微生物遺傳變異和菌種保藏

本章內(nèi)容第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變及修復(fù)第三節(jié)基因重組第四節(jié)微生物育種第五節(jié)菌種衰退、復(fù)壯及保藏

微生物遺傳變異和菌種保藏第1頁第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)三個經(jīng)典試驗：轉(zhuǎn)化試驗噬菌體感染試驗植物病毒重建試驗微生物遺傳變異和菌種保藏第2頁試驗材料：試驗方法：動物試驗細菌培養(yǎng)試驗S型菌無細胞抽提液試驗（一）轉(zhuǎn)化試驗Griffith（1928）Avery（1944）微生物遺傳變異和菌種保藏第3頁試驗材料：肺炎雙球菌光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無莢膜菌落粗糙無毒不致病SⅠSⅡSⅢ三個血清型RⅠRⅡRⅢ三個血清型微生物遺傳變異和菌種保藏第4頁活死死加活R菌或死S菌加活S菌加活R菌和熱死S菌抽血分離活S菌轉(zhuǎn)化試驗（1）動物試驗?微生物遺傳變異和菌種保藏第5頁ＳⅢ〖熱死〗

無菌落生長

體外培養(yǎng)

ＲⅡ〖活菌〗

體外培養(yǎng)

ＲⅡ菌落

ＲⅡ菌落多ＳⅢ菌落少

體外混合培養(yǎng)ＳⅢ〖熱死〗

ＲⅡ〖活菌〗

說明：加熱殺死S型細菌中可能存在某種物質(zhì)，能經(jīng)過某種方式進入R型細菌。轉(zhuǎn)化試驗（2）細菌培養(yǎng)試驗微生物遺傳變異和菌種保藏第6頁大量R菌落活R菌S菌無細胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+說明：遺傳因子是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化試驗（3）S型菌無細胞抽提液試驗微生物遺傳變異和菌種保藏第7頁（二）噬菌體感染試驗微生物遺傳變異和菌種保藏第8頁吸附10分鐘后攪動離心上清液沉淀離心,分出上清液和沉淀.沉淀細胞深入培養(yǎng)，產(chǎn)生大量子代噬菌體(30%P32、

1%Ｓ35

）。證實：在其DNA中，含有包含Pro外殼在內(nèi)整套遺傳物質(zhì)。微生物遺傳變異和菌種保藏第9頁

植物病毒蛋白質(zhì)和RNA能夠人為地分開,同時又可把它們重新組合成具感染性病毒.甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒（三）植物病毒重建試驗

TMV:煙草花葉病毒HRV:霍氏車前花葉病毒（RNA)證實遺傳物質(zhì)是RNA微生物遺傳變異和菌種保藏第10頁TMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化植物病毒重建試驗

微生物遺傳變異和菌種保藏第11頁第二節(jié)基因突變及修復(fù)一基因突變二DNA損傷修復(fù)微生物遺傳變異和菌種保藏第12頁一基因突變（一）突變類型（二）突變特點微生物遺傳變異和菌種保藏第13頁（一）突變類型1堿基改變與遺傳信息改變2表型改變微生物遺傳變異和菌種保藏第14頁1堿基改變與遺傳信息改變（1）錯義突變（missensemutation）：某個密碼第一個堿基或第二個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，使編碼某一氨基酸密碼變?yōu)榫幋a另一個氨基酸密碼。氨基酸置換（2）無義突變（nonsensemutation）：某個密碼第一個堿基或第二、第三個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸密碼。終止密碼子（UAA,UAG,UGA)。（3）同義突變（samesensemutation）：發(fā)生改變堿基位于密碼第3位，普通編碼同一個氨基酸。比如簡并密碼。編碼氨基酸與野生型氨基酸相同。（4）移碼突變（frameshiftmutation）：DNA序列中1-2個核苷酸缺失或插入，翻譯閱讀框改變，造成氨基酸序列改變。微生物遺傳變異和菌種保藏第15頁2表型改變（1）營養(yǎng)缺點型（2）抗藥性突變型（3）條件致死突變型（4）形態(tài)突變型微生物遺傳變異和菌種保藏第16頁（1）營養(yǎng)缺點型(auxotroph)▲因為代謝障礙成為必須添加某種物質(zhì)才能生長突變株。▲

腺嘌呤突變株Ade-（完全培養(yǎng)基）腺嘌呤野生型菌株Ade+（基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基）?！鵂I養(yǎng)缺點型是微生物遺傳學(xué)研究中主要選擇標識和育種主要伎倆?！糜坝∑桨暹M行分離篩選。微生物遺傳變異和菌種保藏第17頁完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第18頁（2）抗藥性突變型（resistantmutant)因為基因突變使菌株對某種或某幾個藥品，尤其是抗生素，產(chǎn)生抗性一個突變型。在加有對應(yīng)抗生素平板上，只有抗性突變能生長。微生物遺傳變異和菌種保藏第19頁▲在某一條件下含有致死效應(yīng)，在另一條件下沒有致死效應(yīng)?！铣申P(guān)鍵性酶基因發(fā)生了突變?！?/p>

如溫度敏感突變ts（42℃致死，25℃~30℃存活）。▲用影印平板進行分離篩選。（3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）微生物遺傳變異和菌種保藏第20頁細胞形態(tài)突變

菌落形態(tài)突變顏色突變噬菌斑形態(tài)突變（4）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）包含微生物遺傳變異和菌種保藏第21頁（二）突變特點1非對應(yīng)性：環(huán)境與變異無對應(yīng)性。2自發(fā)性：非人為誘變原因下發(fā)生。3規(guī)律性：某一特定性突變率具規(guī)律性。4獨立性：一個基因突變對其它基因突變無影響。5稀有性：生物自發(fā)突變率為10-6～10-12。6誘變性：誘變劑可提升突變率10~105×。7穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。8可逆性：有回復(fù)突變。微生物遺傳變異和菌種保藏第22頁二DNA損傷及修復(fù)（自學(xué)）1光復(fù)活作用（Photoreactivation）2切除修復(fù)（ExcisionRepair）3重組修復(fù)（RecombinationRepair）4SOS修復(fù)（SOSRepair）微生物遺傳變異和菌種保藏第23頁光復(fù)活作用（Photoreactivation）ThymineDimer微生物遺傳變異和菌種保藏第24頁Photoreactivation光解酶Phr在黑暗中專一地識別嘧啶二聚體，并與之結(jié)合，形成酶-DNA復(fù)合物，當有光時，酶利用光能將二聚體拆開，恢復(fù)原狀，酶再釋放出來。微生物遺傳變異和菌種保藏第25頁正?？梢姽庀鹿庹T導(dǎo)系統(tǒng)修復(fù)。photoreactivationenzyme光裂合酶photolyase烷基轉(zhuǎn)移酶Alkyltransferases切割嘧啶二聚體，分開。胸腺嘧啶二聚體光復(fù)活酶可見光光吸收酶釋放光復(fù)活過程微生物遺傳變異和菌種保藏第26頁第三節(jié)基因重組一、原核生物基因重組二、真核生物基因重組微生物遺傳變異和菌種保藏第27頁基因重組§把兩個不一樣性狀個體內(nèi)遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個體方式。§基因重組——分子水平雜交§普通雜交——細胞水平如：

甲

乙生長快、產(chǎn)量低生長慢、產(chǎn)量高

基因重組

生長快、產(chǎn)量高微生物遺傳變異和菌種保藏第28頁一原核微生物基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（三）接合(conjugation)微生物遺傳變異和菌種保藏第29頁（一）轉(zhuǎn)化（transformation)概念——

受體細胞(receptor)直接吸收來自供體細胞(donor)DNA片斷，并把它整合到自己基因組中，細胞部分遺傳性狀發(fā)生改變現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。

1.感受態(tài)2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子4.轉(zhuǎn)化特點微生物遺傳變異和菌種保藏第30頁

（1）感受態(tài)：受體細胞最易接收外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化一個生理狀態(tài)。（2）轉(zhuǎn)化決定原因：不一樣菌株親緣關(guān)系;受體細胞是否處于感受態(tài)；不一樣菌出現(xiàn)感受態(tài)時間不一樣。（3）感受態(tài)取得：自然取得；用CaCl2處理細胞；電穿孔1.感受態(tài)微生物遺傳變異和菌種保藏第31頁細菌本身分泌一個胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD。其作用為：（1）催化轉(zhuǎn)化，促進外來DNA片段吸收。（2）可降解細胞表面某種成份，使DNA受體暴露。

§不一樣菌細胞DNA受體位點不一樣。

§有菌感受態(tài)因子只對同種菌起作用。2.感受態(tài)因子微生物遺傳變異和菌種保藏第32頁3.轉(zhuǎn)化因子（1）

轉(zhuǎn)化因子由供體提供。（2）

普通為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；雙鏈ＤＮＡ有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒有。（3）

自然情況下可由細菌細胞自行裂解產(chǎn)生；試驗室里經(jīng)過提取取得。（4）

轉(zhuǎn)化頻率往往很低，普通為0.1～1%。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高。游離ＤＮＡ片斷叫轉(zhuǎn)化因子。微生物遺傳變異和菌種保藏第33頁4.轉(zhuǎn)化特點不需兩個細胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。微生物遺傳變異和菌種保藏第34頁在細菌感受態(tài)出現(xiàn)時，含有從周圍環(huán)境吸收DNA分子而不被DNA酶破壞生理特征。處于感受態(tài)細胞，吸收DNA能力有時可比普通細胞大1000倍。微生物遺傳變異和菌種保藏第35頁微生物遺傳變異和菌種保藏第36頁（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)以溫和噬菌體為媒介，把供體細胞DNA或RNA片斷轉(zhuǎn)移到受體細胞中，從而使后者取得前者部分遺傳性狀。不需要細胞間直接接觸。但需要媒介。微生物遺傳變異和菌種保藏第37頁

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（GeneralizedTransduction）

噬菌體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體任何部分到受體細胞中。

局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（SpecializedTransduction）

噬菌體總是攜帶一樣片段到受體細胞中。微生物遺傳變異和菌種保藏第38頁結(jié)果10-5頻率出現(xiàn)野生型菌株。（基本培養(yǎng)基）U型管試驗：也能出現(xiàn)野生型菌株（基本培養(yǎng)基）在對鼠傷寒沙門氏菌營養(yǎng)缺點型菌株研究中發(fā)覺A+B-A-B+A+B+A+B+微生物遺傳變異和菌種保藏第39頁供體A-B+A+B-多數(shù)受體形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子A:組氨酸B:色氨酸GeneralizedTransduction微生物遺傳變異和菌種保藏第40頁SpecializedTransduction▲

被轉(zhuǎn)導(dǎo)基因與噬菌體DNA共價連接，與噬菌體DNA一起進行復(fù)制包裝以及導(dǎo)入受體細胞?！?/p>

噬菌體攜帶特殊染色體片段將固定個別基因?qū)胧荏w。普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)不一樣之處：微生物遺傳變異和菌種保藏第41頁SpecializedTransduction原噬菌體供體DNA受體DNA微生物遺傳變異和菌種保藏第42頁（三）接合(conjugation)概念：供體細胞與受體細胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA過程。在受體細胞中發(fā)生交換、整合，使之取得供體菌遺傳性狀現(xiàn)象，稱為接合。

經(jīng)過接合而取得新性狀受體細胞就稱接合子。微生物遺傳變異和菌種保藏第43頁+A+B+C-D-A-B-C+D+接合及其發(fā)現(xiàn)（大腸桿菌）A+B+C+D+A:生物素B:甲硫氨酸C:蘇氨酸D:賴氨酸基本培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+微生物遺傳變異和菌種保藏第44頁Davis（1950）U型管試驗兩個菌株不能直接接觸，只能是培養(yǎng)液和營養(yǎng)物質(zhì)（包含DNA分子）能夠經(jīng)過。完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+基本培養(yǎng)基沒有菌生長微生物遺傳變異和菌種保藏第45頁1.F+與F-雜交F+細菌表面有稱作性菌毛（sexpili）細長菌毛，由此與F－細菌接合，一旦接觸后，菌毛發(fā)生改變，成為兩細胞間原生質(zhì)通道----細胞質(zhì)橋或稱結(jié)合管（conjugationtube），F(xiàn)+細胞F因子經(jīng)過接合管向F－細胞轉(zhuǎn)遞：使F－變成F＋，F(xiàn)因子還可改變細胞表面結(jié)構(gòu)，以防F＋細胞間接合。F+細菌：含有F因子F-細菌：不含有F因子F因子就是F質(zhì)粒。微生物遺傳變異和菌種保藏第46頁滾環(huán)式復(fù)制，σ式微生物遺傳變異和菌種保藏第47頁微生物遺傳變異和菌種保藏第48頁2.Hfr×F-雜交Hfr菌形成——

F質(zhì)粒整合到細菌染色體上。微生物遺傳變異和菌種保藏第49頁質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子之間同源重組造成質(zhì)粒整合。微生物遺傳變異和菌種保藏第50頁Hfr×F-雜交結(jié)果仍是Hfr細胞和F-細胞。微生物遺傳變異和菌種保藏第51頁Hfr和F+聯(lián)絡(luò)和區(qū)分

聯(lián)絡(luò)：（1）都是雄性菌，含有F質(zhì)粒。（2）Hfr——F質(zhì)粒與染色體整合。

F+

——

F質(zhì)粒游離在染色體外。區(qū)分：（1）Hfr

F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率低，F(xiàn)+

F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高；（2）Hfr

F質(zhì)粒整合，F(xiàn)+

F質(zhì)粒游離。微生物遺傳變異和菌種保藏第52頁3.F’

轉(zhuǎn)導(dǎo)F’

因子攜帶有宿主染色體基因F因子。從Hfr菌中染色體上脫離下來F質(zhì)粒有時會攜帶相鄰染色體基因或DNA片段，稱為F’質(zhì)粒（F’因子），該菌被稱為F’菌。F’因子微生物遺傳變異和菌種保藏第53頁§給體部分染色體基因隨F’一起轉(zhuǎn)入受體細胞?；虿恍枵暇涂杀硎尽！炖肍’因子形成部分二倍體叫做性導(dǎo)sexduction。F’×F-雜交微生物遺傳變異和菌種保藏第54頁注意區(qū)分F+菌、Hfr菌、F’

菌不一樣！微生物遺傳變異和菌種保藏第55頁轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合三者根本區(qū)分

在于DNA轉(zhuǎn)移方式不一樣轉(zhuǎn)化：供體DNA片斷→注入受體細胞，經(jīng)過細胞膜接合：供體進入受體經(jīng)過性菌毛。轉(zhuǎn)導(dǎo)：供體DNA片斷經(jīng)過媒介－噬菌體攜帶進入受體。微生物遺傳變異和菌種保藏第56頁二真核微生物基因重組（一）有性生殖（二）準性生殖（parasexualhybridization）（三）酵母菌接合型遺傳微生物遺傳變異和菌種保藏第57頁（一）有性生殖普通指性細胞間接合和隨之發(fā)生染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代一個生殖方式。凡是能產(chǎn)生有性孢子酵母菌或霉菌，標準上都能采取與高等動、植物有性生殖相同方法進行有性繁殖。一部分真菌減數(shù)分裂發(fā)生在1個閉合子囊殼中，具較短生活周期，為遺傳重組研究帶來極大方便。微生物遺傳變異和菌種保藏第58頁子囊孢子形成過程粗糙脈胞霉：1個子囊內(nèi)產(chǎn)生雙倍體核直接減數(shù)分裂后所產(chǎn)生4個孢子直線排列在子囊內(nèi)（為次序排列四分體），再進行一次有絲分裂，產(chǎn)生8個子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8個子囊孢子排列：微生物遺傳變異和菌種保藏第59頁粗糙脈胞霉（面包霉）生活史分生孢子（n）菌絲（n）子實體核融合合子核(2n)交配型A交配型B減數(shù)分裂I減數(shù)分裂II有絲分裂萌發(fā)(n)子囊孢子（n）微生物遺傳變異和菌種保藏第60頁粗糙脈胞霉減數(shù)分裂微生物遺傳變異和菌種保藏第61頁微生物遺傳變異和菌種保藏第62頁（二）準性生殖（parasexualreproduction）1.準性生殖2.準性生殖意義3.過程微生物遺傳變異和菌種保藏第63頁1準性生殖

同種異株兩個體細胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而造成低頻基因重組發(fā)生一個繁殖方式。（單倍體體細胞重組）準性生殖與有性生殖不一樣：

▲重組體細胞和普通營養(yǎng)體細胞外形沒有不一樣，不產(chǎn)生在特殊囊器中。▲染色體交換及單倍體化過程沒有規(guī)律性。微生物遺傳變異和菌種保藏第64頁2準性生殖意義▲對一些沒有有性過程但有主要生產(chǎn)價值半知菌來說，進行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準性生殖提供了一個主要伎倆?！l(fā)覺存在于構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線菌中，使之有普遍意義。微生物遺傳變異和菌種保藏第65頁3準性生殖過程（1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;（2）形成異核體（heterocaryon）;細胞質(zhì)、細胞核交流形成異核菌絲體。（3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點：頻率低，10-5～10-7

促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。（4）體細胞交換和單倍體化微生物遺傳變異和菌種保藏第66頁異核體同時含有二種或二種以上不一樣基因型核在同一細胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象又叫異核現(xiàn)象。同核體同一菌絲中只有一個核。

微生物遺傳變異和菌種保藏第67頁體細胞交換和單倍體化

體細胞交換：

雜合二倍體細胞中有極少數(shù)細胞核在進行有絲分裂

過程中，能發(fā)生體細胞染色體間交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生含有新性狀單倍體雜合子。

單倍體化：

在一系列有絲分裂過程中一再發(fā)生個別染色體減半，直至最終形成單倍體過程。

微生物遺傳變異和菌種保藏第68頁（三）酵母菌接合型遺傳§酵母菌以單倍體或二倍體狀態(tài)存在?！靻伪扼w：a細胞或α細胞，或稱a接合型，α接合型。§二倍體：a細胞和α細胞融合形成二倍體細胞?！旖雍闲瓦z傳：a細胞α細胞轉(zhuǎn)變。盒式機制轉(zhuǎn)變。微生物遺傳變異和菌種保藏第69頁開啟子緘默狀態(tài)緘默狀態(tài)a基因表示。a型細胞。盒式機制轉(zhuǎn)變在于MAT活性區(qū)調(diào)控作用微生物遺傳變異和菌種保藏第70頁第四節(jié)微生物育種一誘變育種營養(yǎng)缺點型篩選三原生質(zhì)體融合微生物遺傳變異和菌種保藏第71頁一誘變育種1、概念2、誘變劑3.誘變程序4、誘變主要步驟微生物遺傳變異和菌種保藏第72頁1、概念誘變育種是用物理或化學(xué)誘變劑使誘變對象內(nèi)遺傳物質(zhì)（DNA）分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引發(fā)性狀變異并經(jīng)過篩選取得符合要求變異菌株一個育種方法。微生物遺傳變異和菌種保藏第73頁2誘變劑（1）概念：凡能提升基因突變頻率理化原因。

（2）種類：

1）物理因子（phisicalagents)

物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。2）化學(xué)因子(chemicalagents)微生物遺傳變異和菌種保藏第74頁化學(xué)誘變劑

堿基修飾劑

如：羥胺、氮芥、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTG）

機制：對堿基做修飾，改變堿基配對性質(zhì)。

堿基類似物

如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）、5-溴尿嘧啶（5-UB）、2-氨基嘌呤（2AP）等。

機制：在DNA復(fù)制時將堿基類似物插入DNA中，而堿基類似物存在正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)轉(zhuǎn)變，在DNA復(fù)制時出現(xiàn)突變體。微生物遺傳變異和菌種保藏第75頁

插入劑

(intercalatingagents):

如：溴化乙錠、吖啶橙等一些三環(huán)分子。機制：在形態(tài)上類似于堿基正確扁平分子。它們插入DNA分子堿基對之間，使其分開，造成DNA在復(fù)制過程中滑動，引發(fā)移碼突變。

微生物遺傳變異和菌種保藏第76頁與胞嘧啶反應(yīng)，加上羥基（-OH），對胞嘧啶加以修飾。修飾后胞嘧啶類似胸腺嘧啶T。C—G羥基化胞嘧啶—A誘發(fā)CG到TA轉(zhuǎn)換突變堿基修飾劑----羥胺微生物遺傳變異和菌種保藏第77頁堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）正常狀態(tài)：類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對。

A—5BUA—T下一輪復(fù)制稀有狀態(tài)：類似胞嘧啶，只與鳥嘌呤配對。

G—5BUG—C下一輪復(fù)制正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)能夠相互轉(zhuǎn)換微生物遺傳變異和菌種保藏第78頁BDNA分子吸收稀有狀態(tài)5BU

G—5BUA—TDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成正常狀態(tài)（G—C）（取代G—C）ADNA分子吸收正常狀態(tài)5BU

A—5BUG—CDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成稀有狀態(tài)（A—T）（取代A—T）堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）微生物遺傳變異和菌種保藏第79頁圖示微生物遺傳變異和菌種保藏第80頁3誘變程序

原始菌種

原菌種特征判定

純化

斜面/肉湯

培養(yǎng)單孢子/單細胞懸液

誘變劑處理

計算存活率

平板分離

觀察形態(tài)變異，挑單菌落

移至斜面

初篩

復(fù)篩

小試

良種保藏

中試微生物遺傳變異和菌種保藏第81頁4誘變主要步驟（1）誘變劑選擇（2）出發(fā)菌株選擇（3）單孢子或單細胞懸液制備（4）設(shè)計和采取效率高篩選方案和方法

微生物遺傳變異和菌種保藏第82頁（1）誘變劑選擇：

1）了解誘變劑性質(zhì)、作用機理和使用方法。2）處理方式§單一因子處理：先后使用。§復(fù)合因子處理：兩種以上原因同時使用、單一因子重復(fù)使用。3）處理劑量：測致死率。方法：平板菌落計數(shù)法普通殺菌率為70%左右。

微生物遺傳變異和菌種保藏第83頁（2）出發(fā)菌株：

育種原始菌種應(yīng)具備：

§對誘變劑敏感性高；

§生產(chǎn)中選育過自發(fā)變異菌株；

§本身含有一些有利性狀；

§對代謝產(chǎn)物有一定積累；

§已經(jīng)發(fā)生過一些變異。微生物遺傳變異和菌種保藏第84頁（3）單孢子或單細胞懸液制備

1）必要性：單細胞可均勻地接觸誘變劑，防止出現(xiàn)不純菌落——菌種退化。

2）制備：物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液。3）方法：三角瓶內(nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑，用無菌脫脂棉過濾）。4）濃度：細菌、放線菌108個/ml

霉菌、酵母菌106個/ml

微生物遺傳變異和菌種保藏第85頁（4）設(shè)計和采取效率高篩選方案和方法

1）初篩：平板上做定性、半定量測定，觀察突變株生理效應(yīng)范圍。

方法

§梯度平板法（抗性菌株）

§紙片法（抗性菌株）

§透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等）

§變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株）2）復(fù)篩：

較準確生物化學(xué)分析方法—做搖瓶測定微生物遺傳變異和菌種保藏第86頁二營養(yǎng)缺點型篩選（一）概念（二）篩選方法（三）應(yīng)用微生物遺傳變異和菌種保藏第87頁（一）概念1.三種遺傳型個體2、篩選取培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第88頁1三種遺傳型個體（1）營養(yǎng)缺點型（auxotroph）：

經(jīng)誘變產(chǎn)生一些合成能力出現(xiàn)缺點，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入對應(yīng)有機養(yǎng)分才能正常生長變異菌株。如：Lys-;Bio-（2）野生型(wildtype)：

自然界分離到任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺點突變前原始菌株，為該微生物野生型。如：Lys+；Bio+（3）原養(yǎng)型(prototroph)：

指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生菌株，與野生型表型相同。微生物遺傳變異和菌種保藏第89頁2篩選取培養(yǎng)基1）基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）[-]：

僅能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求培養(yǎng)基。2）完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）[+]：

滿足一切auxotroph生長天然或半組合培養(yǎng)基。3）補充培養(yǎng)基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有針對性地加入一或幾個營養(yǎng)成份以滿足相應(yīng)auxotroph生長組合培養(yǎng)基。微生物遺傳變異和菌種保藏第90頁（二）篩選方法auxotroph篩選程序：篩選普通要經(jīng)過誘變、淘汰野生型、檢出和判定營養(yǎng)缺點型四個步驟。

細菌培養(yǎng)

離心洗滌

誘變處理

在CM上培養(yǎng)

洗滌

MM培養(yǎng)（加青霉素等篩選劑）

涂布于CM平板

影印培養(yǎng)

挑取

判定

菌種保留。微生物遺傳變異和菌種保藏第91頁完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第92頁（三）auxotroph應(yīng)用（1）作為標識菌株：研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工程進行育種時帶有特定基因標識親本菌。（2）作為生產(chǎn)菌種：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；（3）作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測定試驗菌種。微生物遺傳變異和菌種保藏第93頁三原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）§使遺傳性狀不一樣兩細胞原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）過程?！煲殉晒Φ貞?yīng)用于真菌細胞和植物細胞屬間和科間遠緣細胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細胞基因組。微生物遺傳變異和菌種保藏第94頁1原生質(zhì)體制備2原生質(zhì)體融合和再生3融合子選擇微生物遺傳變異和菌種保藏第95頁1原生質(zhì)體制備1）選擇兩個親本菌株。

細菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蝸牛酶。2）酶處理破壞細胞壁，使原生質(zhì)流出。制備用培養(yǎng)基：高滲緩沖液或培養(yǎng)基。微生物遺傳變異和菌種保藏第96頁2原生質(zhì)體融合和再生1）原生質(zhì)體融合

化學(xué)因子誘導(dǎo)：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG）

并加入Ca2+、Mg2+等陽離子電場誘導(dǎo)：電極極化原生質(zhì)體成偶極子，沿電力線排列成串，電流脈沖，原生質(zhì)體膜被擊穿，融合。2）原生質(zhì)體再生

在再生培養(yǎng)基上再生。再生率0.幾%~幾%.微生物遺傳變異和菌種保藏第97頁3融合子選擇營養(yǎng)缺點型標識選擇依靠在選擇培養(yǎng)基上遺傳標識，有兩個遺傳標識互補，可確定為融合子?？顾幮詷俗R。微生物遺傳變異和菌種保藏第98頁第五節(jié)菌種衰退、復(fù)壯及保藏一、菌種衰退和復(fù)壯

二、菌種保藏微生物遺傳變異和菌種保藏第99頁一、菌種衰退和復(fù)壯（一）衰退（二）預(yù)防衰退方法（三）菌種復(fù)壯微生物遺傳變異和菌種保藏第100頁（一）衰退1、概念：菌種經(jīng)長久人工培養(yǎng)或保藏,在其自發(fā)突變影響下，引發(fā)一些優(yōu)良性狀變?nèi)趸蛳КF(xiàn)象，稱為衰退。2、現(xiàn)象

（1）菌落和細胞形態(tài)改變；（2）生長速度遲緩，產(chǎn)孢子越來越少；（3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；（4）抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。微生物遺傳變異和菌種保藏第101頁基因負突變——不利突變

（1）屢次傳代造成負突變數(shù)量增加

如斜面保藏——

細菌：1個月酵母菌：3個月放線菌、霉菌、芽孢：六個月

（2）培養(yǎng)條件；

（3）誘變時出現(xiàn)不純菌落。3、衰退原因微生物遺傳變異和菌種保藏第102頁（二）預(yù)防衰退方法1、控制傳代次數(shù)；2、選擇適當培養(yǎng)條件；3、采取不一樣類型細胞進行傳代；4、采取有效菌種保藏方法。微生物遺傳變異和菌種保藏第103頁（三）菌種復(fù)壯1復(fù)壯：使衰退菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀方法。2復(fù)壯方法：

（1）純種分離：菌落純（劃線法、涂布法、傾注法）菌株純（單細胞挑取法）（2）經(jīng)過寄主體進行復(fù)壯；（3）淘汰已衰退個體。微生物遺傳變異和菌種保藏第104頁二、菌種保藏（一）目標（二）原理（三）方法微生物遺傳變異和菌種保藏第105頁（一）