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第五章發(fā)酵工程制藥生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第1頁對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng),生產(chǎn)有用物質(zhì)過程就是發(fā)酵。采取微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥品就是微生物發(fā)酵制藥。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第2頁第一節(jié)概述生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第3頁一、微生物發(fā)酵制藥發(fā)展歷史微生物發(fā)酵制藥歷史悠久。但直到第二次世界大戰(zhàn)早期,人們認(rèn)識(shí)到抗生素尤其是青霉素主要性以后,才大大推進(jìn)微生物制藥工業(yè)發(fā)展。液體深層發(fā)酵技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、基因工程技術(shù)出現(xiàn),又為微生物發(fā)酵制藥帶來新發(fā)展空間。
生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第4頁二、微生物發(fā)酵制藥研究范圍1、微生物菌體發(fā)酵:取得含有藥用菌體為目標(biāo)發(fā)酵。2、微生物酶發(fā)酵:取得藥用酶為目標(biāo)發(fā)酵。3、微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵:取得微生物含有藥用各種初級(jí)產(chǎn)物和次級(jí)產(chǎn)物為目標(biāo)發(fā)酵。
4、微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵:利用微生物發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化作用生產(chǎn)藥品。
微生物轉(zhuǎn)化就是利用微生物細(xì)胞中一個(gè)酶或各種酶將一個(gè)化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)另一個(gè)產(chǎn)物生化反應(yīng)。
生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第5頁三、微生物發(fā)酵藥品分類微生物藥品有抗生素,維生素,AA,核酸相關(guān)物質(zhì),有機(jī)酸,治療酶,酶抑制劑,激素,免疫調(diào)整物質(zhì)以及其它生理活性物質(zhì)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第6頁四、制藥微生物1、制藥微生物種類生產(chǎn)藥品天然微生物主要包含細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素;放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素;真菌曲霉菌屬產(chǎn)生桔霉素,青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等,頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第7頁2、制藥微生物菌種選育主要有:自然選育、誘變育種、雜交育種、基因工程技術(shù)育種四種。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第8頁自然選育:在生產(chǎn)過程中,不經(jīng)過人工誘變處理,依據(jù)菌種自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選過程,叫自然選育或自然分離。自然選育慣用方法是單菌落分離,需要重復(fù)篩選,確定生產(chǎn)能力比原菌株高菌種?;具^程:菌種→單孢子或單細(xì)胞懸液→適當(dāng)稀釋→瓊脂平板分離→挑單個(gè)菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定→選出優(yōu)良菌株。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第9頁3、菌種保留目標(biāo):
保持長(zhǎng)久存活、不退化、不喪失生產(chǎn)能力。保留原理:使其代謝處于不活躍狀態(tài),即生長(zhǎng)繁殖受抑制休眠狀態(tài),可保持原有特征,延長(zhǎng)生命時(shí)限。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第10頁(1)斜面低溫保留保留方法:(2)液體石蠟密封存保藏(3)砂土管保藏(4)冷凍干燥保藏(5)液氮低溫保藏生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第11頁第二節(jié)發(fā)酵過程及其優(yōu)化控制生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第12頁一、發(fā)酵制藥基本過程菌株選育(mutationandselectionbreeding)發(fā)酵(fermentation)分離純化(isolationandpurification)包含三個(gè)主要工段:生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第13頁
1、生產(chǎn)菌種選育優(yōu)良菌種應(yīng)該高產(chǎn)、性能穩(wěn)定、輕易培養(yǎng)。2、發(fā)酵階段包含孢子制備、種子制備、發(fā)酵培養(yǎng),是生物加工工程過程。3、分離純化階段包含發(fā)酵液處理與過濾、分離提取、精制、成品檢驗(yàn)、包裝、出廠檢驗(yàn),是化學(xué)分離工程過程。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第14頁二、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制(一)、培養(yǎng)基及其制備1、培養(yǎng)基成份(1)、碳源凡是組成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱為碳源。其主要作用是供給菌種生命活動(dòng)所需要能量;組成菌體細(xì)胞成份和代謝產(chǎn)物。
在藥品發(fā)酵生產(chǎn)中慣用碳源有:糖類、醇類、脂肪、有機(jī)酸等。
生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第15頁(2)、氮源凡是組成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均稱為氮源。其主要功效是組成微生物細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物??煞譃橛袡C(jī)氮源和無機(jī)氮源兩類。
慣用有機(jī)氮源有黃豆餅粉(最慣用)、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、尿素等。
慣用無機(jī)氮源有銨鹽、氨水和硝酸鹽。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第16頁(3)、無機(jī)鹽及微量元素?zé)o機(jī)鹽和微量元素是生理活性物質(zhì)組成成份或含有生理活性作用調(diào)整物,包含磷、硫、鐵、鎂、鈣、錳、銅、鋅、鈷、鉀、鈉、氯等。普通低濃度起促進(jìn)作用,高濃度起抑制作用。菌體細(xì)胞主要成份,營(yíng)養(yǎng)傳遞介質(zhì)。調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境溫度。(4)、水消除泡沫,預(yù)防逃液和染菌。普通為動(dòng)植物油脂和高分子化合物。(5)、消沫劑生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第17頁生長(zhǎng)因子是指微生物生長(zhǎng)不可缺乏微量有機(jī)物,包含氨基酸、維生素、核苷酸、脂肪酸等。(6)、生長(zhǎng)因子在藥品生物合成過程中,被菌體直接用于藥品合成而本身結(jié)構(gòu)無顯著改變物質(zhì)稱為前體。前體顯著提升產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量,一定條件下還能控制菌體合成代謝產(chǎn)物方向。(7)、前體與促進(jìn)劑促進(jìn)劑是指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是前體,但能提升產(chǎn)物產(chǎn)量添加劑。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第18頁2、培養(yǎng)基種類按組成份為:合成培養(yǎng)基(synthesizedmedium)天然培養(yǎng)基(naturalmedium)
半合成培養(yǎng)基(semi-synthesizedmedium)
按用途分為:選擇性培養(yǎng)基(selectivemedium)判別性培養(yǎng)基(identificationmedium)
按物理性質(zhì)分為:固體培養(yǎng)基(solidmedium)
半固體培養(yǎng)基(semi-solidmedium)
液體培養(yǎng)基(liquidmedium)
生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第19頁按發(fā)酵過程中所處位置和作用分為:斜面或平板固體培養(yǎng)基(solidmedium)
種子培養(yǎng)基(seedmedium)發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentationmedium)補(bǔ)料培養(yǎng)基(fedmedium)生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第20頁(1)斜面或平板固體培養(yǎng)基(solidmedium)包含細(xì)菌和酵母固體斜面或平板培養(yǎng)基,鏈霉菌和絲狀真菌孢子培養(yǎng)基。作用:提供菌體生長(zhǎng)繁殖,形成孢子。特點(diǎn):菌體生長(zhǎng)快速,產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)大量孢子,但不能引發(fā)變異,營(yíng)養(yǎng)豐富。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第21頁(2)、種子培養(yǎng)基(seedmedium)種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽和菌體深入生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基,包含搖瓶和一二級(jí)種子罐培養(yǎng)基,為液體培養(yǎng)基。作用:使種子擴(kuò)大培養(yǎng),增加細(xì)胞數(shù)目,生長(zhǎng)形成強(qiáng)壯、健康和高活性種子。特點(diǎn):培養(yǎng)基成份完全,營(yíng)養(yǎng)豐富,含有輕易利用碳、氮源和無機(jī)鹽等,但總體濃度高。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第22頁(3)、發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentationmedium)發(fā)酵培養(yǎng)基是提供微生物進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基,不但要滿足菌體生長(zhǎng)和繁殖,還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物,是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最主要培養(yǎng)基。作用:
供菌體生長(zhǎng)繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物。特點(diǎn):組成應(yīng)豐富完整,營(yíng)養(yǎng)成份濃度和粘度適中。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第23頁(4)、補(bǔ)料培養(yǎng)基(fedmedium)補(bǔ)料培養(yǎng)基是發(fā)酵過程中添加培養(yǎng)基。作用:穩(wěn)定工藝條件,延長(zhǎng)發(fā)酵周期,提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。特點(diǎn):普通按單一成份配制,在發(fā)酵過程中各自獨(dú)立控制加入,或按一定百分比制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基,再加入。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第24頁3、影響培養(yǎng)基質(zhì)量原因(1)、原料質(zhì)量(2)、水質(zhì)(3)、滅菌(4)、培養(yǎng)基黏度生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第25頁(二)、溫度對(duì)發(fā)酵影響及其控制1、溫度對(duì)發(fā)酵影響發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成影響存在一個(gè)最適溫度范圍和最正確溫度點(diǎn),偏離一定范圍,生長(zhǎng)會(huì)受到抑制,各種酶反應(yīng)速率和產(chǎn)物性質(zhì)也會(huì)受到影響。溫度對(duì)培養(yǎng)基發(fā)酵液物理性質(zhì)也有很大影響,經(jīng)過影響?zhàn)ざ取⑷芙庋?、傳遞速率等影響發(fā)酵動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)物生物合成。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第26頁2、影響發(fā)酵溫度改變?cè)虬l(fā)酵過程中最終能量改變決定了發(fā)酵溫度,包含產(chǎn)能原因和失能原因共同作用。發(fā)酵熱(fermentationheat)等于產(chǎn)生熱(productionheat)與散失熱(lossheat)之差,產(chǎn)生熱包含生物熱(biologicalheat)和攪拌熱(agitationheat),散失熱包含蒸發(fā)燒(evaporationheat)、顯熱(sensibleheat)和輻射熱(radiantheat)。Q熱=Q生+Q攪-Q蒸-Q顯-Q輻生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第27頁3、溫度控制(1)最適溫度選擇依據(jù)發(fā)酵不一樣階段對(duì)溫度不一樣要求,選擇最適溫度并進(jìn)行變溫控制下發(fā)酵,以期高產(chǎn)。(2)溫度控制大型發(fā)酵罐普通不需要加熱,因?yàn)榘l(fā)酵中產(chǎn)生大量發(fā)酵熱,往往經(jīng)常需要降溫冷卻,控制發(fā)酵溫度。給發(fā)酵罐夾層或蛇形管通入冷卻水,經(jīng)過熱交換降溫,維持發(fā)酵溫度。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第28頁(三)、pH影響及其控制1、pH影響改變了細(xì)胞膜透性,影響了物質(zhì)吸收和產(chǎn)物分泌。2、影響pH改變?cè)虬l(fā)酵液pH改變是菌體產(chǎn)酸和產(chǎn)堿代謝反應(yīng)綜合結(jié)果,它與菌種、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件相關(guān)。培養(yǎng)過程中菌體對(duì)碳源、氮源物質(zhì)利用也是造成培養(yǎng)體系pH改變主要原因。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第29頁3、pH控制
(1)培養(yǎng)基配方考慮。均衡使用產(chǎn)酸物質(zhì)、產(chǎn)堿物質(zhì)及使用緩沖劑,確保碳氮比平衡。(2)酸堿調(diào)整。慣用生理酸性物質(zhì)如硫酸銨和生理堿性物質(zhì)氨水來控制,不但調(diào)整了pH,還補(bǔ)充了氮源。(3)補(bǔ)料流加控制。一個(gè)是直接補(bǔ)加酸堿物質(zhì),另一個(gè)方法是經(jīng)過控制代謝路徑實(shí)現(xiàn)pH控制.(4)調(diào)整通氣量。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第30頁(四)、溶解氧影響與控制溶解氧(dissolvedoxygen,DO)是指溶解于培養(yǎng)液中氧。溶解氧濃度由供氧和需氧兩方面所決定,供氧(oxygensupply)是指氧溶解于培養(yǎng)液過程。菌體吸收溶解氧過程是耗氧(需氧)過程。不一樣菌種對(duì)溶解氧量需求是不一樣,有一個(gè)適宜范圍,必須經(jīng)過試驗(yàn)確定臨界氧濃度和最適氧濃度,并在發(fā)酵中維持最適氧濃度。臨界氧濃度:不影響呼吸或產(chǎn)物合成最低溶解氧濃度。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第31頁溶解氧控制直接提升溶解氧:增加氧傳遞推進(jìn)力和通氣速率等。間接控制溶解氧:控制菌體濃度。工藝控制方法:控制補(bǔ)料速度,調(diào)整溫度(降低),培養(yǎng)基(配方,液化,降低粘度),中間補(bǔ)水,添加表面活性劑(消沫劑種類及數(shù)量次數(shù)時(shí)間)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第32頁(五)、CO2影響及其控制1、CO2對(duì)發(fā)酵影響CO2對(duì)微生物生長(zhǎng)或發(fā)酵含有刺激或抑制作用,還影響培養(yǎng)基酸-堿平衡。CO2對(duì)細(xì)胞影響機(jī)理:
①直接影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而影響細(xì)胞形態(tài)和生理過程。②與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),或與生長(zhǎng)必需金屬離子形成碳酸鹽沉淀,間接影響菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物合成。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第33頁2、CO2濃度控制通氣和攪拌是控制CO2濃度一個(gè)方法。降低通氣量和攪拌速率,有利于增加CO2在發(fā)酵液中濃度,反之,就會(huì)減小CO2濃度。另外,CO2產(chǎn)生與補(bǔ)料工藝控制親密相關(guān),如:青霉素發(fā)酵時(shí),補(bǔ)糖會(huì)增加排氣中CO2濃度和降低培養(yǎng)液pH。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第34頁(六)、補(bǔ)料作用和控制1、補(bǔ)料和放料
補(bǔ)料(fill):間歇或連續(xù)補(bǔ)加一個(gè)或各種成份新鮮培養(yǎng)基就是補(bǔ)料。
放料(wihtdraw):發(fā)酵到一定時(shí)間,產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物,放出一部分發(fā)酵液(進(jìn)行提?。?,又稱帶放。補(bǔ)料、放料作用在于:補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);改進(jìn)發(fā)酵液流變學(xué)性質(zhì);調(diào)控培養(yǎng)液pH;解除基質(zhì)過濃抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng);防止在分批發(fā)酵中因一次性投糖過多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)、耗氧過多而供氧不足情況。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第35頁2、補(bǔ)料控制系統(tǒng)(1)、反饋控制系統(tǒng)由傳感器、控制器、驅(qū)動(dòng)器組成。依據(jù)溶氧、pH、呼吸熵、排氣中CO2分壓,代謝產(chǎn)物濃度等指標(biāo)直接控制。(2)、非反饋控制系統(tǒng)非反饋控制流加系統(tǒng)是不經(jīng)過固定反饋控制參數(shù),而經(jīng)過經(jīng)驗(yàn)或數(shù)學(xué)最大優(yōu)化模型法,得到最優(yōu)流加操作曲線,從而實(shí)現(xiàn)流加控制。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第36頁(六)、泡沫影響及其控制1.泡沫影響降低裝料量;造成大量逃液,增加污染機(jī)率;泡沫使菌體呼吸受阻,代謝異常或自溶。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第37頁2.泡沫控制(1)培養(yǎng)基與工藝調(diào)整。調(diào)整培養(yǎng)基成份,少加或遲緩加易起泡原材料;改變一些物理化學(xué)參數(shù),如pH,升高溫度,降低通氣和降低攪拌速率;改變發(fā)酵工藝,如采取分次投料。(2)菌種選育。篩選出不產(chǎn)生流態(tài)泡沫菌種。(3)機(jī)械消沫(mechanicaldefoaming)。利用機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力改變而使泡沫破裂。(4)化學(xué)消沫。加入消沫劑(defoamingagent),降低泡沫液膜強(qiáng)度和表面黏度,使泡沫破裂。慣用消沫劑有天然油脂類(lipid)、高碳醇脂肪酸(highalcoholfattyacid)和酯類(ester)、聚醚類(polyether)、硅酮類(silicone)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第38頁(七)、發(fā)酵終點(diǎn)判斷判斷標(biāo)準(zhǔn):高產(chǎn)量、低成本。以原料和發(fā)酵成本占整個(gè)生產(chǎn)成本為主藥品,主要在于提升產(chǎn)率(單位體積、單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)量,kg/(hm3))、得率(轉(zhuǎn)化率,單位原料生產(chǎn)產(chǎn)物量,kg產(chǎn)物/kg原料)、發(fā)酵系數(shù)(單位發(fā)酵周期內(nèi)發(fā)酵體積生成產(chǎn)物,kg產(chǎn)物/(容積m3周期h))。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第39頁影響發(fā)酵終點(diǎn)判斷原因:1.經(jīng)濟(jì)原因發(fā)酵終點(diǎn)應(yīng)是最低成本取得最大生產(chǎn)能力時(shí)間。2.產(chǎn)品質(zhì)量3.生物、物理、化學(xué)指標(biāo)主要產(chǎn)物濃度、過濾速度、菌體形態(tài)、氨基氮、pH、DO、發(fā)酵液外觀和粘度等。4、特殊原因如染菌、代謝異常等情況。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第40頁三、滅菌操作技術(shù)雜菌(contaminatedmicrobe):對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)過程,除生產(chǎn)菌以外任何微生物。污染(contamination):感染雜菌發(fā)酵體系。
消毒(disinfection):指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除病原微生物(pathogen),到達(dá)無害化程度過程,只能殺死營(yíng)養(yǎng)體,而不能殺滅芽孢體,殺滅率99.9%以上。滅菌(sterilization):指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中全部生命物質(zhì)技術(shù)或工藝過程,到達(dá)無活微生物存在過程,微生物殺滅率99.999999%以上。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第41頁(一)、慣用滅菌方法與原理1、化學(xué)滅菌化學(xué)滅菌是指用化學(xué)物質(zhì)殺滅生物細(xì)胞滅菌操作。慣用化學(xué)滅菌劑有氧化劑類、鹵化物類、有機(jī)化合物等。滅菌原理:使蛋白質(zhì)變性,酶失活,破壞細(xì)胞膜透性,細(xì)胞死亡。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第42頁2、輻射滅菌各種物理射線對(duì)生物細(xì)胞含有殺傷能力,其中以紫外線最慣用。滅菌原理:核酸和蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有強(qiáng)烈吸收,DNA吸收紫外線后,會(huì)形成嘧啶二聚體,如胸腺嘧啶二聚體,分子之間交聯(lián)改變了DNA功效,從而造成生物細(xì)胞死亡。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第43頁3、干熱滅菌滅菌原理:在高溫120℃以上,蛋白質(zhì)、酶、核酸、生物膜等生物大分子變性、凝聚破壞,甚至是降解,生物細(xì)胞破裂,內(nèi)容物釋放,生物體死亡。足夠長(zhǎng)時(shí)間和足夠高溫度,能夠殺滅生物體。干熱—熱空氣
烘箱160~170℃2h滅菌生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第44頁(4)濕熱滅菌
蒸汽滅菌鍋121℃20~30min濕熱—水蒸汽滅菌原理:蒸汽冷凝時(shí)釋放出大量能量,使蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)部化學(xué)鍵破壞、降解,造成生物體死亡。在115℃~140℃,保持一段時(shí)間,能夠殺死各種生物體。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第45頁5、培養(yǎng)基過濾除菌有些培養(yǎng)基成份受熱輕易分解破壞,不能使用蒸汽滅菌,經(jīng)常采取過濾器除菌。常見有蔡氏細(xì)菌過濾器、燒結(jié)玻璃細(xì)菌過濾器和纖維素微孔過濾器等。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第46頁(二)、無菌檢驗(yàn)與雜菌控制1、無菌試驗(yàn)方法與染菌判斷雜菌檢測(cè)主要方法為顯微鏡檢測(cè)和平板劃線檢測(cè)兩種,顯微鏡檢測(cè)方便快速及時(shí),平板檢測(cè)需要過夜培養(yǎng),時(shí)間較長(zhǎng)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第47頁2、發(fā)酵污染雜菌原因(1)培養(yǎng)基滅菌不徹底(2)空氣帶菌(3)設(shè)備及其附件滲漏生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第48頁第三節(jié)發(fā)酵工程生產(chǎn)藥品生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第49頁
細(xì)菌抗菌素:多粘菌素,短桿菌素等植物抗生素:蒜素,番茄素,黃連素C等動(dòng)物抗生素:溶菌酶,魚素等??股兀海╝ntibiotics)抗生素是生物在其生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生,在低微濃度下能選擇性地抑制他種微生物機(jī)能化學(xué)物質(zhì)。一、抗生素生產(chǎn)工藝生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第50頁1928年,英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Fleming在培養(yǎng)葡萄球菌時(shí),發(fā)覺污染在培養(yǎng)皿上一株霉菌,能殺死周圍葡萄球菌。將此霉菌分離后得到純菌株,經(jīng)判定為點(diǎn)青霉(Penicilliumnotatum),將該菌產(chǎn)生抗生物質(zhì)命名為青霉素。(一)、抗生素工業(yè)發(fā)展生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第51頁1940年,F(xiàn)loreyandChain將青霉素制成制品,經(jīng)臨床試驗(yàn),證實(shí)青霉(Penicillin)毒性很小,對(duì)金黃色葡萄球菌及其它G+所引發(fā)許多嚴(yán)重疾病確有卓越療效。1943年,開始采取通氣攪拌深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)青霉素,從此發(fā)展了一個(gè)新工業(yè)部門——抗生素發(fā)酵工業(yè)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第52頁
1944年,WaKsman發(fā)覺了由鏈霉菌產(chǎn)生鏈霉素,用于治療細(xì)菌,尤其是對(duì)結(jié)核桿菌引發(fā)感染有特效。今后陸續(xù)發(fā)覺了抗G-、G+抗病毒廣譜抗生素,如氯霉素(1947年)、金霉素(1948年)和土霉素,抗真菌制霉菌素,對(duì)青霉素耐藥菌有效紅霉素(1951年)及抗癌抗生素絲裂霉素C等。
生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第53頁
1959年,
Batchelor取得了青霉素母核-6-氨基青霉烷酸,并研究了半合成青霉素和頭孢菌素C,得到耐酸、可口服并對(duì)青霉素耐藥菌有效廣譜青霉素。
60年代,半合成抗生素快速發(fā)展。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第54頁
1957年,華北制藥廠。1958年后,全國(guó)多處建廠,抗生素工業(yè)快速發(fā)展。截止到1996年上六個(gè)月,我國(guó)開發(fā)抗生素品種127個(gè)。國(guó)外有基本抗生素品種我國(guó)都有生產(chǎn)。并已研制出國(guó)外沒有抗生素——?jiǎng)?chuàng)新霉素等。我國(guó)1953年,建上海第三制藥廠,開始生產(chǎn)青霉素。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第55頁(二)、抗生素抗菌作用機(jī)理抗生素抗菌作用,主要是抑制微生物細(xì)胞新陳代謝一些步驟或一些酶系統(tǒng)。依照這些代謝步驟在生活機(jī)能上主要程度,抗菌作用效果各不相同。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第56頁
放線菌素D特異地與雙鏈DNA非共價(jià)結(jié)合,使之失去作為RNA合成模板功效。絲裂霉素C與DNA形成交聯(lián),阻止了雙鏈拆開因而抑制了DNA復(fù)制。利福平:依賴于DNARNA聚合酶特效抑制劑,專門抑制轉(zhuǎn)錄起始。1、抑制核酸合成
有些抗生素可抑制核酸合成,其抑制機(jī)理是各種多樣。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第57頁2、抑制蛋白質(zhì)合成
包含抑制氨基酸活化
、抑制蛋白質(zhì)合成起始、抑制肽鏈延長(zhǎng)、抑制蛋白質(zhì)合成終止。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第58頁(1)抑制氨基酸活化
吲哚霉素與Trp競(jìng)爭(zhēng)與Trp激活酶結(jié)合抑制了Trp-tRNATrp形成,因而阻止了蛋白質(zhì)合成。
Trp
抑制氨酰-tRNA形成生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第59頁(2)抑制蛋白質(zhì)合成起始
起碼密碼:AUG編碼
Met(真核)
fMet(原核)COOH-CH-CH2-CH2-SCH3︱
NH︱O=CHfMet-N-甲酰甲硫氨酸生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第60頁(3)抑制肽鏈延長(zhǎng)
肽鏈延長(zhǎng)包含氨酰-tRNA與70S核糖體A部位結(jié)合,肽鍵形成和移位。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第61頁
終止密碼:UAA、UAG、UGA終止過程:終止信號(hào)識(shí)別,完工了肽酰-tRNA水解與釋放。如嘌呤霉素與AA-tRNA3′-末端(tRNA3-ccA)AMP結(jié)構(gòu)相同,肽酰轉(zhuǎn)移酶促使(AA)n與嘌呤霉素結(jié)合形成肽酰-嘌呤霉素復(fù)合物,使Pr合成過程中止。(4)抑制蛋白質(zhì)合成終止生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第62頁
如多肽類抗生素、多粘菌素E、短桿菌肽S等都具表面活性劑作用,降低細(xì)菌細(xì)胞膜表面張力,因而改變了細(xì)胞膜通透性,甚至破壞了膜結(jié)構(gòu),影響細(xì)胞正常代謝,致使細(xì)菌死亡。這類抗生素靠損傷質(zhì)膜而呈殺菌作用,它們對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞膜也起作用,選擇性毒力不高。
3、改變細(xì)胞膜通透性生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第63頁
青霉素、頭孢菌素、桿菌肽等對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁合成含有抑制作用。青霉素專門作用于生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)菌,抑制新細(xì)胞壁形成,細(xì)胞壁合成受到抑制后,細(xì)菌抗?jié)B透壓能力降低,引發(fā)菌體變形、破裂而死亡。動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁,所以青霉素對(duì)其無副作用。4、干擾細(xì)胞壁形成生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第64頁如抗霉素A是呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)抑制劑,它抑制細(xì)胞色素b與細(xì)胞色素c1之間電子傳遞。(NADHFMNCoQCytb
Cytc1CyTcCyta1a3O2)
5、作用于能量代謝系統(tǒng)或作為抗代謝物生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第65頁
抗代謝物:在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需代謝物很相同,以致能夠和特定酶結(jié)合,從而妨礙酶功效,干擾代謝正常進(jìn)行。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第66頁
抗生素使用劑量不足,則達(dá)不到抑菌能力;但劑量過高,會(huì)產(chǎn)生毒副反應(yīng),并引發(fā)病原菌耐藥性。
(三)、抗生素劑量表示法生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第67頁
一個(gè)青霉素效價(jià)單位:能在50ml肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育最小青霉素劑量。一個(gè)鏈霉素效價(jià)單位:能在1ml肉湯培養(yǎng)基中完全抑制大腸桿菌(G-)發(fā)育最小劑量。
效價(jià)單位為衡量抗生素一個(gè)尺度。
一個(gè)制霉素效價(jià)單位:能抑制1ml肉湯培養(yǎng)基中某種酵母菌發(fā)育所需最小劑量。新發(fā)覺抗生素,早期未得到純晶體時(shí)慣用與它性質(zhì)相近已知抗生素作為標(biāo)準(zhǔn)來衡量其效價(jià)。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第68頁工藝流程:(四)、抗生素生產(chǎn)工藝菌種保藏孢子制備種子制備發(fā)酵提取精制抗生素工業(yè)生產(chǎn)包含發(fā)酵和提取兩部分。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第69頁例:青霉素生產(chǎn)工藝生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第70頁(五)、細(xì)菌反抗生素耐藥性機(jī)理1、耐藥菌產(chǎn)生造成抗生素失效酶(1)β-內(nèi)酰胺環(huán)被破壞(2)乙?;斐陕让顾厥н€有經(jīng)過反抗生素磷酸化,腺苷?;騈-乙酰化造成其失效。生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第71頁比如菌體核糖體30S亞基改變而使鏈霉素不能與之結(jié)合,就不能抑制蛋白質(zhì)生物合成而失效。鏈霉素抑制蛋白質(zhì)合成起始。耐利福霉素菌株,因?yàn)槿旧w突變,改變了RNA聚合酶(抑制劑)β-亞基,其結(jié)果使抗生素不能與它結(jié)合而失效。利福霉素抑制轉(zhuǎn)錄。2、耐藥菌改變反抗生素敏感部位生物制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第72頁(1)因?yàn)槟退幘蛲蛔冇绊懲ㄍ赶到y(tǒng)某一部分,因而使轉(zhuǎn)運(yùn)某抗生素功效部分或全部喪失。(2)產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素拮抗系統(tǒng)。(
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