流式細胞儀結(jié)果分析

流式細胞儀結(jié)果分析流式細胞儀結(jié)果分析第1頁第一節(jié)概述一、工作原理二、散射光測定三、熒光測量四、細胞分選原理第二節(jié)數(shù)據(jù)顯示與分析一、參數(shù)二、數(shù)據(jù)顯示方式三、設門分析技術(shù)第三節(jié)流式細胞儀免疫分析技術(shù)要求一、免疫檢測樣品制備二、免疫分析中常見熒光染料與標識染色三、免疫膠乳顆粒應用四、流式細胞免疫學技術(shù)質(zhì)量控制流式細胞儀結(jié)果分析第2頁第四節(jié)流式細胞術(shù)在免疫學檢驗中應用一、淋巴細胞及其亞群分析二、淋巴細胞功效分析三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析五、AIDS病檢測中應用六、本身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析七、移植免疫中應用思索題小結(jié)流式細胞儀結(jié)果分析第3頁流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測伎倆一項能快速、準確對單個細胞理化特征進行多參數(shù)定量分析和分選新技術(shù)。流式細胞儀結(jié)果分析第4頁流式細胞術(shù)最大特點是能在保持細胞及細胞器或微粒結(jié)構(gòu)及功效不被破壞狀態(tài)下，經(jīng)過熒光探針幫助，從分子水平上獲取各種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術(shù)特點流式細胞儀結(jié)果分析第5頁

流式細胞儀是測量染色細胞標識物熒光強度細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來對細胞物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類搜集高技術(shù)。第一節(jié)概述流式細胞儀結(jié)果分析第6頁流式細胞儀結(jié)果分析第7頁細胞組成細胞功效大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測細胞特征流式細胞儀結(jié)果分析第8頁采取激光作為激發(fā)光源，確保其含有更加好單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合標識技術(shù)，確保檢測靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動單細胞懸液中單個細胞多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，確保了檢測速度與統(tǒng)計分析準確性。一、工作原理流式細胞儀結(jié)果分析第9頁（1）液流系統(tǒng)（2）光學系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細胞儀基礎結(jié)構(gòu)：流式細胞儀結(jié)果分析第10頁由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞懸液 熒光染料標識單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，預防其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)流式細胞儀結(jié)果分析第11頁噴嘴FluorescencesignalsFocused

laserbeam鞘液液流系統(tǒng)示意圖流式細胞儀結(jié)果分析第12頁FCM液流系統(tǒng)（怎樣形成單個細胞流）樣本管鞘液管流式細胞儀結(jié)果分析第13頁激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，經(jīng)過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統(tǒng)流式細胞儀結(jié)果分析第14頁FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統(tǒng)示意圖流式細胞儀結(jié)果分析第15頁主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流式細胞儀結(jié)果分析第16頁基礎工作原理流式細胞儀結(jié)果分析第17頁單細胞液柱已標識單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)搜集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基礎過程流式細胞儀結(jié)果分析第18頁區(qū)分流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統(tǒng)計計算機，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡區(qū)分流式細胞儀結(jié)果分析第19頁細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射光線信號，它強弱與細胞大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等相關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光測定流式細胞儀結(jié)果分析第20頁流式細胞儀結(jié)果分析第21頁

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射訊號用于檢測細胞等粒子表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。流式細胞儀結(jié)果分析第22頁FALSSensorLaser前向散射光示意圖流式細胞儀結(jié)果分析第23頁

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。流式細胞儀結(jié)果分析第24頁FALSSensor90LSSensorLaser側(cè)向散射光示意圖流式細胞儀結(jié)果分析第25頁 測得FS與SS信號經(jīng)過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類基礎原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中判別出一些亞群

流式細胞儀結(jié)果分析第26頁熒光信號由被檢細胞上標識特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射熒光波長與激發(fā)光波長不一樣。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長熒光和顏色，經(jīng)過波長選擇通透性濾片，可將不一樣波長散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不一樣光電倍增管。選擇不一樣單抗及染料就可同時測定一個細胞上多個不一樣特征。線性放大器和對數(shù)放大器三、熒光測量流式細胞儀結(jié)果分析第27頁熒光染料特征激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)流式細胞儀結(jié)果分析第28頁流式細胞儀結(jié)果分析第29頁熒光賠償流式細胞儀結(jié)果分析第30頁經(jīng)過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對含有某種特征細胞需深入培養(yǎng)和研究時進行。四、細胞分選原理流式細胞儀結(jié)果分析第31頁細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入搜集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電（一）分選基礎原理流式細胞儀結(jié)果分析第32頁分選速度：單位時間內(nèi)分選細胞數(shù)量。與懸液中細胞含量成正比。分選純度：分選出目標細胞占全部收獲細胞百分率。分選收獲率：實際收獲分選細胞與設定經(jīng)過測量點分選細胞之間比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目標細胞總量，再經(jīng)分選后得到目標細胞實際得率。與分選速度成反比。（二）分選技術(shù)要求流式細胞儀結(jié)果分析第33頁參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)顯示與分析流式細胞儀結(jié)果分析第34頁FS：反應顆粒大小SS：反應顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程度FL：反應顆粒被染上熒光數(shù)量多少一、參數(shù)流式細胞儀結(jié)果分析第35頁單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數(shù)據(jù)顯示方式流式細胞儀結(jié)果分析第36頁由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)組成，反應一樣散射光或熒光強度顆粒數(shù)量多少。（一）單參數(shù)直方圖流式細胞儀結(jié)果分析第37頁單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel)流式細胞儀結(jié)果分析第38頁雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞兩個測量參數(shù)，依據(jù)這兩個參數(shù)就能夠確定細胞在圖上表示位置。雙參數(shù)信號通常采取對數(shù)信號，最常見是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反應一樣散射光或熒光強度顆粒數(shù)量多少。（二）雙參數(shù)直方圖流式細胞儀結(jié)果分析第39頁1.雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度流式細胞儀結(jié)果分析第40頁雙參數(shù)直方圖點圖流式細胞儀結(jié)果分析第41頁2.二維等高圖由類似地圖上等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上含有相同細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面線)所代表細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)改變率越大。流式細胞儀結(jié)果分析第42頁二維等高圖流式細胞儀結(jié)果分析第43頁3.假三維等高圖流式細胞儀結(jié)果分析第44頁（三）三參數(shù)直方圖流式細胞儀結(jié)果分析第45頁多參數(shù)分析：當細胞標識了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到熒光信號和散射光信號可依據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀多參數(shù)分析流式細胞儀結(jié)果分析第46頁Gate設置：指在某一張選定參數(shù)直方圖上，依據(jù)該圖細胞群分布選定其中想要分析特定細胞群，并要求該樣本全部其它參數(shù)組合直方圖只表達這群細胞分布情況。依據(jù)門形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設門分析技術(shù)流式細胞儀結(jié)果分析第47頁A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門流式細胞儀結(jié)果分析第48頁線性門流式細胞儀結(jié)果分析第49頁Region設置:

區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關(guān)概念，區(qū)閾可與門對應，不過也能夠包含于門。流式細胞儀結(jié)果分析第50頁D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就能夠由四個區(qū)域組成，即G=D1+D2+D3+D4。

流式細胞儀結(jié)果分析第51頁樣本制備標識染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四節(jié)流式細胞儀免疫分析技術(shù)要求

流式細胞儀結(jié)果分析第52頁外周血淋巴細胞樣品制備 分離單個核細胞培養(yǎng)細胞樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備流式細胞儀結(jié)果分析第53頁新鮮實體組織單細胞懸液制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液保留深低溫保留法（一年）乙醇或甲醇保留法（2周）甲醛或多聚甲醛保留法（2月）流式細胞儀結(jié)果分析第54頁適用條件:有較高量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對488nm激發(fā)光波長有較強吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大波長差易與標識單抗結(jié)合而不影響抗體特異性二、常見熒光染料與標識染色流式細胞儀結(jié)果分析第55頁FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類（一）幾個常見熒光染料流式細胞儀結(jié)果分析第56頁名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感降低交叉，成本高常見幾類熒光染料流式細胞儀結(jié)果分析第57頁 用化學法將兩種不一樣激發(fā)波長染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，經(jīng)過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料流式細胞儀結(jié)果分析第58頁PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制流式細胞儀結(jié)果分析第59頁熒光染料與細胞成份四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價鍵結(jié)合 熒光標識抗體特異性結(jié)合免疫熒光標識方法

直標:干擾少,但需購置各種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標識各種抗體 組合標識（二）免疫熒光標識流式細胞儀結(jié)果分析第60頁免疫膠乳顆粒應用即液相芯片技術(shù)是把微小乳膠微球分別染成上百種不一樣熒光色，把針對不一樣檢測物乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不一樣待測特產(chǎn)生不一樣顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)應用流式細胞儀結(jié)果分析第61頁微小乳膠微球分別染成上百種不一樣熒光色（固相芯片是用探針在芯片上坐標位置給基因特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）流式細胞儀結(jié)果分析第62頁流式細胞儀結(jié)果分析第63頁經(jīng)過對標識不一樣熒光素分子檢測，實現(xiàn)FCM對可溶性物質(zhì)定量分析流式細胞儀結(jié)果分析第64頁適當制備方式處理紅細胞實體組織起源標本用機械法溫度25~37℃，pH7.0~7.2四、流式細胞免疫學技術(shù)質(zhì)量控制（一）單細胞懸液制備質(zhì)控流式細胞儀結(jié)果分析第65頁溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色質(zhì)控流式細胞儀結(jié)果分析第66頁光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，降低變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準:確保樣品檢測時儀器處于最正確靈敏度工作狀態(tài)。絕對計數(shù)校準:確保計數(shù)準確性。Flow-checkFlow-setFlow-count（三）儀器操作質(zhì)控流式細胞儀結(jié)果分析第67頁同型對照：即免疫熒光標識中陰性對照，選取相同源性未標識單抗作為對照調(diào)整和設置電壓，以確保特異性。全程質(zhì)量控制：與待測標本一起標識和檢測，結(jié)果達靶值，提醒此次試驗結(jié)果可靠。（四）免疫檢測質(zhì)控流式細胞儀結(jié)果分析第68頁流式細胞術(shù)當前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面抗原成份進行標識分析，可區(qū)分各種細胞特征，為細胞免疫研究增加了有效伎倆和幫助。第四節(jié)在免疫學檢驗中應用流式細胞儀結(jié)果分析第69頁T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型本身抗體,參加免疫調(diào)整、與本身免疫病發(fā)生相關(guān)

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56