WST 798-2022 消毒劑消毒效果定性試驗標準 應(yīng)用稀釋法-PDF解密

ICS11.080CCSC59WS中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準Qualitativetestingstandardondisinfectioneffectofdisinfectant——usediluti中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布IWS/T798—2022前言 II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試驗材料 15染菌載體的制備 26中和劑鑒定試驗 37殺菌試驗 58結(jié)果判定 59注意事項 6附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑 7WS/T798—2022本標準由國家衛(wèi)生健康標準委員會消毒標準專業(yè)委員會負責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢，由中國疾病預(yù)防控制中心負責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查，由國家衛(wèi)生健康委綜合監(jiān)督局負責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負責(zé)統(tǒng)籌管理。本標準起草單位：北京市疾病預(yù)防控制中心、中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所、中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心。1WS/T798—2022消毒劑消毒效果定性試驗標準應(yīng)用稀釋法本標準規(guī)定了消毒劑消毒效果定性試驗應(yīng)用稀釋法的試驗材料、染菌載體的制備、中和劑鑒定試驗、殺菌試驗、結(jié)果判定和注意事項。本標準適用于消毒劑對光滑硬質(zhì)物體表面的實驗室定性消毒效果評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。WS/T683消毒試驗用微生物要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1應(yīng)用稀釋法usedilutionmethod采用定性方法評價消毒劑對不銹鋼圓筒載體上試驗微生物殺滅效果的檢測方法。4試驗材料4.1試驗微生物4.1.1金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為細菌繁殖體中化膿性球菌的代表，試驗菌種為ATCC6538。4.1.2銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為醫(yī)院感染中常見分離的細菌繁殖體的代表，試驗菌種為ATCC15442。4.1.3腸炎沙門菌(Salmonellaenterica)，試驗菌種為ATCC10708。4.2培養(yǎng)基4.2.1傳代培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯或合成肉湯培養(yǎng)基，用于細菌傳代培養(yǎng)，見附錄A。4.2.2中和試驗培養(yǎng)基4.2.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)液：營養(yǎng)肉湯或液體硫乙醇培養(yǎng)基，作為中和試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，見附錄A。2WS/T798—20224.2.2.2中和劑培養(yǎng)液：根據(jù)消毒劑有效成分選擇相應(yīng)中和劑加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基液中制備成為中和劑培養(yǎng)液，中和劑培養(yǎng)液需經(jīng)中和劑鑒定試驗驗證合格后方可使用。4.2.3其他培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），用于染菌載體的菌落計數(shù)，見附錄A.5。4.3其他試劑和材料4.3.1磷酸鹽緩沖液(見附錄A.6)。4.3.2標準硬水(見附錄A.7)。4.3.3有機干擾物：采用3%牛血清白蛋白；如為清潔物品采用0.3%牛血清白蛋白。4.3.4載體：304不銹鋼圓筒，表面拋光，外徑8mm±1mm，內(nèi)徑6mm±1mm，壁厚1mm±0.5mm，長度10mm±1mm。4.3.5吊鉤：長度為50mm～75mm，直徑為0.5mm的鎳鉻合金絲，末端3mm呈直角彎曲。4.3.6濾紙：直徑為90mm的定性濾紙。4.3.7器皿：25mm×100mm玻璃試管，直徑為90mm的平皿，10mL吸管，移液器等。4.4儀器設(shè)備Ⅱ級及以上生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、計時器等。5染菌載體的制備5.1載體準備5.1.1外觀檢查載體經(jīng)肉眼觀察合格，方可使用。如有可見破損如鈍化、缺口、凹陷或鑿孔等應(yīng)剔除。5.1.2清洗將載體置于1mol/LNaOH溶液中浸泡約12h，用去離子水反復(fù)沖洗3次～4次，收集沖洗水加入2滴~3滴1%酚酞溶液，如酚酞變?yōu)榉奂t色，表明有NaOH殘留，需要繼續(xù)沖洗至酚酞不變色，將載體晾干后密閉保存。5.1.3篩選測試5.1.3.1測試要求未使用過或使用過但試驗中無菌生長的載體，不需進行篩測試，經(jīng)壓力蒸汽滅菌后可使用。使用過的載體且在試驗中有菌生長，應(yīng)進行篩選測試，測試合格方可使用。5.1.3.2測試方法按照7.1規(guī)定，在無有機干擾物條件下，選用500mg/L苯扎氯銨消毒液對銅綠假單胞菌消毒作用10min，以Letheen肉湯作為中和劑培養(yǎng)液，對每個載體進行殺菌試驗。5.1.3.3測試結(jié)果判斷無菌生長為載體篩選測試合格，測試管中有菌生長，則該載體不合格。3WS/T798—20225.1.4滅菌載體染菌前，將清洗后的載體放入試管中，加入去離子水至載體完全浸沒，經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，冷卻至室溫備用。5.2菌懸液的制備5.2.1參照WS/T683的規(guī)定復(fù)蘇菌種，接種于含10mL營養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃,200r/min±20r/min振蕩培養(yǎng)24h±2h，此為第1代培養(yǎng)物。5.2.2用移液器取第1代培養(yǎng)物10μL轉(zhuǎn)種于含10mL營養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃,200r/min±20r/min振蕩培養(yǎng)24h±2h，此為第2代培養(yǎng)物，可繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第5代。5.2.3用移液器取第1～5代的24h新鮮培養(yǎng)物10μL轉(zhuǎn)種于10個含10mL營養(yǎng)肉湯或合成肉湯的試管中，經(jīng)36℃±1℃靜置培養(yǎng)48h～56h后備用。5.2.4銅綠假單胞菌培養(yǎng)物應(yīng)去除培養(yǎng)菌液表面的菌膜，或使用10mL吸管直接從溶液中部吸取菌液，放入另一個試管中。不可使用含菌膜的菌懸液進行試驗。5.2.5將金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌和去除菌膜的銅綠假單胞菌培養(yǎng)菌液用電動混勻器振蕩混合20s，室溫靜置10min后，用10mL吸管吸取上層四分之三的菌液轉(zhuǎn)移至新的試管中混勻，以去除細菌碎片和團塊，菌懸液于4℃冷藏保存?zhèn)溆?，?0min內(nèi)使用。5.2.6根據(jù)消毒劑的檢測要求，按照WS/T683的規(guī)定加入有機干擾物。5.3載體染菌5.3.1每次試驗時取80個無菌載體染菌，首先向4個無菌試管（25mm×100mm）中分別加入20mL制備好的菌懸液，依次向每管菌液中加入20個干燥無菌載體，確保載體完全浸沒于菌液中，持續(xù)15min±2min。5.3.2用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余菌液，垂直放置于無菌的雙層濾紙上，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)干燥40min±2min后，于2h內(nèi)進行試驗。5.4染菌載體菌落計數(shù)5.4.1隨機挑選2個染菌載體，分別放入2個含10mL營養(yǎng)肉湯的50mL離心管中，用電動混勻器劇烈振蕩混勻20s進行洗脫，使用磷酸鹽緩沖溶液進行10倍系列稀釋。5.4.2選擇適宜的稀釋度,吸取1mL加入無菌平皿中，將冷卻至40℃~45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于平皿中，平行接種于2個平皿，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h后進行菌落計數(shù)。5.4.3每個染菌載體上金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的回收菌量為1.0×106CFU/載體～1.0×107CFU/載體，腸炎沙門菌的回收菌量為1.0×105CFU/載體～1.0×106CFU/載體。6中和劑鑒定試驗6.1試驗原則通過中和劑鑒定試驗結(jié)果，判斷所選中和方法對消毒劑是否有效中和。若中和Ⅰ組顯示可有效中和，則僅使用中和劑培養(yǎng)液進行中和。若中和Ⅰ組結(jié)果顯示未完全中和，而中和Ⅱ組為有效中和，則在選用中和劑培養(yǎng)液進行中和的基礎(chǔ)上，再使用培養(yǎng)液進行二次中和。如仍顯示未完全中和，則繼續(xù)進行中和Ⅱ組試驗。試驗重復(fù)三次。6.2菌懸液的稀釋4WS/T798—20226.2.1取1mL制備好的菌懸液加入9mL磷酸鹽緩沖溶液中進行10倍梯度稀釋，取4個稀釋梯度（舉例：10-4、10-5、10-6和10-7）進行中和試驗。6.2.2同時取4個稀釋梯度各1.0mL采用傾注法接種于TSA平板中，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h后，進行菌落計數(shù)。6.3中和Ⅰ組6.3.1試驗中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。6.3.2選取4個無菌載體加入10mL消毒劑溶液中，作用至規(guī)定時間后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余消毒液，分別轉(zhuǎn)移至4管含有10mL中和劑培養(yǎng)液的試管中。6.3.3向上述4管中和劑培養(yǎng)液中分別接種0.1mL4個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。6.4中和Ⅱ組6.4.1重復(fù)6.3.1和6.3.2，載體在中和劑培養(yǎng)液中室溫靜置30min后，用滅菌后的吊鉤取出載體，輕觸管壁去除多余液體，分別轉(zhuǎn)移至4管含10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液的試管中。6.4.2向上述4管培養(yǎng)液中分別接種0.1mL4個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。6.5陽性對照未暴露于消毒劑的中和劑培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液各4管，分別接種0.1mL4個稀釋梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h，作為陽性對照。6.6陰性對照中和劑培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液各1管加入無菌載體，不接種菌液，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h，作為陰性對照。6.7結(jié)果判定6.7.1菌懸液濃度菌懸液計數(shù)最后兩個稀釋梯度（如10-6和10-7至少有一個稀釋梯度的菌懸液的數(shù)量在5CFU/mL~100CFU/mL范圍內(nèi)。6.7.2陽性對照基礎(chǔ)培養(yǎng)液管有菌生長表明試驗菌、培養(yǎng)液性能良好，中和劑培養(yǎng)液管有菌生長表明中和劑對試驗菌生長無明顯影響。6.7.3陰性對照應(yīng)無菌生長。6.7.4中和Ⅰ組接種菌量較低（5CFU/mL～100CFU/mL）的中和劑培養(yǎng)液管中有菌生長，認定為中和劑可有效中和消毒劑，且中和產(chǎn)物對試驗菌生長無明顯影響。若無菌生長或僅在接種高濃度菌液的試管中生長表明未完全中和，或中和產(chǎn)物有抑菌作用，需進行中和II組試驗。5WS/T798—20226.7.5中和Ⅱ組接種菌量較低（5CFU/mL～100CFU/mL）的培養(yǎng)液中有菌生長認為中和有效。7殺菌試驗7.1試驗步驟7.1.1用標準硬水配制消毒劑溶液至作用濃度，以每管10mL分裝至60個無菌試管（25mm×100mm）中，置于20℃±1℃水浴中平衡10min。7.1.2用滅菌后的吊鉤以20s±5s間隔依次向每管消毒液中加入一個染菌載體，加入過程中勿觸碰管壁，輕柔振蕩2～3下后放入于20℃±1℃水浴中。7.1.3消毒作用至規(guī)定時間后，用滅菌后的吊鉤依次鉤取染菌載體，輕觸管壁去除多余消毒液，轉(zhuǎn)移至10mL中和劑培養(yǎng)液管中，加入時勿觸碰管壁。7.1.4振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.1.5若中和劑鑒定試驗結(jié)果顯示中和I組未完全中和，在中和劑培養(yǎng)液中靜置30min后用滅菌后的吊鉤將染菌載體取出后，轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)培養(yǎng)液管中，振蕩混勻后進行培養(yǎng)。7.2陽性對照將未經(jīng)消毒處理的染菌載體2個，分別放入10mL中和劑培養(yǎng)液和10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液管中振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.3陰性對照將無菌載體2個分別放入10mL中和劑培養(yǎng)液和10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液中振蕩混勻，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h±2h。7.4試驗次數(shù)試驗重復(fù)三次。8結(jié)果判定陽性對照管應(yīng)有菌生長，陰性對照管應(yīng)無菌生長。消毒劑標注的消毒對象為光滑硬質(zhì)物體表面時，對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的三次重復(fù)殺滅效果均應(yīng)達到表1的要求，即金黃色葡萄球菌的殺滅試驗，陽性管數(shù)為0～3個，且陽性對照菌量對數(shù)值為6～7時，判定為合格，銅綠假單胞菌的殺滅試驗，陽性管數(shù)為0～6個，且陽性對照菌量對數(shù)值為6～7時，判定為合格。表1消毒劑應(yīng)用稀釋法對微生物殺滅效果的判定6WS/T798—2022滅試驗，也應(yīng)符合陽性管數(shù)為0～1個，且陽性對照菌量9注意事項9.1金黃色葡萄球菌在試驗中可使用營養(yǎng)肉湯或液體硫乙醇培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，Letheen肉湯對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。9.2同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，應(yīng)按微生物種類分別進行中和劑鑒定試驗。9.3染菌載體轉(zhuǎn)移至消毒劑管時應(yīng)避免觸碰管壁，嚴格無菌操作，操作中產(chǎn)生的微生物氣溶膠可能導(dǎo)致測試管假陽性。9.4在結(jié)果判定時，如培養(yǎng)液未出現(xiàn)混濁，但發(fā)生顏色變化或出現(xiàn)膜狀物，應(yīng)與陽性對照對比來判定結(jié)果，并進行細菌的分離鑒定。9.5殺菌試驗中試驗組有菌生長時，可隨機挑選陽性管進行鑒定，以排除污染。7WS/T798—2022（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水加至5.0g5.0g1000mL以上各成分蒸餾水溶解，調(diào)pH至7.2～7.4，于121℃壓力蒸汽滅菌20min備用。A.2合成肉湯培養(yǎng)基L-胱氨酸0.05gDL-蛋氨酸0.37gL-精氨酸0.40gDL-組氨酸0.30gL-賴氨酸0.85gL-酪氨酸0.21gDL-蘇氨酸0.50gDL-纈氨酸L-亮氨酸0.80gDL-異亮氨酸0.44g氨基乙酸0.06gDL-絲氨酸0.61gDL-丙氨酸0.43gL-谷氨酸L-天冬氨酸0.45gDL-苯丙氨酸0.26gDL-色氨酸0.05g8WS/T798—2022L-脯氨酸0.05g氯化鈉3.00g氯化鉀0.20g硫酸鎂0.05g磷酸二氫鉀1.50g磷酸氫二鈉4.00g鹽酸硫胺素0.01g煙酰胺0.01g蒸餾水加至1000mL以上各成分蒸餾水溶解，調(diào)pH至6.9～7.3，于121℃壓力蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫后，加入0.1mL無菌10%葡萄糖溶液備用。A.3液體硫乙醇培養(yǎng)基酪蛋白胨15.0g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g硫乙醇酸鈉0.5gL-胱氨酸