分解尿素的細(xì)菌的分離

關(guān)于分解尿素的細(xì)菌的分離一、課題背景1、尿素的利用

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1、實例：啟示：尋找目的菌種時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因為熱泉溫度70～800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。㈠.篩選菌株第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。也就是用選擇性培養(yǎng)基篩選。第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②從用途看此培養(yǎng)基屬于哪類？③從化學(xué)成分看此培養(yǎng)基屬于哪類？選擇培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：③此培養(yǎng)基是否對微生物具有篩選作用？如果有，是如何進(jìn)行篩選的？有，此培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是判斷該培養(yǎng)基有選擇性實驗組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

結(jié)果只生長分解尿素細(xì)菌生長多種微生物是第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1.稀釋涂布平板法（活菌計數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細(xì)胞。⑵計算方法：每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。1.第一位同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為230。2.第二位同學(xué)在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為結(jié)果。

你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實值?你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實驗需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？分析：答：都不接近，都需要改進(jìn)。第一位同學(xué)需要設(shè)置重復(fù)實驗組。第二位同學(xué)統(tǒng)計的三個菌落數(shù)相差太大，說明操作有誤，需要重新實驗。第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)①為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度的稀釋液涂布到三個或三個以上的平板中培養(yǎng)。②為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計數(shù)，計算出菌落平均數(shù)③統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2、顯微鏡直接計數(shù)法：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天實例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106

倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤

(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))如何設(shè)計實驗證明呢？第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天二.實驗的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行[三]樣品的稀釋第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細(xì)菌104、105、106放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計數(shù)的平板第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？分析：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。1：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等?！羧绻玫搅?個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天微生物的培養(yǎng)與觀察第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天三.結(jié)果分析與評價P251.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.稀釋操作是否成功：如果得到了2個或2個以上的菌落數(shù)在30—300的平板，則說明稀釋操作成功。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)組的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確，要重新實驗。第26頁,共34頁，2024年2月25日，星期天四、操作提示

無菌操作

做好標(biāo)記

規(guī)劃時間

第27頁,共34頁，2024年2月25日，星期天五.課外延伸2、鑒定大腸桿菌的方法：在培養(yǎng)基中添加

培養(yǎng)該細(xì)菌，如果出現(xiàn)菌落呈現(xiàn)

，則說明有大腸桿菌。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入

指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變

，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。酚紅紅1、鑒定分解尿素的細(xì)菌的方法伊紅-美藍(lán)黑色且有金屬光澤第28頁,共34頁，2024年2月25日，星期天本課題知識小結(jié):第29頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓(xùn)練CD第30頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3.下列說法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC第31頁,共34頁，2024年2月25日，星期天5、下列敘述錯誤的是[]A．因為土壤中各類微生物的數(shù)量不同，所以為獲得不同類型的微生物，要按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行分離

B．測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同

C．只有得到了3個或3個以上菌落數(shù)目在30—300的平板，才說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計數(shù)

D．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些細(xì)菌菌落