沙門氏菌的檢測鑒定

第第頁沙門氏菌的檢測鑒定沙門氏菌的檢測及鑒定

楊淑霞

設(shè)備和材料除微生物試驗室常規(guī)滅菌及培育設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2℃~5℃。2.2恒溫培育箱：36℃1℃,42℃1℃。2.3均質(zhì)器。2.4振蕩器。2.5電子天平：感量0.1g。2.6無菌錐形瓶:容量500mL,250mL。2.7無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。2.8無菌培育皿：直徑90mm。2.9無菌試管：3mm50mm、10mm75mm。2.10無菌毛細管。2.11pH計或pH比色管或精密pH試紙。2.12全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。

3培育基和試劑3.1緩沖蛋白胨水(BPW)。3.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液。3.3亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液。3.4亞硫酸鉍(BS)瓊脂。3.5HE瓊脂：見附錄A中A.5。3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽(*LD)瓊脂。3.7沙門氏菌屬顯色培育基。3.8三糖鐵(TSI)瓊脂。3.9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑。3.10尿素瓊脂(pH7.2)。3.11氰化鉀(KCN)培育基。3.12賴氨酸脫羧酶試驗培育基。3.13糖發(fā)酵管。3.14鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培育基。3.15半固體瓊脂。3.16丙二酸鈉培育基。3.17沙門氏菌O和H診斷血清。3.18生化鑒定試劑盒。

A.1緩沖蛋白胨水(BPW)A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mLpH7.20.2A.1.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪混勻稱，靜置約10min,煮沸溶解，調(diào)整pH,高壓滅菌121℃,15min。

A.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液A.2.1基礎(chǔ)液蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化鈉3.0g、碳酸鈣45.0g、蒸餾水1000mL、pH7.00.2除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)整pH,高壓滅菌121℃,20min。A.2.2硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉(含5個結(jié)晶水)50.0g,餾水加至100mL,高壓滅菌121℃,20min。A.2.3碘溶液碘片20.0g、碘化鉀25.0g、蒸餾水加至100mL,將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶蓋備用。A.2.40.5%煌綠水溶液煌綠0.5g、蒸餾水100mL溶解后，存放暗處，不少于1d,使其自然滅菌。A.2.5牛膽鹽溶液牛膽鹽10.0g,蒸餾水100mL加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121℃,20min。A.2.6制法基礎(chǔ)液900mL、硫代硫酸鈉溶液100mL、碘溶液20.0mL、煌綠水溶液2.0mL牛膽鹽溶液50.0mL臨用前，按上列順次，以無菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖勻后再加入另一種成分。

A.3亞硒酸鹽胱氨酸(SC

)增菌液A.3.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0gL-胱氨酸0.01g蒸餾水1000mLpH7.00.2A.3.2制法除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(稱取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL,使溶解，再加無菌蒸餾水至100mL即成，如為DL胱氨酸，用量應(yīng)加倍)。搖勻，調(diào)整pH。

A.4亞硫酸鉍(BS)瓊脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4.0g煌綠0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL檸檬酸鉍銨2.0g亞硫酸鈉6.0g瓊脂18.0g~20g蒸餾水1000mLpH7.50.2注：本培育基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避開降低其選擇性，貯于室溫暗處，超過48h會降低其選擇性，本培育基宜于當天制備，第二天運用。

A.4.2制法將前三種成分加入300mL蒸餾水(制作基礎(chǔ)液),硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。然后分別攪拌勻稱，煮沸溶解。冷至80℃左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)整pH,隨即傾入瓊脂液中，混合勻稱，冷至50℃~55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后馬上傾注平皿。

注：本培育基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避開降低其選擇性，貯于室溫暗處，超過48h會降低其選擇性，本培育基宜于當天制備，第二天運用。

A.5HE瓊脂(HektoenEntericAgar)A.5.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水楊素2.0g膽鹽20.0g氯化鈉5.0g瓊脂18.0g~20.0g蒸餾水1000mL0.4%溴麝香草酚藍溶液16.0mLAndrade指示劑20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mLpH7.50.2

A.5.2制法將前面七種成分溶解于400mL蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液;將瓊脂加入于600mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌勻稱，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi),調(diào)整pH。再加入指示劑,并與瓊脂液合并,待冷至50℃~55℃傾注平皿。注:①本培育基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避開降低其選擇性。②甲液的配制硫代硫酸鈉34.0g檸檬酸鐵銨4.0g蒸餾水100mL③乙液的配制去氧膽酸鈉10.0g蒸餾水100mL④Andrade指示劑酸性復(fù)紅0.5g1mol/L氫氧化鈉溶液16.0mL蒸餾水100mL將復(fù)紅溶解于蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復(fù)紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1mL~2mL。

6、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(*LD)瓊脂A.6.1成分酵母膏3.0gL-賴氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗

糖7.5g去氧膽酸鈉2.5g檸檬酸鐵銨0.8g硫代硫酸鈉6.8g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g酚紅0.08g蒸餾水1000mLpH7.40.2A.6.2制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)整pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合勻稱后，再加入指示劑，待冷至50℃~55℃傾注平皿。注:本培育基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避開降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培育基宜于當天制備，第二天運用。

A.7三糖鐵(TSI)瓊脂A.7.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵銨(含6個結(jié)晶水)0.2g酚紅0.025g或5.0g/L溶液5.0mL氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12.0g蒸餾水1000mLpH7.40.2A.7.2制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)整pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合勻稱后，再加入指示劑，混勻，分裝試管，每管約2mL~4mL,高壓滅菌121℃10min或115℃15min,滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。

A.8蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑A.8.1蛋白胨水蛋白胨(或胰蛋白胨)20.0g氯化鈉5.0g蒸餾水1000mLpH7.40.2將上述成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)整pH,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min。A.8.2靛基質(zhì)試劑A.8.2.1柯凡克試劑：將5g對二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25mL。A.8.2.2歐-波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20mL。A.8.3試驗方法

挑取小量培育物接種,在36℃1℃培育1d~2d,須要時可培育4d~5d。加入柯凡克試劑約0.5mL,輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐波試劑約0.5mL,沿管壁流下，掩蓋于培育液表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可運用。

9尿素瓊脂(pH7.2)A.9.1成分蛋白胨1.0g氯化鈉5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氫鉀2.0g0.4%酚紅3.0mL瓊脂20.0g蒸餾水1000mL20%尿素溶液100mLpH7.20.2A.9.2制法除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)整pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合勻稱后，再加入指示劑后分裝，121℃高壓滅菌15min。冷至50℃~55℃,加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%。分裝于無菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆?。A.9.3試驗方法挑取瓊脂培育物接種,在36℃1℃培育24h,觀測結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培育基變?yōu)榧t色。

.10氰化鉀(KCN)培育基A.10.1成分蛋白胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸二

氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g蒸餾水1000mL0.5%氰化鉀20.0mLA.10.2制法將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121℃高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100mL培育基加入0.5%氰化鉀溶液2.0mL(最末濃度為1:10000),分裝于無菌試管內(nèi),每管約4mL,立即用無菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內(nèi),至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培育基作為對比培育基,分裝試管備用。A.10.3試驗方法將瓊脂培育物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀(KCN)培育基。并另挑取1環(huán)接種于對比培育基。在36℃1℃培育1d~2d,觀測結(jié)果。如有細菌生長即為陽性(不抑制),經(jīng)2d細菌不生長為陰性(抑制)。注:氰化鉀是劇毒藥,運用時應(yīng)當心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培育基應(yīng)在冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要緣由是封口不嚴,氰化鉀漸漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應(yīng)。試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別留意。

A.11賴氨酸脫羧酶試驗培育基A.11.1成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸餾水1000mL1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mLL-賴氨酸或DL-賴氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mLpH6.80.2A.11.2制法除賴氨酸以外的成分加熱溶解后,分裝每瓶100mL,分別加入賴氨酸。L-賴氨酸按0.5%加入，DL-賴氨酸按1%加入。調(diào)整pH。對比培育基不加賴氨酸。分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL,上面滴加一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。

A.11.3試驗方法從瓊脂斜面上挑取培育物接種，于36℃1℃培育18h~24h,觀測結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培育基應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對比管應(yīng)為黃色。

A.12糖發(fā)酵管A.12.1成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉(含12個結(jié)晶水)2.0g0.2%溴麝香草酚藍溶液12.0mL蒸餾水1000mLpH7.40.2A.12.2制法A.12.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成安排好后，調(diào)整pH。按0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。A.12.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按上述成安排好后,分裝每瓶100mL,121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培育基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純,加熱后會自行水解者，應(yīng)采納過濾法除菌。A.12.3試驗方法:從瓊脂斜面上挑取小量培育物接種，于36℃1℃培育,一般2d~3d。遲緩反應(yīng)需觀測14d~30d。

A.13ONPG培育基A.13.1成分

鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)60.0mg0.01mol/L磷酸鈉緩

沖液(pH7.5)10.0mL1%蛋白胨水(pH7.5)30.0mLA.13.2制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL,用橡皮塞塞緊。A.13.3試驗方法自瓊脂斜面上挑取培育物1滿環(huán)接種于36℃1℃培育1h~3h和24h觀測結(jié)果。假如β半乳糖苷酶產(chǎn)生，那么于1h~3h變黃色，如無此酶那么24h不變色。

A.14半固體瓊脂A.14.1成分牛肉膏0.3g蛋白胨1.0g氯化鈉0.5g瓊脂0.35g~0.4g蒸餾水100mLpH7.40.2A.14.2制法按以上成安排好,煮沸溶解,調(diào)整pH。分裝小試管。121℃高壓滅菌15min。直立凝固備用。注:供動力觀測、菌種保存、H抗原位相變異試驗等用。

A.15丙二酸鈉培育基