中藥有效成分研究專家講座

第一節(jié)研究過程

一、概述

2l世紀已經到來,在新世紀,含有我國傳統文化特色和獨特優(yōu)勢中藥，正面臨著前所未有發(fā)展機遇和挑戰(zhàn)：首先，伴隨社會發(fā)展，人類疾病譜已悄然發(fā)生改變，醫(yī)療模式已由單純疾病治療轉變?yōu)轭A防、保健、治療、康復相結合模式，各種替換醫(yī)學和傳統醫(yī)學正發(fā)揮著越來越大作用。生存環(huán)境不停惡化，人類“回歸自然”呼聲越來越高，傳統醫(yī)藥倍受青睞。

中藥有效成分研究專家講座第1頁另首先，伴隨全球經濟一體化進程加緊，尤其是我國已經正式加入WTO，中國醫(yī)藥市場融入國際醫(yī)藥大市場廣度和深度將深入加劇，將面臨強大跨國醫(yī)藥集團激烈競爭以及日本、韓國、印度等亞洲國家傳統醫(yī)藥產品和德國、法國等歐洲國家植物藥巨大沖擊，我國生產眾多傳統中藥產品因為尚不能符合國際醫(yī)藥市場標準和要求，當前僅3%國際市場銷售份額還有可能深入萎縮。中藥有效成分研究專家講座第2頁不過，我國是世界上植物資源最為豐富國家，約有30000余種高等植物。我國有從熱帶、亞熱帶、溫帶到寒帶各種植物資源，其中特有種占50％以上，其豐富生物多樣性是世界上其它國家所不能及，蘊藏著巨大開發(fā)潛力。為從事天然藥品研究提供豐富研究材料。

中藥有效成分研究專家講座第3頁選擇確定作為開發(fā)對象目標化合物

工業(yè)化探討（大量制備）

臨床試驗用樣品

上市銷售（GSP)當代創(chuàng)新藥品研究開發(fā)大致過程合成情報

提取、結

構測定

活性篩選藥理

生化特殊毒性

毒

性藥效藥理普通藥理藥品動態(tài)吸收排泄代謝作用機理急性毒性亞急性毒性慢性毒性致畸致癌

致癮

生殖毒性

理化學性質、

制訂質量標準穩(wěn)定性配伍改變試驗方法試驗規(guī)格工業(yè)制備方法探討

合成提取精制

發(fā)酵制劑化探討III期：毒性、藥效（多數病人，

多點觀察）II期：毒性、藥效（少數病人）I期：毒性（健康人群）申請臨床試驗(GCP）申請生產許可(GMP)創(chuàng)新藥品源頭研究階段(GLP)

雜志公開發(fā)表

接收公眾檢驗申請專利中藥有效成分研究專家講座第4頁第二節(jié)中藥開發(fā)新藥路徑

一、經驗積累

中藥研究離不開祖國醫(yī)學長久實踐所積累經驗，是尋找新藥極為主要源泉和基礎。古代，人類在尋找新藥漫長歷史中，在親身“嘗試”中不停積累各種藥品知識，即神農嘗百草方法。在中藥研究過程中，要重視經典文件調研，如依據中醫(yī)經驗和歷代醫(yī)書上記載中藥青蒿對“截瘧”有效。東晉葛洪著《肘后備急方》中記載，“青蒿一握，水二升漬，絞取汁盡服之”，說明青蒿中含有抗瘧有效成份，且加熱易破壞，故將青蒿低溫提取取得抗瘧有效成份青蒿素，用于抗瘧含有顯著特點，又經過構效關系研究合成了新衍生物，療效顯著提升，且水溶解性更強。文件是前人積累寶貴經驗，經過查閱文件了解近緣植物研究概況。只有了解前人成功經驗和方法，才能最大程度借鑒和利用前人經驗開展新研究十少走彎路，節(jié)約人力、物力和時間。

中藥有效成分研究專家講座第5頁二、偶然發(fā)覺

偶然發(fā)覺在新藥研究和發(fā)覺中是較常見，最經典例子是青霉素發(fā)覺，1928年，英國細菌學家弗萊明一次在研究葡萄球菌試驗中偶然發(fā)覺那次培養(yǎng)細菌有些菌落沒有生長，仔細觀察發(fā)覺，在這次試驗中，培養(yǎng)基被霉菌污染所致，以后從這種霉菌中發(fā)覺了能殺滅細菌物質青霉素，開辟了抗生素治療疾病新領域。

中藥有效成分研究專家講座第6頁三、藥品普篩

本世紀初，尤其是30年代以來，世界各國開展了在特定藥理模型基礎上篩選藥品工作，對各種中藥篩選，造成了許多新藥發(fā)覺。（一）藥品篩選有兩種方法：

1．分離純化得到純品化合物，然后再進行活性測試。優(yōu)點：(1)目標清楚，方法簡捷，指標明確，標準同一。(2)分得標準品后可進行各種藥理活性測試。缺點：(1)假如選擇分離方法不妥，活性化合物丟失可能性極大。(2)對于極微量活性化合物，這種方法很輕易漏檢。中藥有效成分研究專家講座第7頁2．在活性篩選方法指導下進行化合物分離提取(BioassayDirectedSeparation)。

在供試樣品活性確定以后，選取簡易、靈敏、可靠活性測試方法作指導；在分離每一階段對分離所得各個組分進行活性定量研究和評價，跟蹤其中活性部分。缺點：

(1)活性測試樣品及工作量均大大增加；(2)要求分離工作者與活性測試人員兩個方面配合。優(yōu)點：

(1)因為分離過程中，沒有化合物類型框框限制，只以活性為指標進行追蹤，故發(fā)覺新化合物可能性很大。(2)假如分離過程某一階段，如因分離方法或材料選擇不妥，造成活性化合物分解改變或流散時，還能快速查明原因，并可采取對應辦法進行補救。對天然活性化合物分離來說，這是一個很好方法。

中藥有效成分研究專家講座第8頁例：抑制前列腺素合成酶藥品篩選

中藥有效成分研究專家講座第9頁（二）追蹤分離中藥中天然活性化合物時注意事項

1．關鍵在于選擇、建立先進生物活性測試方法

天然活性化合物追蹤分離能否取得成功，關鍵在于有沒有好生物活性測試體系．試驗模型能夠有整體動物、器官、組織、細胞、酶或受體以及體內生物活性物質等。最近并已開始注意在基因調控水平上建立起新篩選體系。無疑，采取整體動物進行試驗與人比較相近，不過試驗費時費錢，現象復雜，加以動物個體差異以及病理模型難于建立等原因，作為指導分離過程活性篩選方法不太適宜。中藥有效成分研究專家講座第10頁當前在實際工作中多采取是那些靈敏、簡便、可用于微量樣品體外活性測試方法。其中，利用對酶、受體或體內生物活性物質抑制或促進作用，以及利用基因調控影響進行活性測試方法因為簡便易行又可定量，更是受到青睞，得到越來越廣泛應用。不過有時這種體外活性測試方法所得結果與藥品實際在體內作用并不平行，故實踐中也應給予注意。中藥有效成分研究專家講座第11頁

2．確保供試材料含有活性

這是追蹤分離活性化合物前提。為了確保活性成份分離工作在可靠基礎上進行，對供試中藥有時須采取多項指標、體內外進行測試加以確認。

例美國國立癌癥研究中心篩選抗腫瘤活性植物或動物粗提取物方法本方法優(yōu)點是：①活性低或含量少化合物不至于丟失②增加了檢出新化合物機會；③可能分離得到不一樣作用機制化合物中藥有效成分研究專家講座第12頁3.在眾多生物活性中力爭找出最本質作用

中藥在臨床治療上可能作用于多個靶點，因而含有各種療效，即表現出多方面活性。研究者應該力爭找出其中最本質作用，選擇建立反應臨床治療作用特點、且效果與之平行活性測試體系，才有可能追蹤分離出目標活性成份或甚至有效成份。以下表：

中藥有效成分研究專家講座第13頁

中藥名稱

生理活性活性篩選體系

目標活性物質

烏頭(Aconitumspp.)強心、利尿興奮、鎮(zhèn)痛Yagi-Hartung法（離體蛙心）

去甲基烏藥堿

（Higenamine)

烏頭堿類大黃（Rheumcoreanum及R.palmatum雜交種）健胃、緩瀉

致瀉活性(小鼠)番瀉苷(sennoside)

茵陳蒿(Artemisiacapillaris)利膽、抗炎

膽汁分泌促進作用

茵陳色原酮(capillarisin)等

貝(日本產)(Babyloniajaponica)口渴、視力減退、瞳孔散大、言語障礙、便秘

atropine定量法（小鼠散瞳率試驗)

surugatoxin軟紫草(Arnebiaeuchroma)止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2生合成抑制活性

arteriolearnibinone

arnebifuranoneshikonins類

中藥有效成分研究專家講座第14頁4．注意正確比較并判斷各個餾分活性

分離過程中總是按“等劑量不等強度標準”對每一階段得到餾分進行活性定量評定，并與母體作比較，追蹤活性最強餾分。普通，如與母體比較，所得幾個子體活性強弱參差不齊，則示活性分離與物質分離平行，預示可能得到良好分離效果；如某個子體活性顯著增強，則示分離過程中可能除去了某種拮抗作用物質；假如所得各個子體活性均顯著減弱，則提醒活性成份可能分解、流散、或因吸附劑發(fā)生不可逆吸附所致，或因該藥活性原本為多組分綜合作用(相加或相乘)，故分離后反而造成活性減弱或喪失。詳細問題宜作詳細分析，并在查明原因后采取對應對策處理。

分離過程中常配合采取各種分離伎倆以求取得良好分離效果，并應盡可能防止采取可能造成活性成份分解或不可逆吸附方法或試劑。中藥有效成分研究專家講座第15頁四、代謝研究

(1)藥品代謝研究結果又往往給新藥研究提供信息。

因為藥品體內過程不一樣，有些藥品轉化后，活性更高，有些轉化后則失活，從而能夠幫助我們提供新藥設計主要知識。(2)植物成份生物轉化，可為一些化合物結構修飾提供思緒，提供新奇先導化合物。中藥有效成分研究專家講座第16頁五、中藥中天然活性化合物化學修飾或結構改造

從中藥中篩選追蹤得到活性化合物只是一類創(chuàng)新藥品研究前期階段。不少天然活性化合物因為存在一些缺點而難以直接開發(fā)利用：(1)藥效不理想；(2)存在一定毒副作用；(3)含量太低，難以從天然原料中取材；(4)或因結構過于復雜，合成也十分困難；(5)水溶性差、生物利用度差等等所以，我們只能以它們?yōu)橄葘Щ衔?在經過一系列化學修飾或結構改造后，對得到衍生物進行定量構-效關系比較研究，才有可能發(fā)覺比較理想活性化合物，并開發(fā)成新藥。

中藥有效成分研究專家講座第17頁例：青蒿素構效關系研究

中藥有效成分研究專家講座第18頁六、其它領域研究

(1)在新藥研究中，深入開展藥品作用機制研究，也能為新藥發(fā)覺提供主要線索。(2)利用藥品毒副作用發(fā)覺新藥。中藥有效成分研究專家講座第19頁研究實例一紫杉醇發(fā)覺

1971年：提取分離，結構確定，活性確認1975-76年：在各種瘤株上試驗有效；1977年：臨床前研究；1979年：作用機理探明；1982年：Ⅰ期臨床試驗；1985-86年：Ⅱ期臨床試驗(卵巢癌)；1986年：紫杉醇側鏈全合成；1988年：紫杉醇半合成；1990-93年：側鏈合成方法改進；1992年：FDA同意；1994年：首次全合成。中藥有效成分研究專家講座第20頁中藥有效成分研究專家講座第21頁研究實例二喜樹堿發(fā)覺

中藥有效成分研究專家講座第22頁第三節(jié)中藥化學研究方法

一、在開展某一天中藥研究中，研究開始前，必須進行充分調查研究。這其中包含實地調查，資源調研和文件調研三個方面。

實地調查包含臨床療效考查和實際應用效果(民間使用情況)：(1)因為影響植物藥功效原因較多，在確定其功效基礎上第一步就是確定品種類別，因為植物或中藥同名異物和同物異名現象較多；植物科、屬不一樣，成份各異，藥效作用也有很大差異，品種判別、判定顯得尤為主要，假如品種沒有判別準確，試驗結果極難會有好重現性。(2)考查其生長環(huán)境，采收季節(jié)，加工與炮制方法等，這些原因都會影響藥品療效。同時，這些原因考查，還會為研究有效成份提取、分離方法提供參考。中藥有效成分研究專家講座第23頁資源調查

植物生長環(huán)境、資源分布、品種多少都是研究中藥要考慮原因。對于資源少植物藥材，在研究開始階段，就要考慮到怎樣處理資源缺乏問題。

文件調研

當確定了要研究對象后，相關該植物本身研究；相關近緣植物研究等都能夠經過文件調研得到處理，經過文件調研，能夠了解該植物中或其近緣植物中所含有化合物類別，研究方法，為接下來研究提供研究思緒和啟示。中藥有效成分研究專家講座第24頁二、植物化學成份預試

預試就是利用各類化學成份溶解特征、化學反應特征來初步判斷某類化學成份有沒有預備性試驗。植物中化學成份復雜，類型繁多，在研究植物有效成份時，不論是重復文件方法制備已知成份或是探索未知成份，在提取分離之前都應對樣品中所含成份及特征，存在狀態(tài)及數量有初步或者盡可能全方面了解，然后依據所含成份性質設計化合物提取與分離詳細方法。

預試驗結果能夠幫助我們選擇和建立合理檢驗方法，作為提取過程中對特定成份追蹤和向導。中藥有效成分研究專家講座第25頁化學成份預試方法有兩類:

一類為單項預試法，即依據工作需要有重點地從某植物中檢驗某一類成份。如水蒸氣蒸餾法直接檢驗揮發(fā)油類成份；用微量升華法檢驗葸醌類升華成份；利用強心苷特征反應和動物試驗檢驗植物中強心苷存在；利用皂苷發(fā)泡性和溶血性能檢驗皂苷存在。另一類方法為系統預試，系統預試目標在于盡可能詳盡而全方面檢驗植物中存在成份。中藥有效成分研究專家講座第26頁三、化學成份分離

1．部位分離即利用極性由小到大各種有機溶劑連續(xù)提取，將化學成份分為極性不一樣各個部位。

部位分離法有許各種，如Dragendoff提出石油醚、乙醚、氯仿、乙醇、水、酸性水、堿性水七部位法。刈米達夫提出石油醚、苯、醋酸乙酯、乙醇四部位法，Stahl提出石油醚、氯仿、乙醚、丙酮、甲醇五部位法。這些方法各有特點，但基本原理都是利用極性不一樣有機溶劑依次提取藥材并分成不一樣極性部位。因為使用溶劑系統不一樣，分離部位也有多有少。近年來，部位分離更多地采取石油醚(或苯)