣品、留存樣品

Samplepreparationrecord實驗室前處理SampleClean-up儀器測定HPLC

Determination如何保證檢測結(jié)果的準確？

實驗室質(zhì)量控制1、樣品制備過程：定期進行樣品均勻性核查2、實驗室檢測過程：日常檢測采用加標回收和質(zhì)控樣品加標回收質(zhì)控樣品3、每年參加國際間實驗室能力驗證活動檢測報告的格式與解釋1、方法的檢出限（LOD）

2、方法的檢測限（LOQ）

3、回收率（Recovery）

4、不確定度（Uncertainty）

報告中的檢出限、檢測限針對GB/