人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座

人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

和染色體標(biāo)本制備

遺傳病分析3人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第1頁(yè)原理在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中，中期染色體長(zhǎng)短、大小、恒定性正適合我們對(duì)其進(jìn)行分析、研究。所以利用人工方法，使大部分分裂細(xì)胞處于中期而不向后期轉(zhuǎn)化，并取得之，經(jīng)處理，制片后觀察分析。人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第2頁(yè)器材與試劑

器材：人外周血5ml。

培養(yǎng)箱、普通光學(xué)顯微鏡、離心機(jī)、水浴箱、天平等。試管架、刻度離心管、滴管和滴頭、酒精燈、冰載玻片等。人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第3頁(yè)器材與試劑

試劑：肝素

含10%小牛血清RPMI1640植物血凝素（PHA）秋水仙素（5微克/毫升）0.075MKCl，固定液（甲醇/冰乙酸3:1）Giemsa染液。人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第4頁(yè)操作1、采血：

取血3-5ml,肝素抗凝。2、接種：5ml培養(yǎng)液中加入0.3-0.5ml全血并搖勻，每份血樣接種2瓶，置37℃,培養(yǎng)72h。3、秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前1.5-2h加秋水仙素（終濃度為0.07

ug/ml），混勻，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。4、搜集細(xì)胞：將培養(yǎng)細(xì)胞混勻吸入刻度離心管（2瓶培養(yǎng)物吸入1支刻度離心管內(nèi)），1500r/min離心，10min。5、低滲處理：棄上清，加8ml0.075MKCl溶液，混勻，置37℃水浴20min。人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第5頁(yè)操作6、預(yù)固定：低滲處理后，加1

ml固定液混勻，5min后1500r/min離心，10min。7、固定：棄上清，加8

ml固定液，混勻，室溫靜置30min，1500r/min離心，10min。8、再固定：同上（省略）。9、制備細(xì)胞懸液：棄上清，視細(xì)胞數(shù)量多少加適量固定液制成細(xì)胞懸液。10、制片：取細(xì)胞懸液2-3滴，滴于冰玻上，并快速吹片，酒精燈火焰烤干。11、觀察：Giemsa染色，5min，自來(lái)水沖洗，鏡檢。人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第6頁(yè)結(jié)果光鏡100倍下人染色體G帶照片人類淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和染色體標(biāo)本制備專家講座第7頁(yè)注意事項(xiàng)

培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37℃±0.5℃。培養(yǎng)液pH值7.4±0.1，偏酸細(xì)胞發(fā)育不良，偏堿則細(xì)胞出現(xiàn)輕度固縮。PHA質(zhì)量和濃度很關(guān)鍵，它對(duì)淋巴細(xì)胞刺激效應(yīng)有個(gè)體差異較大。（肝素）

秋水仙素普通最終濃度以0.04-0.08ug為宜，處理時(shí)間為1-4h。低滲濃度與時(shí)間應(yīng)掌握好。固定液應(yīng)臨用時(shí)新鮮配制，固定時(shí)一定要徹