PCR體系優(yōu)化資料

年4月19日PCR體系優(yōu)化文檔僅供參考由于TaqDNA聚合酶是當(dāng)前PCR反應(yīng)體系中應(yīng)用最廣泛的酶，因此此文主要討論使用該酶的PCR反應(yīng)體系。A鎂離子濃度鎂離子是熱穩(wěn)定DNA聚合酶的輔因子，其濃度對(duì)PCR至關(guān)重要。模板DNA的濃度，鰲合物（如EDTA和檸檬酸鹽）、dNTP濃度和蛋白都會(huì)影響反應(yīng)體系中游離鎂離子的量。如果游離的鎂離子含量不夠，那么TaqDNA聚合酶則無(wú)法行使功能(figure1)。過(guò)多的游離鎂離子則會(huì)降低酶的保真度，可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。因此，研究者應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)優(yōu)化每一反應(yīng)中鎂離子的濃度。能夠用一系列的鎂離子濃度梯度來(lái)驗(yàn)證，鎂離子濃度范圍為1~4mM，每次增加或降低0.5~1mM。擴(kuò)增產(chǎn)量最高，非特異性產(chǎn)物最低時(shí)的鎂離子濃度即為最優(yōu)。最優(yōu)鎂離子的濃度范圍跟DNA聚合酶的類(lèi)型相關(guān)，例如，PfuDNA聚合酶似乎對(duì)鎂離子的依賴(lài)性更低，但其優(yōu)化范圍一般為2~6mM。許多DNA聚合酶產(chǎn)品提供Mg-freereactionbuffer和單獨(dú)一管25mMMgCl2，這樣就能夠自行調(diào)節(jié)Mg2+濃度，優(yōu)化反應(yīng)體系。MgCl2溶液在重復(fù)凍融后會(huì)出現(xiàn)濃度分層，為獲得均一的溶液，在配液的時(shí)候，要確保MgCl2溶液完全溶解并充分震蕩混勻。非常簡(jiǎn)單的兩步，溶解和混勻，常常會(huì)造成實(shí)驗(yàn)失敗。有些科學(xué)家傾向于使用包含MgCl2的buffer，MgCl2的終濃度為1.5mM。值得注意的是有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)使用此類(lèi)buffer的結(jié)果并不穩(wěn)定，有時(shí)體系內(nèi)游離鎂離子的濃度會(huì)有0.6mM的變化，如果在90℃加熱10min，則結(jié)果趨于穩(wěn)定，因此作者假設(shè)重復(fù)凍融的buffer中MgCl2可能會(huì)有沉淀現(xiàn)象發(fā)生。Figure1.鎂離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。用不同濃度Mg2+測(cè)試，產(chǎn)物大小為1.8kb瓊脂糖凝膠電泳，EB染色泳道M為MAKER;Lane1,0mMMg2+;Lane2,0.5mMMg2+;Lane3,1mMMg2+;Lane4,1.5mMMg2+;Lane5,2mMMg2+;Lane6,2.5mMMg2+;Lane7,3mMMg2+andLane8,3.5mMMg2+BBuffer緩沖液大多數(shù)Buffer里含有一種緩沖試劑，多數(shù)為基于Tris的緩試劑。另外還有鹽類(lèi)，一般為KCL。緩沖試劑調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，pH值會(huì)影響DNA聚合酶的活性和保真度。與不添加KCL的比，適量的KCL能夠增加50~60%DNA聚合酶的活性。一般來(lái)說(shuō)，KCL濃度為50mM。C酶濃度我們推薦（promega的科研人員）在50微升體系中使用1-1.25unitsTaqDNA聚合酶。多數(shù)情況下，這些酶是過(guò)量的，再添加酶并不能顯著提高產(chǎn)物量。事實(shí)上，酶量不斷升高會(huì)增加TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性，跑膠的時(shí)候會(huì)觀察到彌散的條帶。想要準(zhǔn)確吸取少量的含50%甘油的酶溶液是非常困難的，因此建議一次配置大量的預(yù)混液，這樣酶的加量便會(huì)很大，減少誤差。DPCR引物設(shè)計(jì)引物決定擴(kuò)增區(qū)域和擴(kuò)增子的大小，引物長(zhǎng)度一般在15~30bp。理想狀態(tài)下的引物其GC含量應(yīng)該在40~60%，避免在引物3’端出現(xiàn)三個(gè)連續(xù)的G或C以減少非特異性結(jié)合。還要避免自身或者引物間互補(bǔ)，以降低引物二聚體。引物自身二級(jí)機(jī)構(gòu)干擾退火時(shí)引物與模板的結(jié)合。正反向兩條引物之間Tm值相差不超過(guò)5℃，以便兩條引物在同一退火溫度下?lián)碛邢嗨频臄U(kuò)增效率。能夠在引物上添加其它用途的序列，比如在5’端添加酶切位點(diǎn)序列，方便下一步的克隆，或者添加T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，以便進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。實(shí)際應(yīng)用中會(huì)發(fā)現(xiàn)不同軟件給出的Tm值不同，同一軟件不同參數(shù)得出的Tm值也不同。不必糾結(jié)于此，只需要使用同一個(gè)軟件統(tǒng)一參數(shù)去評(píng)估一個(gè)項(xiàng)目中所用的引物就好，Tm值只是一個(gè)相正確標(biāo)準(zhǔn)，不論哪種軟件只要你的所有引物都在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體系內(nèi)評(píng)定，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分析。就好比你帶兩塊表反而不知道具體時(shí)間，只需要有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參考體系即可。E模板質(zhì)量擴(kuò)增依賴(lài)DNA模板的數(shù)量和質(zhì)量。核酸純化過(guò)程中經(jīng)常使用的試劑（鹽類(lèi)、胍、蛋白酶、有機(jī)溶液和SDS）是潛在的DNA聚合酶抑制劑。例如0.01%SDS會(huì)導(dǎo)致90%TaqDNA聚合酶活性被抑制，而0.1%SDS則會(huì)抑制99.9%的TaqDNA聚合酶活性。其它PCR抑制劑有苯酚、肝素、二甲苯藍(lán)、溴酚藍(lán)、植物多糖和多胺類(lèi)物質(zhì)精胺和亞精胺。有些情況下，抑制劑并不是隨著核酸模板進(jìn)入反應(yīng)體系內(nèi)的，例如紫外照射下的聚苯乙烯和聚丙烯會(huì)釋放抑制物，如果使用此類(lèi)物質(zhì)作為反應(yīng)管，有可能干擾PCR。如果你覺(jué)得擴(kuò)增失敗是由于模板溶液中存在抑制劑，那么向反應(yīng)液中再加入以前擴(kuò)的很好的對(duì)照DNA模板和引物對(duì)，如果擴(kuò)增效果變差，那可能就有干擾物質(zhì)，清理DNA模板，重點(diǎn)檢查苯酚、氯仿和乙醇等。F模板量擴(kuò)增所需的模板量依賴(lài)于DNA樣本的復(fù)雜性。例如，4kb的質(zhì)粒含1kb的目的序列，那么靶序列的含量就是25%。相反如果1kb的目的序列存在于人基因組中（3.3×109bp），那么靶序列的含量就是0.00003%。一般常犯的錯(cuò)誤就是使用太多的質(zhì)粒DNA，太多的PCR產(chǎn)物或太少的基因組DNA作為模板。加太少模板擴(kuò)增產(chǎn)物極少，而加太多模板則會(huì)造成非特異性擴(kuò)增過(guò)多。在使用PCR產(chǎn)物作為模板的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)稀釋10至10000倍然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1μgofhumangenomicDNA=3.04×105moleculesG循環(huán)參數(shù)退火溫度和延伸時(shí)間是經(jīng)常需要改動(dòng)的兩個(gè)參數(shù)。其它步驟的時(shí)長(zhǎng)和溫度一般變化不大。可是在個(gè)別情況下，循環(huán)過(guò)程中的變性溫度會(huì)降低，時(shí)間會(huì)減少，以減低脫嘌呤作用（脫嘌呤作用可因此產(chǎn)物突變）。退火溫度一般設(shè)在引物Tm值5℃左右，使用比引物Tm值稍高的退火溫度能夠提高特異性，減少非特異擴(kuò)增?？墒禽^低的退火溫度會(huì)增加擴(kuò)增產(chǎn)物的量，因?yàn)橐镌谳^低溫度下更能有效退火。建議以低于引物5℃的Tm值為退火溫度，逐漸升高以找到最優(yōu)退火溫度。熱啟動(dòng)酶在一定程度上能夠減少非特異擴(kuò)增和引物二聚體。延伸時(shí)間要根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來(lái)優(yōu)化，一般情況下1min擴(kuò)增1kb。時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)容易增加5′→3′外切酶活性，造成條帶彌散。HPCR促進(jìn)劑和添加劑PCR促進(jìn)劑能夠增加目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增量，減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增量。現(xiàn)有許多作用機(jī)理各不相同的PCR促進(jìn)劑，這些促進(jìn)劑并不會(huì)對(duì)所有PCR反應(yīng)有促進(jìn)作用。模板和引物不同，促進(jìn)劑的效用也不盡相同，因此需要經(jīng)過(guò)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。以下討論常見(jiàn)的促進(jìn)劑：甜菜堿、DMSO和甲酰胺能夠促進(jìn)高GC含量模板的擴(kuò)增。高GC模板一般會(huì)形成較強(qiáng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶擴(kuò)增停止，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。高GC模板之因此會(huì)成為一個(gè)難點(diǎn)是因?yàn)槠鋬蓷l鏈不容易分離，分離后又很容易結(jié)合。而高GC含量引物會(huì)在分子間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，與模板結(jié)合過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)。甜菜堿能夠減少模板解鏈所需能量。DMSO和甲酰胺作用相似，都是干擾兩條單鏈DNA間氫鍵的形成，阻止模板兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合。如果擴(kuò)增效率很差，添加適量的促進(jìn)劑能夠增加擴(kuò)增產(chǎn)物量，促進(jìn)劑的加量范圍為：甜菜堿（1M）、1—10%DMSO/甲酰胺。DMSO含量超過(guò)10%，或甲酰胺含量超過(guò)5%則會(huì)抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些情況下，通用添加穩(wěn)定劑如BSA（0.1mg/ml），明膠（0.1-1.0%）和非離子型去垢劑（0-0.5%）能夠解決擴(kuò)增失敗的問(wèn)題。這些穩(wěn)定劑能夠增加DNA聚合酶的穩(wěn)定性，減少管壁吸附造成的試劑損失。BSA還能幫助克服黑色素對(duì)反應(yīng)的抑制。非離子型去垢劑如Tween-20，NP-40和TritonX-100能夠克服反應(yīng)體系中殘留的痕量離子型去垢劑（如0.01%SDS）對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用。銨離子能偶增加擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)非優(yōu)條件的耐受性，因此一些PCR反應(yīng)試劑中包含10-20mM(NH4)2SO4。其它PCR促進(jìn)劑有甘油（5-20%），聚乙二醇（5-15%）和氯化四甲基銨（60mM）I核酸交叉污染盡可能的降低核酸在實(shí)驗(yàn)間的交叉污染相當(dāng)重要。要對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所進(jìn)行分區(qū)，并在每一區(qū)配備專(zhuān)屬移液器等器材。使用低吸附槍頭或項(xiàng)目專(zhuān)用移液槍也能減少交叉污染。異補(bǔ)骨脂素，一種光敏交聯(lián)試劑，能夠嵌入DNA雙鏈，可阻止DNA雙鏈變性和復(fù)制。因此預(yù)先用異補(bǔ)骨脂素處理PCR試劑，可有效防止試劑中存在的污染雙鏈DNA在PCR過(guò)程中變性，只能擴(kuò)增添加的未經(jīng)過(guò)異補(bǔ)骨脂素處理的樣本DNA。尿苷酶(UNG)，一種DNA修復(fù)酶，能夠把尿嘧啶從核糖上水解下來(lái)。利用其這一特性，在PCR體系中使用尿嘧啶（dUTP）代替胸腺嘧啶dTTP，那么擴(kuò)增產(chǎn)物中便包含dUTP。在反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)NG，運(yùn)行PCR程序的時(shí)候（一般在PCR反應(yīng)程序前加入10min37℃的預(yù)處理，來(lái)使UNG發(fā)揮作用），UNG將會(huì)切割體系內(nèi)混入的含dUTP的擴(kuò)增產(chǎn)物，阻止其擴(kuò)增，以達(dá)到降低污染的目的。有校正功能的聚合酶如果使用dUTP效率將會(huì)降低（高保真酶），而沒(méi)有校正功能的聚合酶在含有dUTP的體系內(nèi)能夠穩(wěn)定擴(kuò)增（比如Taq酶）。使用dUTP對(duì)EB染色和電泳遷移率無(wú)顯著影響（很多公司有含UNG的Taqman探針?lè)磻?yīng)體系，dUTP對(duì)Taqman探針應(yīng)該無(wú)顯著影響，需查文獻(xiàn)）。UNG處理還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是它能夠處理單鏈DNA也能夠處理雙鏈DNA。減少錯(cuò)誤的最佳方法永遠(yuǎn)是規(guī)范化的操作。污染也是如此，規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室操作會(huì)盡可能的降低污染的可能性。有兩方面需要注意，一是加樣的時(shí)候，一定要左手拿離心管，右手去開(kāi)蓋，而且動(dòng)作要慢穩(wěn)，避免管內(nèi)液體飛濺；二是廢棄槍頭一定要打入含水的垃圾袋內(nèi)，實(shí)驗(yàn)操作完成后，盡快密封垃圾袋，并丟棄到垃圾桶內(nèi)。工作臺(tái)的整潔直接體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)操作人員的專(zhuān)業(yè)素養(yǎng)，關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的成敗。請(qǐng)?jiān)诿看螌?shí)驗(yàn)操作完成后認(rèn)真整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)。規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化的操作可能